CN115053921B - 一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用，涉及生物农药领域。本发明提供一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用，所述植物源复配杀菌剂的有效成分包括黄连提取物和黄柏提取物。本发明采用水提法和醇提法对16种植物源物质进行提取，通过抑菌圈试验，筛选出对姜瘟病菌有较强抑菌活性的4种中药，通过复配实验表明黄连和黄柏的复配组合具有明显的增效作用，并以该复配组合为基础，添加药学辅料，得到具有明显姜瘟病抑菌效果的植物源复配杀菌剂，盆栽试验表明，黄连黄柏复配剂对姜瘟病的防治效果最高可达60.25％。
Description
技术领域
本发明涉及生物农药领域，特别是涉及一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用。
背景技术
姜瘟病是生姜产区普遍发生且危害最为严重的病害，传统研究认为其病原物为青枯假单孢杆菌(又名：青枯劳尔式菌或青枯雷尔式菌)(Pseudomonas solanacearumSmith)，通过生姜植株地下部根茎及根部自然空隙或伤口侵入，随后进入维管束组织大量增殖，最终造成植株死亡。姜瘟病通过种姜、肥、水、土壤等途径传播侵染植株，一旦发生，病情发展迅速，一般减产20％～30％，重者达70％～80％，甚至全田绝收，姜瘟病发生田3～5年内不能栽培生姜，造成农民用地成本增加，经济损失严重，成为生姜产业健康发展的制约瓶颈。
田间姜瘟病原菌株来源多样，对药剂的敏感性和抗性水平不同，加之目前尚无针对姜瘟病的有效杀菌剂，田间对该病害的防治困难较大，一旦发生病害迅速蔓延，造成植株大面积枯死、腐烂，将严重影响生姜的产量和效益。在《First Report ofRhizome RotCausedby Pectobacterium brasiliense on Ginger in China》一文中全球首次报道了巴西果胶杆菌能够引起生姜腐烂，揭示了近年来发生大面积姜瘟病的一种新病原，但目前还尚未有能够有效控制该新病原的生物药剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的植物源复配杀菌剂能够有效防治姜瘟病。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用，所述植物源复配杀菌剂的有效成分包括黄连提取物和黄柏提取物。
进一步地，所述生姜姜瘟病的病原菌为巴西果胶杆菌。
进一步地，所述黄连提取物为黄连醇提取物；所述黄柏提取物为黄柏醇提取物。
进一步地，所述黄连醇提取物是利用75％乙醇对黄连进行提取，浓缩后得到；所述黄柏醇提取物是利用75％乙醇对黄柏进行提取，浓缩后得到。
进一步地，所述黄连醇提取物和黄柏醇提取物的质量比为2:1。
进一步地，所述植物源复配杀菌剂还包括药学上可接受的辅料。
进一步地，所述辅料包括分散剂和乳化剂。
进一步地，所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠，所述乳化剂为农乳500。
本发明还提供一种防治生姜姜瘟病的方法，所述方法包括利用上述的植物源复配杀菌剂对生姜植株进行灌根处理。
进一步地，所述植物源复配杀菌剂的灌根量为900mg/株。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用水提法和醇提法对16种植物源物质进行提取，通过抑菌圈试验，筛选出对姜瘟病菌有较强抑菌活性的4种中药，分别为黄连、黄芩、黄柏、大黄。通过对4种药剂进行毒力测定，抑制毒力从高到低依次为：黄连提取物>黄柏提取物>黄芩提取物>大黄提取物，黄芩、黄柏、黄连、大黄提取物对姜瘟病菌的抑制中质量浓度(EC50)分别为10.83、6.02、3.89、14.10mg/mL。选取抑菌效果最好的黄连分别和黄柏、黄芩、大黄复配，通过测定复配剂的FIC，结果表明黄连和黄柏复配组合具有明显的增效作用。进一步研究黄连和黄柏的最佳配比，结果显示黄连和黄柏的提取物的质量比为2：1为中药提取物复配剂的最佳配比。并以该提取物复配剂为基础，添加药学辅料，得到具有明显姜瘟病抑菌效果的植物源复配杀菌剂。盆栽试验表明，当提取物复配剂质量浓度为3000mg/L时，黄连黄柏复配剂对姜瘟病的防治效果为60.25％，优于浓度1500mg/L的46％氢氧化铜WG防效，能有效提高提取物的抑菌活性，起到增效作用。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中，抑菌实验所用的姜瘟病病原菌均为巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)，参见论文《First Report ofRhizome Rot CausedbyPectobacterium brasiliense on Ginger in China》。
