CN115054730A - 一种羊膜新材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种羊膜新材料，所述羊膜新材料由动物心包膜以及人体羊膜层叠结合形成，所述结合方式包括：依次通过凝胶粘合和化学交联的方式结合；所述化学交联包括：通过2‑(7‑氮杂苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐交联结合；所述羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力为40MPa～50MPa。本发明利用涉及一种用于眼科的人工组织再生修复的羊膜新材料及其制备方法，在物理(凝胶互穿网络形成的物理缠结)、化学结合的双重作用下，不仅叠层结构黏合牢固可靠，不会发生分离更加便于手术操作，更使制得的成品羊膜新材料的力学强度比之传统的羊膜材料大大提升，不易撕裂，不易卷曲。

Description

一种羊膜新材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域技术领域，具体涉及一种羊膜新材料及其制备方法。
背景技术
人体羊膜是人体胎盘的最内层，厚约0.01-0.2mm，含有上皮细胞，无血管、神经及淋巴，组织主要成份为胶原蛋白。人体羊膜作为人源生物医用材料，由于属于同种移植，具有天然的低免疫原性。另外，人体羊膜中含有多种生长因子，可以促进上皮细胞、内皮细胞的黏附及迁移，因此，其同时具有促进上皮组织生成以及再表皮化的功能，但是由于羊膜材料厚度较薄，其力学强度不佳，其在作为用于眼科的人工植入再生修复生物医用材料使用过程中，存在容易撕裂、容易卷曲、不便手术操作的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种羊膜新材料及其制备方法，其解决了现有的单纯羊膜材料力学强度不佳，在作为用于眼科的人工植入再生修复生物医用材料使用过程中，存在容易撕裂、容易卷曲、不便手术操作的问题的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供的方案是：一种羊膜新材料，所述羊膜新材料由动物心包膜以及人体羊膜层叠结合形成，所述结合方式包括：依次通过凝胶粘合和化学交联的方式结合；
所述化学交联包括：通过2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐交联结合；
所述羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力为40MPa～50MPa。
在一些实施例中，所述凝胶为质量浓度5％-30％人体羊膜粉末水溶液，所述人体羊膜粉末的粒径≤1微米。
在一些实施例中，所述凝胶为质量浓度5％-30％明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50gBloom～100gBloom。
进一步地，所述动物心包膜为猪心包膜或牛心包膜。
针对本申请实施例提供的羊膜新材料，进一步地，本申请实施例还提出了该种羊膜新材料的一种制备方法，具体地，所述羊膜新材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、清洗人体羊膜及动物心包膜，并将人体羊膜及动物心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，所述片材面积为1cm*1cm～10cm*10cm；
S2、配制凝胶，所述凝胶为人体羊膜粉末水溶液或明胶水溶液，所述人体羊膜粉末的粒径≤1微米，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将人体羊膜片材及动物心包膜片材层叠后于凝胶中浸泡1h～24h，使两者粘合；
S4、将层叠、粘合的羊膜片材与动物心包膜片材叠放并烘干，使两者紧密贴合形成叠层材料，所述烘干条件为：20℃～37℃烘干1h～24h；
S5、将烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中交联，交联完成即制得所述羊膜新材料，所述羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力为40MPa～50MPa。
进一步地，所述动物心包膜为猪心包膜或牛心包膜。
进一步地，所述人体羊膜粉末水溶液的质量浓度为5％-30％，所述明胶水溶液的质量浓度为5％-30％。
进一步地，制得的所述羊膜新材料低温储存。
进一步地，所述2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐浓度为1mM～100mM，所述交联时间为1h～24h，温度为 4℃～37℃。
本申请进一步的提供一种上述羊膜新材料在眼科中作为人工组织再生修复新材料的应用。
本发明利用涉及一种用于眼科的人工组织再生修复的羊膜新材料及其制备方法，通过特殊的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’- 四甲基脲六氟磷酸盐交联体系，使得人体羊膜、动物心包膜、凝胶三者之间结合稳定，在物理(凝胶互穿网络形成的物理缠结)、化学结合的双重作用下，不仅叠层结构黏合牢固可靠，不会发生分离更加便于手术操作，更使制得的成品羊膜新材料的力学强度比之传统的羊膜材料大大提升，不易撕裂，不易卷曲。
附图说明
图1为本发明实施例1-9中羊膜新材料的制备流程图。
图2为本发明实施例1-9中羊膜新材料的原理示意图。
图3A为本发明实施例9中人体羊膜的实物图。
图3B为本发明实施例9中猪心包膜的实物图。
图3C为本发明实施例9中人体羊膜与猪心包膜进行叠放的实物图。
图3D为本发明实施例9中人体羊膜与猪心包膜绷板固定基于凝胶结合之后的实物图。
图4为本发明实施例及对比例中材料的力学强度测试-最大单轴拉伸断裂应力结果图。
图5为本发明实施例及对比例中材料的免疫原性测试结果图。
图6为本发明实施例及对比例中材料的促进表皮化性能测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施。下述公开了多种不同的实施所述的主题技术方案的实施方式或实施例。为简化公开内容，下面描述了各特征存在的一个或多个排列的具体实施例，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为1cm*1cm；
