CN115058441A - 利用细菌表面展示技术构建的重组菌株及其强化细胞固定化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用细菌表面展示技术构建的重组菌株及其强化细胞固定化的方法，属于生物技术和工程领域，主要涉及一种改造大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，利用细菌表面展示技术，将能够携带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸、天冬氨酸)锚定在E.coli表面，增加E.coli细胞膜表面携带的负电荷，并与带正电荷的载体进行静电吸附，从而提高重组E.coli在正电荷载体表面的固定化能力。

Description

利用细菌表面展示技术构建的重组菌株及其强化细胞固定化 的方法
技术领域
本发明属于生物技术和工程领域，具体涉及重组大肠杆菌菌株和细胞固定技术。
背景技术
固定化细胞是指固定在水不溶性载体上，且能在一定的空间范围进行生命活动的细胞。现代固定化细胞技术是在固定化酶技术的推动下发展起来的。该技术被定义为把游离细胞通过化学或物理手段固定在一定空间内，以减少外界不良环境对生物体的影响，使其尽可能保持旺盛的代谢活性，且能被重复和连续使用的一种新兴的生物技术。细胞固定化技术在生物技术领域已经显示出巨大的应用潜力。其固定化方法主要包括吸附、包埋、共价及交联四种。
目前，吸附主要运用在金属离子和污染物的去除方面。吸附采用的吸附剂多为无机载体材料，即由无机物单独或混合其它物质制成的材料，如多孔硅、生物炭、活性炭和氧化铝等。它们多为多孔结构，具有较强的吸附能力和静电引力，可将细胞吸附到载体表面上。此制备过程反应条件温和、操作简单，且载体可反复利用。
在各种吸附剂中，生物炭(biochar，又称生物质炭、生物质木炭等)是一种常见的材料，是由富含碳的生物质在无氧或缺氧条件下经热化学转化生成的一种高度芳香化的富碳固体物质。由于它含有大量的碳和植物营养物质，具有丰富的孔隙结构，较大的比表面积和丰富的表面含氧活性基团，因此被认为是一种多功能材料，受到许多研究者的关注。生物炭因其无毒、吸附性能和机械性能好等优点而被广泛使用。同时，制备生物炭的原料便宜、方便，制备方法简单。生物炭作为一种吸附剂，具有很大的优势，因此，它通常被选择为理想的载体用于固定化细胞。但常规的生物炭的吸附性能还远远不够，为进一步提高它们的吸附能力，生物炭常常被改性。据报道大多数未改性和改性的生物炭表面都带有负电荷。因此，已经证明生物炭是一种极好的阳离子污染物吸附剂，尤其是金属离子。大多数对生物炭的改性主要旨在增加负电荷，从而提高对阳离子的吸附能力。相反地，由于表面带负电荷的特性，阴离子吸附在生物炭上的吸附研究很少。
自上世纪八十年代第一个细菌表面展示体系建立以来，细菌细胞表面展示技术已逐渐发展成为蛋白质应用的新技术。细菌表面展示(Bacterial Surface Display)，是将目标蛋白表达转运并锚定在细菌表面的一种重要技术，主要通过DNA重组把外源功能蛋白的编码基因(Coding Gene)与宿主细菌的锚定域(Anchoring Domain)编码基因融合，融合蛋白可以在锚定基序引导下，在宿主细菌中表达、分泌并锚定在细胞膜上，实现细菌表面展示；蛋白可以维持原有的构象和生物学功能，具备生物诱导催化的活性。
冰核蛋白(icenucleationprotein，INP，又称冰晶核蛋白等)是细菌表面展示技术常用的载体蛋白之一，是一种存在于丁香假单胞菌、欧文氏菌、黄单胞菌等十余种革兰氏阴性菌中的分泌型表面蛋白质。纯水一般在较低的温度下才形成冰晶(-35℃)，但INP具有能使纯水在较高温度下(-2℃到-4℃)形成冰晶的特性。此外，INP表达稳定性高，在不同的宿主菌如大肠杆菌、假单胞菌、莫拉氏菌等都能稳定表达有活性的蛋白质。目前，己从不同的菌株中克隆得到了inaA、inaZ、inaF、inaK等十余种不同的INP编码基因。这些基因均定位于细菌染色体上，具有单一开放阅读框，序列相对保守，分别编码大小1200～250个氨基酸的INP。INP通常定位于细胞外膜上，由三个典型的结构域组成：N末端结构域、C末端结构域和中间重复结构单元。早期研究报道，将克隆的研究的INP编码基因转入大肠杆菌，所表达蛋白质能定位于细胞表面，这表明INP本身就含有分泌和锚定信号序列。INP作为细胞表面展示的载体蛋白，与其它载体蛋白相比较，具有以下优点：一、可在多种不同种属宿主细胞的生长稳定表达，不易被细胞内外的蛋白酶降解，其表达的融合蛋白在宿主细胞表面展示效率高，二、中间重复单元结构可以根据需要加以取舍而不影响融合蛋白的表达，可以携带较大分子量的乘蛋白，三、INP分子结构本身具有分泌、引导定位和固着细胞表面三重功能，无需辅助蛋白。
截至目前，还未有一种利用细菌表面展示技术对细胞进行固定化的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了利用细菌表面展示技术构建的重组菌株及其强化细胞固定化的方法。在本发明中，将来源于凤梨欧式杆菌(Erwiniaananas)的冰核基因INaA和带负电荷的氨基酸Asp和Glu的基因连接起来在E.coli胞内表达，可以成功将带负电荷的氨基酸展示并锚定于E.coli表面。将表面增加了负电荷的重组E.coli细胞与带正电或者经过表面修饰带正电的固定化材料结合，能够显著提高固定化细胞的效率。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种利用细菌表面展示技术强化细胞固定化的方法，包括：