实施例1不同植物源提取物的抑菌活性
1、试验方法
1.1药剂的准备
供试中药分别用75％乙醇和水提取。
(1)醇提取：从北京同仁堂药店选购16种中药，每药称取50克打成细粉，过0.30mm筛，放入200mL洁净的三角瓶中，加入100mL 75％乙醇，浸泡2h，60℃、800W超声震荡提取1.5h，离心机离心，抽滤，将滤液浓缩至膏状后，得到醇提取物；再将醇提取物倒入50mL容量瓶中用无菌水定容，得到质量浓度为1.0g/mL的醇提取物。
(2)水提取：原药50g(不打粉)，加入1000mL蒸馏水浸泡2h，砂锅熬煮1h，用纱布过滤，得第一次提取液；再加入1000mL蒸馏水砂锅熬煮1h，用纱布过滤，得第二次提取液；将两次药液混合(200mL)，放入旋转蒸发仪中(80℃、160r/min)，浓缩提取液达10mL时，取出放入容量瓶，用无菌水定容至50mL，得到质量浓度为1.0g/mL的水提取物。
1.2细菌活化及菌落计数：取灭菌试管，加入2mL LB培养基，挑取单菌落放入培养基，放摇床(27℃)培养10h。选取1mL活化的病原菌的菌悬液加入20mL LB三角瓶，培养2h后测OD值，当OD600＝0.6时结束培养，采用试管10倍浓度递减稀释法稀释菌悬液，依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。从10-5～10-7对应浓度的试管中各取20μL分别涂布LB琼脂培养基上，放入生化培养箱27℃培养16～18h，计算菌落数。根据稀释浓度推算菌悬液的活菌数。
1.3抑菌效果测定：采用牛津杯抑菌圈法进行抑菌测定。将灭菌后的LB培养基趁热倒入培养皿
凝固冷却后加入50μL浓度为1×106cfu/mL的病原菌。取牛津杯插入培养基中，等距放置4个，每个牛津杯中加入200μL中药提取物(已过膜除菌)，培养皿封口后置于27℃培养箱避光培养。每种中药提取物设3个重复，另设无菌水作为空白对照(CK)。培养16h后用游标卡尺测定抑菌圈直径。
2、试验结果：16种供试药剂中具有抑菌效果的分别为黄连、黄柏、黄芩和大黄，其中黄连抑菌效果最好，其水提取物和醇提取物的抑菌直径均在20mm以上；黄芩、黄柏和大黄的抑菌效果相当，水提取物抑菌直径为16.3～17.8mm，醇提取物抑菌直径为18.2～20.3mm。4种中药的醇提取物抑菌圈直径均大于水提取物，表明醇提取物的抑菌效果更好。
表1不同植物源提取物对姜瘟病菌的抑制效果
实施例2不同浓度乙醇提取下4种植物源提取物的最低抑菌浓度(MIC)测定
1、试验方法
1.1不同中药提取物的制备：供试中药为黄连、黄芩、黄柏、大黄。按实施例1中的提取方法，分别以体积分数50％、75％、95％的乙醇进行提取，按药粉与溶剂为1：2的质量比例提取，浓缩，制备得到中药提取物，之后通过稀释使各中药提取物浓度为1.0g/mL。
1.2最低抑菌浓度(MIC)试验：将各中药提取物分别与45℃的LB培养基混匀，使提取物最终质量浓度为200、100、50、25、12.5、6.25mg/mL。将混有提取物的培养基倒入培养皿中，凝固后加入浓度为1×104cfu/mL的病原菌悬浮液50μL，涂匀后封口，放置27℃培养箱中培养，以无菌水处理作为空白对照。培养16h后观察菌落数，菌落生长被完全抑制的最低提取液浓度为该样品对受试菌的MIC值。
2、试验结果
表2结果显示，4种中药提取物均对姜瘟病菌有一定的抑制作用，随浓度的升高抑菌效果增强。不同浓度乙醇提取对黄连抑菌效果无明显影响，75％和95％醇提取黄芩、黄柏和大黄效果好于50％乙醇提取，75％乙醇提取和95％乙醇提取无明显差异，因此确定采用75％乙醇提取为4种中药的最佳提取方式。在75％乙醇提取下，黄连、黄柏、黄芩、大黄的MIC依次为12.5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL。
表2在不同提取方式下4种植物源提取物对姜瘟病菌MIC的测定结果
注：“+”表示培养基上有肉眼可见菌落生长，“—”表示培养基上无肉眼可见菌落生长，“*”代表所对应的质量浓度即为该提取物的MIC。
实施例34种植物(黄连、黄芩、黄柏、大黄)醇提取物对姜瘟病的毒力测定
