CN105360168A - 一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，包括液体培养基的制备、链格孢菌培养、链格孢菌毒素的制备和链格孢菌毒素的应用，将制备的活性毒素配制成浓度为125～2000μg/mL的混合液，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的毒害症状，并杀死杂草，同时对大多数空心莲子草共生杂草具有毒杀效果。本发明方法液体培养操作简单、培养基质材料易获得、所需设备简单，所用毒素稳定性强，提取纯化工艺简单，可大批量生产；助剂对毒素具有较强的增效作用，以毒素作茎叶喷施，使用方便，既可有效杀灭目标杂草空心莲子草，同时也可兼顾杀灭大多数共生杂草，具有较高的环境安全性。

Description

一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法

技术领域

本发明涉及微生物应用于农业植物保护的技术领域，具体是一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法。

背景技术

空心莲子草是我国广泛分布的外来入侵杂草之一，其生命力强，生长繁殖迅速，扩散快，能够入侵多种生境，危害当地的生物多样性，造成农作物减产，影响农事作业，污染水体，堵塞水道，影响了淡水养殖和农田灌溉，发展成为我国许多地区的恶性杂草。2003年被列入国家环保总局公布的“中国第一批外来入侵生物名单”。空心莲子草的防治主要包括物理防治、化学防治和生物防治。物理防治可短时间内产生较好的防除效果，但因空心莲子草具有较强的克隆繁殖特性，只要有1个茎节其就能繁殖，因此采用常规的机械除草和翻耕方法，只会将其切成更多的茎段，从而催生更多的新植株，不利于防除。化学防治在一定程度上对控制空心莲子草发挥了积极作用，但一些除草剂只能杀死地上部分，而对地下部分却没有效果，且大量化学除草剂的使用必将对环境和人类健康产生一定的负面影响。因此，开展生物防治是目前空心莲子草防治最具潜力的和开发前景的方法。其中，利用天敌昆虫及病原菌进行防治是目前空心莲子草生物防治的主要方法，而利用病原菌进行防治的方法目前还处于防治物筛选阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为解决上述问题，发明人在对空心莲子草入侵现状调查过程中发现了野外空心莲子草的自然发病现象，对其致病真菌进行了分离鉴定研究，经过筛选，获得了强致病链格孢菌菌株J-14；通过前期菌丝体、孢子及代谢产物对空心莲子草致病性比较研究，发现链格孢菌代谢产物具有更强的致病性，同时其避免了菌丝体和孢子货架期短的问题。

一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，具体步骤如下：

(1)液体培养基的制备

①先采集新鲜的空心莲子草茎叶，冲洗干净，阴干去除茎叶表面的水分，剪碎成1～2cm的碎片，取200g，加适量的水，煮沸后，继续煎煮22～28min，经两层纱布过滤，得空心莲子草煎液；②添加葡萄糖20g，加水定容至1000mL；③分装至500mL三角瓶，每瓶300mL，在0.1MPa压力下灭菌24～26min；

(2)链格孢菌培养

在灭菌后的液体培养基中转接3块直径为0.8～1.2cm的链格孢菌饼于液体培养基中；培养温度为25±1℃，光照为L/D＝12:12，摇床振荡培养，转速为110rpm/min，培养时间为5～7d；

(3)链格孢菌毒素的制备

将培养后菌液经减压抽滤得滤液，滤液经大孔吸附树脂吸附，然后用体积浓度为90％的洗脱剂洗脱得洗脱液，并浓缩得棕色浸膏；浸膏经柱层析分离得活性毒素；

(4)链格孢菌毒素的应用

将分离的活性毒素加入水中进行配制，配制成浓度为125～2000μg/mL的混合液，并加入助剂，混合均匀后，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的毒害症状，并杀死共生杂草，同时对大多数空心莲子草共生杂草具有毒杀效果。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇中的一种或两种混合物。

作为本发明进一步的方案：所述步骤(4)中的助剂为表面活性剂、植物源助剂、增效剂和渗透剂的混合物，提高链格孢菌毒素对空心莲子草3～5倍的植物毒性。

作为本发明再进一步的方案：所述助剂为十二烷基苯磺酸钠、曲拉通X-100、硝酸铵、有机硅、司班-60、农乳HSH437、农乳0201B、农乳1602、农乳8205中的多种混合物。

经安全性检测发现，毒素对花生、芝麻、空心菜、大豆、丝瓜及玉米具有较强的致病性，而对棉花和烟草的致病性较弱，相对比较安全。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法液体培养操作简单、培养基质材料易获得、所需设备简单，所用毒素稳定性强，提取纯化工艺简单，可大批量生产；助剂对毒素具有较强的增效作用，以毒素作茎叶喷施，使用方便，既可有效杀灭目标杂草空心莲子草，同时也可兼顾杀灭大多数共生杂草；可用于棉花田、烟草田及荒地等生境中空心莲子草的防除，具有较高的环境安全性。