1)构建重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs：制备含有冰核蛋白和带负电荷的氨基酸的融合蛋白的基因序列INaA-NCAs，将所述基因序列INaA-NCAs与质粒pRB1K连接并转化、筛选，得到质粒pRB1K-INaA-NCAs；将所述质粒pRB1K-INaA-NCAs转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli，得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs；
2)将所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs与表面带正电荷的改性生物炭混合，使所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs吸附于所述改性生物炭上，实现细胞固定化。
优选地，所述冰核蛋白INaA的基因来源于凤梨欧式杆菌(Erwinia ananas)。
优选地，所述带负电荷的氨基酸为天冬氨酸Asp或谷氨酸Glu中的至少一种。
优选地，所述基因序列INaA-NCAs如SEQ ID No.3所示。
优选地，用于扩增所述基因序列INaA-NCAs的引物分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。
优选地，将生物炭依次用盐酸和FeCl3溶液进行表面改性，得到所述表面带正电荷的改性生物炭。
优选地，所述生物炭为稻壳生物炭。
优选地，所述盐酸的浓度为0.5～2mol/L。
优选地，所述FeCl3溶液的浓度为1～3mol/L。
优选地，所述步骤2)中，将所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs接种于含有Kan抗生素的的LB液体培养基中，培养至OD600达到0.5～0.6时，加入诱导剂，培养过夜，收集菌体，用84～86％的生理食盐水配制成菌液，向菌液中加入所述改性生物炭，震荡使所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs吸附于所述改性生物炭上，实现细胞固定化。
优选地，所述菌体与所述改性生物炭的比例为：用84～86％的生理食盐水配制菌液并调整OD600为0.9～1.1，向其中加入所述改性生物炭并使其终浓度为1～3mg/L。
本发明通过上述方法，可以提高E.coli细胞表面携带负电荷的能力，提高重组E.coli细胞在改性的带正电荷的生物炭表面的固定化效率。
在本发明的一个具体的实施例中，具体操作步骤如下：
1.构建重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs
来源于凤梨欧氏杆菌(Erwinia ananas)的冰晶核蛋白基因INaA和带有负电荷氨基酸Asp和Glu多肽的基因经密码子优化后交由通用生物(合肥)公司合成。采用相应的引物INaA-F(如SEQ ID No.1所示)和INaA-R(如SEQ ID No.2所示)扩增出基因INaA和带负电荷融合蛋白的序列INaA-NCAs(如SEQ ID No.3所示)：
INaA-F:tgggtacctctcatcatctcgagatgaaggaagataaggtgc
INaA-R:agctcctcgcccttggacactgctctagaacattcatcttc
用琼脂糖凝胶回收试剂盒将克隆得到的INaA和负电荷氨基酸的融合基因INaA-NCAs片段回收，采用Xbal酶与Xhol酶分别双酶切INaA和负电荷氨基酸的融合基因INaA-NCAs片段，同时双酶切质粒pRB1K，将INaA融合基因INaA-NCAs片段和pRB1K质粒进行连接，连接产物转化大肠杆菌T1细胞，涂板，过夜培养，选取具有Kan抗性的阳性菌株扩大培养，采用质粒小提试剂盒得到阳性克隆质粒pRB1K-INaA-NCAs(质粒图谱如图1)。热激法将得到的质粒pRB1K-INaA-NCAs转化大肠杆菌感受态细胞E.coli，提取质粒测序，确认得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs。
2.将生物炭用FeCl3进行改性，使生物炭表面带正电荷
10g稻壳生物炭首先在500mL盐酸(1mol/L)中浸泡24h，然后将稻壳生物炭过滤、清洗并在烘箱中干燥。然后将浸泡在FeCl3溶液(固液比为1:10)中的稻壳生物炭放入超声波清洗机中，在30℃下分别进行1h。最后，将稻壳生物炭过滤并在烘箱中干燥并研磨。改性生物炭的粒径分布在80～250μm范围内。将生物炭用去离子水溶解，浓度为2mg/mL，并用Zeta电位仪测定并生物炭表面电性。
3.将生物炭与构建好的菌株进行吸附并测定吸附率
将构建好的菌株以1‰的接种量接种于含有Kan抗生素的的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养约1.5h，期间每隔半小时测一次600nm处的吸光值，待OD600达到0.5～0.6时，加入20％的阿拉伯糖2％，过夜培养。待第二天再次测定600nm处的吸光值，并收集菌体，用85％的生理食盐水调整OD至1，取10mL的菌液，并加入终浓度为2mg/L的生物炭，150rpm震荡24h后用滤纸过滤除去未吸附的细胞。滤液测定600nm处的吸光值，并用以下公式计算固定化率：