1、试验方法：将4种植物(黄连、黄芩、黄柏、大黄)醇提取物(按实施例1的醇提取方法，用75％乙醇提取得到的未稀释醇提取物)分别与45℃左右的LB培养基混匀，使提取物最终质量浓度分别为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0mg/mL。将混有醇提取物的培养基倒入培养皿中，凝固后加入浓度为1×104cfu/mL的病原菌悬浮液50μL，涂匀后封口，放置27℃培养箱中培养，以无菌水处理作为空白对照。培养16h后统计菌落数，用SPSS19计算毒力回归方程Y＝a+bx，抑菌中浓度(EC50)、相关系数R2和95％置信区间。
2、试验结果：通过回归分析，黄芩、黄柏、黄连、大黄醇提取物对姜瘟病菌的抑制中质量浓度(EC50)分别为10.83、6.02、3.89、14.10mg/mL，因此得出4种药剂对姜瘟病菌的抑制毒力从高到低依次为：黄连醇提取物>黄柏醇提取物>黄芩醇提取物>大黄醇提取物。
表34种植物源提取物对姜瘟病菌的毒力测定
| 供试药剂 | 毒力回归方程 | EC<sub>50</sub>(mg/mL) | 相关系数(R<sup>2</sup>) | 95％置信区间 |
| 黄芩醇提取物 | y＝5.16x-5.36 | 10.83 | 0.975 | 9.66～12.19 |
| 黄柏醇提取物 | y＝4.69x-3.75 | 6.02 | 0.973 | 5.30～6.84 |
| 黄连醇提取物 | y＝5.37x-3.22 | 3.89 | 0.994 | 3.48～4.35 |
| 大黄醇提取物 | y＝5.77x-6.60 | 14.10 | 0.991 | 12.68～15.75 |
实施例4植物源复配剂增效配比的筛选
一、复配成分之间协同作用的测定
1.1试验方法：将抑菌效果较好的黄连醇提取物分别和黄芩醇提取物、黄柏醇提取物、大黄醇提取物按1：1配比混合，混合得到的每组母液中两成分的浓度均为1mg/mL。采用肉汤稀释法测定复配药液对致病菌的最小抑菌浓度(MIC)，再根据以下公式计算FIC指数以判定它们之间的相互作用。
FIC指数＝MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。判断标准：FIC指数≤0.5时两药为协同作用，0.5～1.0时两药为相加作用，1.0～2.0时两药为无关作用，≥2.0时两药为拮抗作用。
1.2试验结果：黄连醇提取物与黄芩醇提取物联合应用时FIC＞0.5，表现为相加作用；黄连醇提取物与黄柏醇提取物联合应用时FIC为0.5，表现为协同作用；黄连醇提取物与大黄醇提取物联合应用时FIC为0.2，表现为拮抗作用；表明黄连醇提取物与黄柏醇提取物复配效果最佳，联合应用具有协同抗菌作用。
表4黄连醇提取物和黄芩、黄柏、大黄醇提取物联合应用的FIC指数
| 复配剂 | FIC | 评价 |
| 黄连醇提取物/黄芩醇提取物 | 0.75 | 相加 |
| 黄连醇提取物/黄柏醇提取物 | 0.50 | 协同 |
| 黄连醇提取物/大黄醇提取物 | 2.00 | 拮抗 |
二、黄连醇提取物和黄柏醇提取物复配的联合毒力
选用黄连醇提取物和黄柏醇提取物复配，以单剂的抑制中质量浓度EC50值为基础，以其体积之比为10:0、0:10、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3比例混合制作带药培养基，对照组用等量的无菌水代替。按照实施例3中的试验方法测定不同比例复配液的抑菌中浓度(EC50)，根据Wadley法评价复配药剂的联合毒力，计算SR(增效比)。
EC50(th)＝(a+b)/[a/ECA50+b/ECB50]
SR＝EC50(th)/EC50(ob)
式中，a、b分别为单剂在混剂中的比例，ECA50、ECB50分别为a、b单剂的EC50实测值，EC50(th)为混剂的EC50理论值，EC50(ob)为混剂的EC50实测值，SR表示a、b单剂混合后的相互作用，当SR＜0.5时为拮抗作用，当SR＝0.5～1.5时为相加作用，当SR＞1.5时为增效作用。
试验结果：黄连醇提取物与黄柏醇提取物配比为3：1的SR值为1.57，表现为增效作用，而配比2：1，1：1，1：2和1：3的SR值分别为1.15、1.02、0.82、0.79，表现为相加作用。因此，本试验黄连醇提取物和黄柏醇提取物的最佳复配比例为体积比3：1，质量比例为2：1(比值取整)，复配剂EC50为3.04mg/mL。
表5黄连醇提取物和黄柏醇提取物复配对姜瘟病菌的联合毒力
实施例5植物源复配剂对姜瘟病的防效试验
一、药剂的制备
根据表6所示的配方制备不同浓度的黄连黄柏复配剂和黄连单剂，对照组(CK)以去离子水代替。
表6
注：表中黄连黄柏醇提取物复配剂为实施例2中，用75％乙醇提取得到的黄连醇提取物(未稀释)和黄柏醇提取物(未稀释)按照质量比2:1混合得到；黄连醇提取物为实施例2中，用75％乙醇提取得到的黄连醇提取物(未稀释)。