S2、配制质量浓度为5％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将1cm*1cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干1小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液中进行化学交联，本实施例中2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液的摩尔浓度为1mM，时间为1小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例2
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液中进行化学交联，本实施例中2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液的摩尔浓度为10mM，时间为2小时，温度为25℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例3
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为10cm*10cm；
S2、配制质量浓度为30％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将10cm*10cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液 1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 20℃恒温箱烘干24小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液中进行化学交联，本实施例中2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐溶液的摩尔浓度为100mM，时间为24小时，温度为37℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例4
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为10cm*10cm；
S2、配制质量浓度为5％的人体羊膜粉末水溶液，且人体羊膜粉末的粒径≤1微米；人体羊膜粉末制备工艺为：将人体羊膜材料投入组织粉碎机打碎15分钟后，采用质量浓度0.1％胃蛋白酶进行酶解24小时，经冷冻干燥后，通过不锈钢标准筛网，获得的人体羊膜粉末粒径≤1微米；
S3、将10cm*10cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的人体羊膜粉末水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液摩尔浓度为1mM，时间为2小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例5
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为10cm*10cm；
S2、配制质量浓度为15％的人体羊膜粉末水溶液，且人体羊膜粉末的粒径≤1微米；人体羊膜粉末制备工艺为：将人体羊膜材料投入组织粉碎机打碎15分钟后，采用质量浓度0.1％胃蛋白酶进行酶解24小时，经冷冻干燥后，通过不锈钢标准筛网，获得的人体羊膜粉末粒径小于1微米；
S3、将10cm*10cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的人体羊膜粉末水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液中进行化学交联，本实施例中苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液的摩尔浓度为10mM，时间为2小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例6
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为10cm*10cm；
S2、配制质量浓度为30％的人体羊膜粉末水溶液，且人体羊膜粉末的粒径≤1微米；人体羊膜粉末制备工艺为：将人体羊膜材料投入组织粉碎机打碎15分钟后，采用质量浓度0.1％胃蛋白酶进行酶解24小时，经冷冻干燥后，通过不锈钢标准筛网，获得的人体羊膜粉末粒径≤1微米；
S3、将10cm*10cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的人体羊膜粉末水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液中进行化学交联，本实施例中苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液的摩尔浓度为100mM，时间为2小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例7
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液中进行交联，本实施例中，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液的摩尔浓度均为1mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例8
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液中进行交联，本实施例中，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液的摩尔浓度均为10mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