Figure BDA0003700194210000051
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种表面带负电荷的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌含有如SEQ ID No.3所示的基因序列INaA-NCAs。
优选地，所述重组大肠杆菌通过以下方法制备得到：制备含有冰核蛋白INaA、天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu的融合蛋白的基因序列INaA-NCAs，将所述基因序列INaA-NCAs与质粒pRB1K连接并转化、筛选，得到质粒pRB1K-INaA-NCAs；将所述质粒pRB1K-INaA-NCAs转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli，得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs，即为所述重组大肠杆菌。
其中，所述冰核蛋白INaA的基因来源于凤梨欧式杆菌(Erwinia ananas)；用于扩增所述基因序列INaA-NCAs的引物分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
上述的表面带负电荷的重组大肠杆菌，能够提高细胞与表面带正电荷的载体之间的静电力，可以显著提高固定化细胞的效率，可用于细胞固定及其他相应领域。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，％在表示浓度时，除有特别说明外，溶质为液体时％代表体积百分比，溶质为固体时％代表g/100mL。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明克隆了来源于凤梨欧式杆菌(Erwinia ananas)冰核基因INaA的N端和C端结构域为锚定序列，将带负电荷的氨基酸Asp和Glu的基因序列连接在锚定序列后面，构建了E.coli表面展示载体pRB1K-INaA-NCAs，带负电荷的氨基酸Asp和Glu组成的融合蛋白增加了E.coli表面负电荷。
2.本发明增加了E.coli表面负电荷，提高了细胞与表面带正电荷的载体之间的静电力，可以显著提高固定化细胞的效率。
附图说明
图1为本发明实施例中的pRB1K-INaA-45NCAs质粒构建图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
构建含有pRB1K-INaA-45NCAs载体，将带有45个负电荷氨基酸的融合蛋白锚定于E.coli表面的工程菌株，提高重组E.coli细胞在改性的生物炭表面的固定化效率。
本实施例之中，由于融合蛋白含有45个负电荷氨基酸，故引物INaA-F和INaA-R在本实施例之中分别记为INaA-45NCAs-F和INaA-45NCAs-R，融合基因INaA-NCAs在本实施例之中记为INaA-45NCAs，pRB1K-INaA-NCAs在本实施例之中记为pRB1K-INaA-45NCAs，重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs在本实施例之中记为E.coli pRB1K-INaA-45NCAs。
具体步骤如下：
1.构建重组菌株E.coli pRB1K-INaA-45NCAs
来源于凤梨欧氏杆菌(Erwinia ananas)的冰晶核蛋白基因INaA和带有负电荷氨基酸Asp和Glu多肽的基因经密码子优化后交由通用生物(合肥)公司合成。提取合成的含有融合蛋白INAa和负电荷氨基酸Asp和Glu多肽的质粒pET-28a(+)的DNA：保种液接种在LB液体培养基过夜培养，离心收集菌体，使用质粒DNA提取试剂盒提DNA模板备用；以如SEQ IDNo.1所示的引物INaA-45NCAs-F(Xhol酶切位点)和如SEQ ID No.2所示的引物INaA-45NCAs-R(Xbal酶切位点)从pET28(+)的DNA模板中克隆得到如SEQ ID No.3所示的INaA-45NCAs目的基因。PCR的条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。
(SEQ ID No.1)INaA-45NCAs-F:tgggtacctctcatcatctcgagatgaaggaagataaggtgc
(SEQ ID No.2)INaA-45NCAs-R:agctcctcgcccttggacactgctctagaacattcatcttc
(SEQ ID No.3)含有冰晶核蛋白INaA和负电荷氨基酸Asp和Glu的融合蛋白的基因序列(INaA-45NCAs)：