二、盆栽试验
2.1试验方法
以“冀姜5号”大姜为试材，挑取健康姜种，催芽后用无菌土育苗，当姜苗长至二叶一心时，将姜瘟病病原菌接种于LB液体培养基中，26℃下恒温振荡培养3h，菌液以生理盐水稀释为浓度3.6×106cfu/mL的菌悬液，吸取20μL菌悬液注射于姜苗茎基部。将“一、药剂的制备”制备得到的不同药剂浓度的黄连单剂和黄连黄柏复配剂分别灌于根部，每株灌药水300mL，对照组灌根CK组的药剂(灌根量300mL/株)，并以防治姜瘟病的杀菌剂46％氢氧化铜分散剂作为商品杀菌剂对照(灌根量300mL/株)，接种后14d统计姜瘟病发病率及病情指数，结果见表7。
2.2试验结果
在3000mg/L剂量下，黄连黄柏复配剂对姜瘟病的防治效果为60.25％，效果优于浓度1500mg/L的46％氢氧化铜WG和相同浓度下的黄连单剂，具有一定的增效作用。
表7供试药剂对姜瘟病的盆栽试验效果
综上所述，本发明采用水提法和醇提法对16种植物源物质进行提取，得到质量浓度为1.0g/mL的水提取物和醇提物，通过抑菌圈试验，筛选出对姜瘟病菌有较强抑菌活性的4种中药，分别为黄连、黄芩、黄柏、大黄。通过测定不同浓度乙醇提取下4种中药提取物的最低抑菌浓度(MIC)，结果显示：75％乙醇提取药物的抑菌作用高于50％醇提取物，与95％乙醇提取作用相当，在75％乙醇提取下，黄连、黄柏、黄芩、大黄的MIC依次为12.5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL。通过对4种药剂进行毒力测定，抑制毒力从高到低依次为：黄连提取物>黄柏提取物>黄芩提取物>大黄提取物，黄芩、黄柏、黄连、大黄提取物对姜瘟病菌的抑制中质量浓度(EC50)分别为10.83、6.02、3.89、14.10mg/mL。选取抑菌效果最好的黄连分别和黄柏、黄芩、大黄复配，通过测定复配剂的FIC，结果表明黄连和黄柏复配组合具有明显的增效作用。进一步研究黄连和黄柏的最佳配比，设置4种配比，分别为黄连：黄柏体积比为3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，通过抑菌圈法研究不同药剂组合的抑菌效果，结果显示黄连和黄柏的提取物的质量比为2：1为中药提取物复配剂的最佳配比，并以该提取物复配剂为基础，添加药学辅料，得到具有明显姜瘟病抑菌效果的植物源复配杀菌剂。盆栽试验表明，当提取物复配剂质量浓度为3000mg/L时，黄连黄柏复配剂对姜瘟病的防治效果为60.25％，防治效果优于浓度1500mg/L的46％氢氧化铜WG，能有效提高提取物的抑菌活性，起到增效作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种植物源复配杀菌剂在防治生姜姜瘟病中的应用，其特征在于，所述植物源复配杀菌剂的有效成分包括黄连提取物和黄柏提取物；
所述生姜姜瘟病的病原菌为巴西果胶杆菌(Pectobacteriumbrasiliense)；
所述黄连提取物为黄连醇提取物；所述黄柏提取物为黄柏醇提取物；
所述黄连醇提取物是利用75％乙醇对黄连进行提取，浓缩后得到；所述黄柏醇提取物是利用75％乙醇对黄柏进行提取，浓缩后得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄连醇提取物和黄柏醇提取物的质量比为2:1。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物源复配杀菌剂还包括药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述辅料包括分散剂和乳化剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述分散剂为十二烷基苯磺酸钠，所述乳化剂为农乳500。
6.一种防治生姜姜瘟病的方法，其特征在于，所述方法包括利用植物源复配杀菌剂对生姜植株进行灌根处理的步骤；
所述植物源复配杀菌剂的有效成分包括黄连提取物和黄柏提取物；
所述生姜姜瘟病的病原菌为巴西果胶杆菌；
所述黄连提取物为黄连醇提取物；所述黄柏提取物为黄柏醇提取物；
所述黄连醇提取物是利用75％乙醇对黄连进行提取，浓缩后得到；所述黄柏醇提取物是利用75％乙醇对黄柏进行提取，浓缩后得到。
7.根据权利要求6所述的防治生姜姜瘟病的方法，其特征在于，所述植物源复配杀菌剂的灌根量为900mg/株。
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