实施例9
一种应用于眼科，作为人工组织再生修复的羊膜新材料的制备方法，其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液中进行交联，本实施例中，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2 小时，温度为4℃，交联形成的材料即为所述羊膜新材料；
S6、将S5制得的羊膜新材料取出低温下储存备用。
对比例1
本对比例为人体羊膜，将人体羊膜清洗干净后裁剪为5cm*5cm的片材。
对比例2
本对比例为猪心包膜，将猪心包膜清洗干净后裁剪为10cm*10cm的片材。
对比例3
其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4制得的材料取出低温下储存备用。
对比例4
其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为10cm*10cm；
S2、配制质量浓度为15％的人体羊膜粉末水溶液，且人体羊膜粉末的粒径≤1微米；人体羊膜粉末制备工艺为：将人体羊膜材料投入组织粉碎机打碎15分钟后，采用质量浓度0.1％胃蛋白酶进行酶解24小时，经冷冻干燥后，通过不锈钢标准筛网，获得的人体羊膜粉末粒径≤1微米；
S3、将10cm*10cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的人体羊膜粉末水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4制得的材料取出低温下储存备用。
对比例5
其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、将人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于37℃恒温箱烘干10 小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S3、将S2中烘干后的叠层材料浸泡于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 (EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液中进行交联，本实施例中EDC与NHS的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2小时，温度为4℃；
S4、将S3制得的材料取出低温下储存备用。
对比例6
其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、将人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于37℃恒温箱烘干10 小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S3、将S2中烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液中进行交联，本实施例中，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2 小时，温度为4℃；
S4、将S3制得的材料取出低温下储存备用。
对比例7
本对比例并未采取将人体羊膜及动物心包膜以完整片材形式层叠的方案，而是：
先将清洗干净的猪心包膜干燥后研磨成粒径为1.5mm的粉末，然后将粉末溶解在pH 为2.5柠檬酸中酸解，酸解后，使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)/N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液对其进行交联成型，两者的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2小时，温度为4℃。
对比例8
本对比例并未采取将人体羊膜及动物心包膜以完整片材形式层叠的方案，而是：
先将清洗干净的牛心包膜干燥后研磨成粒径为0.5mm的粉末，然后将粉末溶解在pH 为4的盐酸和醋酸质量比为1:1的混合酸液中酸解，酸解后，使用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐混合溶液对其进行交联成型，两者的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为 2小时，温度为4℃。
对比例9
其步骤如下：
S1、准备好清洗干净的人体羊膜及猪心包膜，将人体羊膜及猪心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，本实施例中，片材面积为5cm*5cm；
S2、配制质量浓度为15％的明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将5cm*5cm的人体羊膜片材及猪心包膜片材层叠后浸泡于S2中的明胶水溶液1小时，使人体羊膜片材与猪心包膜片材粘合；
S4、将S3中浸泡后粘合的人体羊膜片材与猪心包膜片材叠放并采用绷板固定，置于 37℃恒温箱烘干10小时，使得两种材料紧密贴合形成叠层材料；
S5、将S4中烘干后的叠层材料浸泡于1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐 (EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液对其进行交联成型，两者的摩尔浓度均为100mM，两者添加比例为1:1，交联时间为2小时，温度为4℃；
S6、将S5制得的材料取出低温下储存备用。
将实施例以及对比例的产物进行以下测验：
1、片材黏合效果测试
本测试包括以下材料：实施例1至9为同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案；对比例3至4为单独凝胶黏合方案；对比例5至6为单独化学交联黏合方案；对比例9为凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案。对比例1-2、7-8均未有层叠粘合，故不参与测试。