附图说明

图1为不同浓度链格孢菌毒素对空心莲子草的致病性对比图。

图2为不同助剂对毒素的增效作用图。

(A：吐温20；B：吐温80；C：曲拉通X-100；D：油酸甲酯；E：木质素磺酸钠；F：十二烷基磺酸钠；G：十二烷基苯磺酸钠；H：硝酸铵；I：硫酸铵；J：有机硅；K：月桂氮酮；L：司班-60；M：农乳HSH437；N：农乳0201B；O：乳OP-10；P：农乳BY-130；Q：农乳4003；R：农乳600；S：农乳1602；T：农乳3201；U：农乳8205，以上均购自江苏省海安石油化工厂)

图3为不同助剂配方对毒素的增效作用图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将强致病菌菌株J-14直径6mm菌块转接至马铃薯琼脂培养基(PDA)、空心莲子草茎叶煎汁培养基(ADA)、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)、1％聚山梨酯80-玉米琼脂培养基(TCA)、沙氏琼脂培养基(SDLA)、察氏培养基(CDA)和沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)7种培养基平板上，置于25±1℃生化培养箱中黑暗培养，5d后测量菌落直径，然后用载玻片轻轻将孢子刮下，加入适量的无菌水配制成孢子悬浮液，在显微镜下，用血球计数板法统计孢子的产量。每处理设5个重复，结果见表1。

表1表明链格孢菌在空心莲子草茎叶煎汁培养基(ADA)和沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)上菌落生长较好，显著高于其在其它培养基上的生长(P＜0.05)，生长5d后相应的菌落直径分别为5.800cm和5.876cm；链格孢菌在沙氏琼脂培养基(SDLA)上生长的相对较缓慢，生长5d后其菌落直径为4.524cm。链格孢菌在ADA培养基上的产孢量最高，为519.374×10⁶个，显著高于其在其它培养基上的产孢量(P＜0.05)，其后依次为1％聚山梨酯80-玉米琼脂培养基(TCA)、SDA和PDA，而在SDLA上的产孢量最小，显著低于其它培养基(P＜0.05)。可见，ADA培养基最适合于链格孢菌的生长和产孢。

表1不同培养基对链格孢菌菌落生长和产孢的影响

表中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，下同。

实施例2

用少量乙酸乙酯(浓度为2％)溶解链格孢菌毒素后，用蒸馏水分别配制125、250、500、1000、2000μg/mL的毒素溶液。以离体叶片针刺法检测了毒素对空心莲子草的致病性。选取无病虫害的健康空心莲子草分株，取从顶端往下数的第3对叶片，用无菌水冲洗干净，并用吸水纸吸干叶片上的水分，置于铺有一张湿润滤纸的培养皿中，用解剖针轻轻刺破叶片表皮，滴加10μL溶液，置于25±1℃生化培养箱中黑暗培养，72h后测量病斑直径；同时，设清水对照CK0和2％乙酸乙酯溶液对照CK1，每处理重复4次，结果见图1。

图1表明链格孢菌毒素对空心莲子草具有较强的致病性，随着毒素浓度的升高，致病性增强，各浓度间存在显著差异(P＜0.05)；在最低浓度125μg/mL时，即具有明显的植物毒性，且与对照相比，具有显著差异(P＜0.05)。

实施例3

用少量乙酸乙酯(浓度为2％)溶解链格孢菌毒素后，用蒸馏水配制成浓度为1000μg/mL的毒素溶液。以离体叶片针刺法检测毒素对空心莲子草生境中主要共生植物及常见作物的致病性，叶片处理方法同实施例2，然后按病斑直径大小进行分级统计，致病性分级标准见表2，统计结果见表3。

表2链格孢菌毒素对植物致病性级别(离体叶片针刺法)

表3表明毒素对空心莲子草大多数共生杂草具有较强的致病性，但不同杂草间存在一定的差异。其中，毒素对白茅、野塘蒿、一年蓬、山莴苣、水蓼、红花酢酱草、积雪草的致病性最强，为“+++”级，而对白英致病性较弱，为“-”级；其对作物或蔬菜的致病性显示，毒素对花生、芝麻、空心菜、大豆、丝瓜及玉米具有较强的致病性，而对棉花和烟草的致病性较弱，相对比较安全。