ATGAAGGAAGATAAGGTGCTGATTCTGCGCACCTGCGCCAATAATATGGCAGATCATGGTGGCATTATTTGGCCGCTGAGTGGCATTGTGGAATGCAAATATTGGAAACCGGTGAAAGGTTTTGAAAATGGTCTGACCGGTCTGATTTGGGGCAAAGGTAGCGATAGTCCGCTGAGCCTGCATGCCGATGCACGCCGCGTGGTTGCCGAAGTGGCAGCCGATGAATGTATTGCCATTGAAACCCACGGTTGGATTAAGTTTCCGCGTGCAGAAGTTCTGCATGTTGGCACCCAGAATAGCGCCATGCAGTTTATTCTGCATCATCGTGCAGATTATGTGGCATGTACCGAAATGCAGGCAGGTCCGGGTGGCCCGGATGTTACCAGTGAAGCCAAAGCCGGCAATCGCAGCCTGCCGGTTACCGATGATATTGATGCAACCATTGAAAGCGGCAGCACCCAGCCGACCCAGACCATTGAAATTGCCACCATTTTTCGTTGTTGGGATGGCAAACGCTATACCAATGTTGTGGCAAAAACCGGCAAAGGCGGTATTGAAGCAGATATGCCGTATCAGATGGATGAAGATAATAATATTGTGAACAAGCCGGAAGAAGATGAAGATGAAGAAGATGAGGATGAATGCAGCCGTGCCGATGAAGATGAGGAAGATGAAGACGAAGATGAAGATGAAGAGGATGAAGATGAAGATGAAGATGAAGAAGACGAAGACGAAGATGAGGACGAAGAAGATGAAGATGAATGT
使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将得到的INaA-45NCAs基因切胶回收，用Xhol内切酶和XbalI内切酶分别双酶切INaA-45NCAs基因和载体质粒pRB1K，用T4连接酶(美国NEB公司)16℃连接3h，得到重组质粒pRB1K-INaA-45NCAs；从超低温冰箱取出大肠杆菌T1感受态细胞，放置于冰上，加入0.5μL重组质粒pRB1K-INaA-45NCAs，再次冰浴30min，放置于42℃水浴锅中热激90s，再次冰浴2min，加入600μL无抗LB液体培养基，放置37℃振荡培养60min后4000r/min离心4min，弃400μL上清液，重新吹打混匀，吸取100μL涂布到LB平板(含kan抗性)上，过夜培养，挑取具有Kan抗性的阳性克隆子扩大培养，采用质粒小提试剂盒得到阳性克隆质粒。热激法将得到的阳性克隆质粒转化大肠杆菌感受态细胞E.coli，提取质粒后测序验证，确认得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-45NCAs。
2.将生物炭用FeCl3进行改性，并用Zeta仪测定生物炭表面电荷。
10g稻壳生物炭首先用超纯水洗净并用滤纸过滤烘干，然后用500mL盐酸(1mol/L)浸泡24h，再将盐酸处理过的稻壳生物炭过滤、清洗并在烘箱中干燥。最后在30℃下将烘干后的生物炭浸泡在2mol/L FeCl3溶液(固液比为1:10)中，放入超声波清洗机中超声处理1h。最后，将超声完的稻壳生物炭过滤并在烘箱中干燥并研磨，得到改性生物炭。改性生物炭的粒径分布在80～250μm范围内。将改性生物炭用去离子水溶解，浓度2mg/mL，并用Zeta电位仪测定改性生物炭表面电性，结果显示改性生物炭表面带正电荷。
3.将生物炭与构建好的菌株进行吸附并测定吸附率。
将构建好的E.coli pRB1K-INaA-45NCAs菌株和原始对照菌株E.coli pRB11K分别以1‰的接种量接种于含有Kan抗生素的的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养约1.5h，期间每隔半小时测一次600nm处的吸光值，待OD600达到0.5～0.6时，加入20％的阿拉伯糖使其终浓度为2％，过夜培养。待第二天再次测定600nm处的吸光值，并且收集菌体，用85％的生理食盐水调整OD至1，取10mL的菌液，并加入终浓度为2mg/L的改性生物炭，150rpm震荡24h后用滤纸过滤除去未吸附的细胞。滤液测定600nm处的吸光值，并用以下公式计算固定化率。
Figure BDA0003700194210000091
注：OD0为吸附前用生理食盐水调整OD至1；OD1为滤纸过滤除去未吸附的细胞，滤液测定600nm处的吸光值。
实验结果表明，E.coli pRB1K-INaA-45NCAs重组菌株固定化细胞效率为57.1％，原始对照菌株E.coli pRB11K固定化效率为25.6％，实验组相对于对照组固定化效率提高55.16％。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> 利用细菌表面展示技术构建的重组菌株及其强化细胞固定化的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgggtacctc tcatcatctc gagatgaagg aagataaggt gc 42
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctcctcgc ccttggacac tgctctagaa cattcatctt c 41
<210> 3
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaggaag ataaggtgct gattctgcgc acctgcgcca ataatatggc agatcatggt 60
ggcattattt ggccgctgag tggcattgtg gaatgcaaat attggaaacc ggtgaaaggt 120
tttgaaaatg gtctgaccgg tctgatttgg ggcaaaggta gcgatagtcc gctgagcctg 180