测试方法具体为：将制备的材料于37℃下浸泡于生理盐水溶液并置于摇床上，摇床转速为200RPM，观察并记录材料分离的时间点。实验结果见表1。
表1
Figure RE-GDA0003775988190000111
Figure RE-GDA0003775988190000121
从表1结果可知，实施例1至9，即同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案，片材分离时间大于60天，具有优异的黏合效果；对比例3至4，即单独凝胶黏合方案，片材分离时间3-7天；对比例5 至6，即单独化学交联黏合方案，立刻分离，无法黏合；对比例9，即凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案，片材分离时间为14天。很明显，物理粘合结合化学交联的方式其获得的材料的片材黏合效果更佳，尤其是本发明所述2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’- 四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐黏合效果优于 EDC/NHS。黏合效果优异，则片材不易分层，使得材料具备更优异的力学性能的可能性，同时方便手术操作。
2：力学强度测试-最大单轴拉伸断裂应力
本测试包括以下材料：实施例1至9为同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案；对比例1为人体羊膜；对比例 2为猪心包膜；对比例3至4为单独凝胶黏合方案；对比例7-8为人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型；对比例9为凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案。其中，由于对比例5-6由于无法有效黏合，因此没有对其进行力学测试。
测试方法具体为：利用Instron 5967万能试验机对材料进行力学性能测试。将样品裁成2.5*1cm2的矩形，每组n＝6，测试前用PBS在37℃浸泡2小时。用测厚仪随机在3 个位置测量厚度，取厚度平均值进行应力计算。之后被安装在万能试验机的夹具上，并以 0.1N的力预加载，以恒定速度12mm/min进行单轴拉伸直至断裂失效。同时，记录应力- 应变曲线，并计算最大单轴拉伸断裂应力。结果见图4。
实验结果表明(图4)，实施例1至9，同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案，都具有高的最大单轴拉伸断裂应力，高于对比例1、2、3、4、7、8、9。且实施例1-9的材料最大单轴拉伸断裂应力相比于对比例材料7-8，即人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型方案，提高了10倍以上；相比于对比例9的材料，即凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案，提高了1倍以上。即使和单独使用动物心包膜的对比例2相比，由于本申请独特的双重粘合交联方式，大大提高了最大单轴拉伸断裂应力，说明本申请的产品具备优异的力学性能。
并且在实施例1-9中，采用混合2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联的方案所得羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力也要优于单独使用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联的方案，故本发明保护的一种羊膜新材料，其力学强度优秀，在作为用于眼科的人工植入再生修复生物医用材料使用过程中，不容易撕裂、不容易卷曲、十分利于手术操作。
3：免疫原性测试
本测试包括以下材料：实施例1至9为同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案；对比例1为人体羊膜；对比例 2为猪心包膜；对比例3至4为单独凝胶黏合方案；对比例7-8为人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型；对比例9为凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案。其中，由于对比例5-6由于无法有效黏合，因此没有对其免疫原性测试。
测试方法具体为：材料的免疫原性通过免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)及免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)结合试验进行表征。收集健康人群血液，采用抗人源IgM/IgG抗体对材料进行孵育和荧光标记，通过特异性结合荧光强度表征材料免疫原性。
实验结果表明(图5)，实施例1至9，同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案，与对比例1人体羊膜相似，都具有低的人源IgM/IgG特异性结合荧光强度，即低的免疫原性；对比例2为猪心包膜具有较高的免疫原性。对比例3、4、9材料在免疫原性方面与实施例1-9接近。对比例7-8材料，人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型的方法，由于表面同时含有羊膜和动物心包膜成分，其免疫原性高于实施例1-9。
故本申请所要保护的一种羊膜新材料，在具备优异的黏合效果和力学性能的基础上，还具备优异的低免疫原性，能和单独的人体羊膜相近，在作为用于眼科的人工植入再生修复生物医用材料使用过程中，不会引发免疫应答，从而延长使用寿命。
4：促进表皮化性能测试