表3链格孢菌毒素对不同植物的致病性

实施例4

用少量乙酸乙酯(浓度为2％)溶解链格孢菌毒素后，用1‰浓度的吐温20等21种不同助剂溶液配制成浓度为1000μg/mL的毒素溶液。以空心莲子草离体叶片针刺法比较21种助剂对毒素的增效作用差异。空心莲子草叶片处理同实施例2；同时，设清水对照CK0、2％乙酸乙酯溶液对照CK1、2％乙酸乙酯+1‰浓度的助剂对照CK2和1000μg/mL浓度的毒素溶液对照CK3，每处理重复6次，结果见图2。

图2表明21种助剂对毒素的活性均具有不同程度的增效作用，但存在一定的差异。十二烷基磺酸钠具有最高的增效作用，为对照药液的3.56倍，其可使药液充分扩散，提高其渗透能力。十二烷基苯磺酸钠、曲拉通X-100、硝酸铵、有机硅、司班-60、农乳HSH437、农乳0201B、农乳1602和农乳8205，达到1.69～3.19倍；与对照相比，均达到差异显著水平(P＜0.05)。

实施例5

根据实例2中助剂的筛选结果，结合助剂的性质，将相关助剂设置了5种配方。

P1：助剂C+助剂F+助剂H+助剂J+助剂N+1000μg/mL浓度的毒素溶液

P2：助剂C+助剂F+助剂H+助剂J+助剂S+1000μg/mL浓度的毒素溶液

P3：助剂C+助剂F+助剂H+助剂J+助剂L+1000μg/mL浓度的毒素溶液

P4：助剂C+助剂F+助剂H+助剂J+助剂M+1000μg/mL浓度的毒素溶液

P5：助剂C+助剂F+助剂H+助剂J+助剂U+1000μg/mL浓度的毒素溶液

采用离体叶片针刺法检测设计好的5种配方对空心莲子草的致病性进行检测，具体叶片处理方法同事实例2，设置药剂对照CK，每处理设4个重复，结果见图3。

图3表明5种配方对链格孢菌毒素均有很好的增效作用，但不同配方之间存在一定的差异。其中配方P3的增效作用最强，药效是对照的4.31倍，其次为配方P2，药效为对照的4.14倍，二者间没有显著差异(P＞0.05)；两种配方的药效显著高于配方P1和P4的药效。

实施例6

用实施例5中配方P3对野外荒地空心莲子草进行茎叶喷施处理。用药量以杂草茎叶表面润湿为标准，设4个重复，每重复1m×1m，同时，设清水CK0和助剂CK1对照，每天进行观察，并于3d和7d统计株防效，结果见表4。

对空心莲子草进行茎叶喷施处理后，3d内其植株即出现萎蔫现象，并逐渐出现失绿白化及干枯，在7d其株防效超过85％。

表4配方P3对空心莲子草的防除效果

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (4)

1.一种利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)液体培养基的制备

①先采集新鲜的空心莲子草茎叶，冲洗干净，阴干去除茎叶表面的水分，剪碎成1～2cm的碎片，取200g，加适量的水，煮沸后，继续煎煮22～28min，经两层纱布过滤，得空心莲子草煎液；②添加葡萄糖20g，加水定容至1000mL；③分装至500mL三角瓶，每瓶300mL，在0.1MPa压力下灭菌24～26min；

(2)链格孢菌培养

在灭菌后的液体培养基中转接3块直径为0.8～1.2cm的链格孢菌饼于液体培养基中；培养温度为25±1℃，光照为L/D＝12:12，摇床振荡培养，转速为110rpm/min，培养时间为5～7d；

(3)链格孢菌毒素的制备

将培养后菌液经减压抽滤得滤液，滤液经大孔吸附树脂吸附，然后用体积浓度为90％的洗脱剂洗脱得洗脱液，并浓缩得棕色浸膏；浸膏经柱层析分离得活性毒素；

(4)链格孢菌毒素的应用

将分离的活性毒素加入水中进行配制，配制成浓度为125～2000μg/mL的混合液，并加入助剂，混合均匀后，喷洒在空心莲子草上，在3天内使空心莲子草表现出明显的毒害症状，并杀死共生杂草。

2.根据权利要求1所述的利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇中的一种或两种混合物。

3.根据权利要求1所述的利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的助剂为表面活性剂、植物源助剂、增效剂和渗透剂的混合物，提高链格孢菌毒素对空心莲子草3～5倍的植物毒性。

4.根据权利要求3所述的利用致病真菌防治外来杂草空心莲子草的方法，其特征在于，所述助剂为十二烷基苯磺酸钠、曲拉通X-100、硝酸铵、有机硅、司班-60、农乳HSH437、农乳0201B、农乳1602、农乳8205中的多种混合物。