catgccgatg cacgccgcgt ggttgccgaa gtggcagccg atgaatgtat tgccattgaa 240
acccacggtt ggattaagtt tccgcgtgca gaagttctgc atgttggcac ccagaatagc 300
gccatgcagt ttattctgca tcatcgtgca gattatgtgg catgtaccga aatgcaggca 360
ggtccgggtg gcccggatgt taccagtgaa gccaaagccg gcaatcgcag cctgccggtt 420
accgatgata ttgatgcaac cattgaaagc ggcagcaccc agccgaccca gaccattgaa 480
attgccacca tttttcgttg ttgggatggc aaacgctata ccaatgttgt ggcaaaaacc 540
ggcaaaggcg gtattgaagc agatatgccg tatcagatgg atgaagataa taatattgtg 600
aacaagccgg aagaagatga agatgaagaa gatgaggatg aatgcagccg tgccgatgaa 660
gatgaggaag atgaagacga agatgaagat gaagaggatg aagatgaaga tgaagatgaa 720
gaagacgaag acgaagatga ggacgaagaa gatgaagatg aatgt 765

Claims (10)

1.一种利用细菌表面展示技术强化细胞固定化的方法，其特征在于：包括：
1)构建重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs：制备含有冰核蛋白和带负电荷的氨基酸的融合蛋白的基因序列INaA-NCAs，将所述基因序列INaA-NCAs与质粒pRB1K连接并转化、筛选，得到质粒pRB1K-INaA-NCAs；将所述质粒pRB1K-INaA-NCAs转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli，得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs；
2)将所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs与表面带正电荷的改性生物炭混合，使所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs吸附于所述改性生物炭上，实现细胞固定化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述冰核蛋白INaA的基因来源于凤梨欧式杆菌(Erwinia ananas)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述带负电荷的氨基酸为天冬氨酸Asp或谷氨酸Glu中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述基因序列INaA-NCAs如SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用于扩增所述基因序列INaA-NCAs的引物分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将生物炭依次用盐酸和FeCl3溶液进行表面改性，得到所述表面带正电荷的改性生物炭。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，将所述重组菌株E.colipRB1K-INaA-NCAs接种于含有Kan抗生素的的LB液体培养基中，培养至OD600达到0.5～0.6时，加入诱导剂，培养过夜，收集菌体，用84～86％的生理食盐水配制成菌液，向菌液中加入所述改性生物炭，震荡使所述重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs吸附于所述改性生物炭上，实现细胞固定化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述菌体与所述改性生物炭的比例为：用84～86％的生理食盐水配制菌液并调整OD600为0.9～1.1，向其中加入所述改性生物炭并使其终浓度为1～3mg/L。
9.一种表面带负电荷的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有如SEQ IDNo.3所示的基因序列INaA-NCAs。
10.根据权利要求9所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌通过以下方法制备得到：制备含有冰核蛋白INaA、天冬氨酸Asp和谷氨酸Glu的融合蛋白的所述基因序列INaA-NCAs，将所述基因序列INaA-NCAs与质粒pRB1K连接并转化、筛选，得到质粒pRB1K-INaA-NCAs；将所述质粒pRB1K-INaA-NCAs转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli，得到重组菌株E.coli pRB1K-INaA-NCAs，即为所述重组大肠杆菌。
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