本测试包括以下材料：实施例1至9为同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案；对比例1为人体羊膜；对比例 2为猪心包膜；对比例3至4为单独凝胶黏合方案；对比例7-8为人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型；对比例9为凝胶与EDC/NHS化学交联结合的方案。其中，由于对比例5-6由于无法有效黏合，因此没有对其促进表皮化性能测试。
测试方法具体为：将样品放进48孔板中，将不锈钢环放在样品顶部，防止样品漂浮。向每孔中加入500μL表皮细胞悬液(40,000个/mL)。在细胞培养箱中孵化1天和3天。接种48小时后，将预期培养3天的样品上清液替换为完全培养基。培养完毕后，用PBS 冲洗样品3次，每次5分钟。随后加入200μL含有10％CCK-8试剂的完全培养基，在细胞培养箱中孵化1小时。随后检测培养基在450nm处的吸光度。吸光度高表明存活细胞数量多。结果见图6。
实验结果表明(图6)，实施例1至9，同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案，与对比例1人体羊膜相似，都具有高的表皮细胞增值率，即高的促进表皮化性能；对比例2为猪心包膜具有较低的促进表皮化性能。对比例3、4、9材料在促进表皮化性能与实施例1-9接近。对比例7-8材料，人体羊膜及动物心包膜打碎后变为粉末状浆料后用化学交联成型的方法，由于表面同时含有羊膜和动物心包膜成分，其促进表皮化性能低于实施例1-9。
综上所述，本发明制得的羊膜新材料中，选用同时用凝胶物理互穿网络结合与2-(7- 氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合的层叠片材的方案最优，新材料兼具人体羊膜的低免疫原性、良好的促进表皮化性能以及动物心包膜良好的力学强度，同时本发明将两种生物膜片材料在保持原有组成及结构不变的情况下，采用凝胶将两个生物膜片材料直接黏合，可以最大程度保持原材料的力学强度(最大拉伸断裂应力)，采用人体羊膜粉末或明胶的凝胶实现人体羊膜与动物心包膜之间的粘合，这种粘合作用既包含了凝胶物理互穿网络结合作用，又具有基于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的共价结合作用，黏合牢固，更取得了意想不到的指数级增加了叠层结构的力学强度的效果。特别是采用粒径≤1微米的人体羊膜粉末水溶液作为凝胶，既兼顾了生物相容性，又保留了优异的粘合效果。
本申请在物理粘合的基础上，采用2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐溶液化学交联剂的交联体系，可以实现人体羊膜、动物心包膜、体羊膜粉末或明胶三者之间羧基与氨基的缩合化学反应，使得三者之间形成稳定的酰胺化学键的结合，并且在交联之前采用恒温箱中适度烘干的方法，在挥发一定水分的情况下，可以实现人体羊膜与动物心包膜之间的紧密贴合，更加利于提高两种膜片材料的基于物理凝胶或化学交联剂之间的黏合效果。故本申请公开的一种羊膜新材料，在兼具低免疫原性、良好促进表皮化性能及良好力学强度的情况下，作为人工组织再生修复新材料在眼科等治疗领域具有广阔的应用前景。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种羊膜新材料，其特征在于，所述羊膜新材料由动物心包膜以及人体羊膜层叠结合形成，所述结合方式包括：依次通过凝胶粘合和化学交联的方式结合；
所述化学交联包括：通过2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐交联结合；
所述羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力为40MPa～50MPa。
2.如权利要求1所述的一种羊膜新材料，其特征在于，所述凝胶为质量浓度5％-30％人体羊膜粉末水溶液，所述人体羊膜粉末的粒径≤1微米。
3.如权利要求1所述的一种羊膜新材料，其特征在于，所述凝胶为质量浓度5％-30％明胶水溶液，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom。
4.如权利要求1所述的一种羊膜新材料，其特征在于，所述动物心包膜为猪心包膜或牛心包膜。
5.一种羊膜新材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、清洗人体羊膜及动物心包膜，并将人体羊膜及动物心包膜裁剪成为相同面积大小的片材，所述片材面积为1cm*1cm～10cm*10cm；
S2、配制凝胶，所述凝胶为人体羊膜粉末水溶液或明胶水溶液，所述人体羊膜粉末的粒径≤1微米，所述明胶水溶液的胶强度为50g Bloom～100g Bloom；
S3、将人体羊膜片材及动物心包膜片材层叠后于凝胶中浸泡1h～24h，使两者粘合；
S4、将层叠、粘合的羊膜片材与动物心包膜片材叠放并烘干，使两者紧密贴合形成叠层材料，所述烘干条件为：20℃～37℃烘干1h～24h；
S5、将烘干后的叠层材料浸泡于2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐中交联，交联完成即制得所述羊膜新材料，所述羊膜新材料的最大单轴拉伸断裂应力为40MPa～50MPa。
6.如权利要求5所述的一种羊膜新材料的制备方法，其特征在于，所述动物心包膜为猪心包膜或牛心包膜。
7.如权利要求5所述的一种羊膜新材料的制备方法，其特征在于，所述人体羊膜粉末水溶液的质量浓度为5％-30％，所述明胶水溶液的质量浓度为5％-30％。
8.如权利要求5～7任一所述的一种羊膜新材料的制备方法，其特征在于，制得的所述羊膜新材料低温储存。
9.如权利要求5～7任一所述的一种羊膜新材料的制备方法，其特征在于，所述2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐和/或苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐溶液的摩尔浓度为1mM～100mM，所述交联时间为1h～24h，温度为4℃～37℃。
10.如权利要求1-4任一所述的一种羊膜新材料在眼科中作为人工组织再生修复新材料的应用。
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