CN115044601A - 一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法 - Google Patents

一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法。包括：将短短芽孢杆菌HB200在TM固体培养基上活化；挑取单菌落于LBS液体培养基中培养；转接培养的菌液于LBS液体培养基中培养；转接培养的菌液于LBS液体培养基中培养；用分光光度计监测步骤获得菌液的光密度值；在冰上冷却离心，弃去上清液；将得到的沉淀在冰上用洗涤液纯化四次，得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；取感受态细胞与质粒pNCMO2混合；将混合物装入预冷的电转杯进行电转化；电脉冲后，立即将LBMS加入混合物中，培养得含有pNCMO2质粒的HB200。该方法操作简单，重复性好，转化率高。

Description

一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种将PNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法。
背景技术
短短芽孢杆菌分布广,存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处，是一种安全、无毒性的益生菌，为好氧或兼性厌氧的杆菌，一般为革兰氏染色阳性。短短芽孢杆菌应用范围非常广泛,主要包括生物防治、环境治理、工业生产和有毒物质降解等等。
短短芽孢杆菌细胞壁结构简单，内生质粒较少，分泌蛋白能力强,不含内毒素,具有临床和环境方面的安全性,所以是生防菌株和外源蛋白表达系统构建中宿主细胞的重要选择。
目前,在短短芽孢杆菌为宿主的表达系统中,可以用于芽孢杆菌转化的方法主要有：感受态转化法、原生质体转化法、电穿孔转化法等。感受态转化法虽然操作简单，但成功率极低，而原生质体转化法转化率相对较高，但步骤繁琐，且条件不易控制，因此目前最频繁运用的是电转化法。然而，电转化法虽然操作相对简便、转化效率相对较高、参数容易控制、无残余毒性，且适用于一些难转化的菌株，但由于不同菌株生理特性差异大，其合适的电转化参数往往不同。因此，探索并确定短短芽孢杆菌HB200合适的电转化参数对其高效电转化方法的构建至关重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，该方法操作简单，重复性好，转化率高。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法；包括以下步骤：
S1.将短短芽孢杆菌HB200在TM固体培养基上活化；
S2.挑取步骤S1的单菌落于LBS液体培养基中培养；
S3.转接经步骤S2培养的菌液于LBS液体培养基中培养；
S4.转接经步骤S3培养的菌液于LBS液体培养基中培养；
S5.用分光光度计监测步骤S4获得菌液的光密度值；
S6.在冰上冷却10分钟，离心，弃去上清液；
S7.将步骤S6得到的沉淀在冰上用洗涤液纯化四次，得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；洗涤液每升中含有以下组分：0.5M山梨糖醇，0.5M甘露醇，10％甘油；
S8.取感受态细胞与质粒pNCMO2混合；在冰上孵育，将混合物装入预冷的电转杯，进行电转化；
S9.电脉冲后，立即将LBMS加入混合物中，200rmp震荡培养，即得含有pNCMO2质粒的HB200。
进一步的，所述步骤S1具体为将短短芽孢杆菌HB200在LB固体培养基的平板上活化；以三线划法画于TM固体培养基上、37℃培养24小时；其中每升LBS液体培养基含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物；每升TM固体培养基含有以下组分：多价蛋白胨10g，肉浸粉5g，酵母粉2g，琼脂粉25g。
进一步的，所述步骤S2的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养24小时；挑取步骤S1的单菌落于3mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
进一步的，所述步骤S3的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养16-24小时；转接经步骤S2培养的60μL菌液于3mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
进一步的，所述步骤S4的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养4小时；转接经步骤S3培养的240μL菌液于12mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
进一步的，所述步骤S5检测菌液的光密度在600nm(OD600)达到0.4-0.6。
进一步的，所述步骤S6离心条件为：10000g、4℃、10分钟。
进一步的，所述步骤S7用洗涤液纯化具体为：加洗涤液，先离心10分钟，弃上清，重复2次；加洗涤液离心5分钟，弃上清，重复2次；其中离心条件为10000g、4℃。
更具体的为：洗涤液洗涤四次：10000g、4℃条件下离心10min，去上清液，加5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液；得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；
进一步的，所述步骤S8具体为：取60μL电感受态细胞与2.5μL质粒pNCMO2混合。在冰上孵育3分钟后，将混合物装入预冷的0.1cm电极间隙的电击杯，应用穿孔仪(Bio-Rad，Hercμles，美国CA)产生的电压1600V或1800V或2000V进行脉冲。
进一步的，所述步骤S9中LBMS加入1mL；加入的LBMS每升中含有以下组分：NaCl10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘露醇0.5M，山梨醇0.38M。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
本发明建立了一套简单、有效的短短芽孢杆菌转化方法。本发明建立的短短芽孢杆菌转化方法操作简单，转化率最高可达9×106cfu/μg，效果稳定，不仅为短短芽孢杆菌的遗传改造奠定了良好基础，对加快其在工业生产中的应用具有重要意义，同时也为其它芽孢杆菌的遗传转化提供了重要参考。
附图说明
图1为平板筛选阳性菌落图。其中抗性为氨苄抗生素；电穿孔仪产生的单脉冲电压为1800V。
图2为平板筛选阳性菌落图。其中抗性为氨苄抗生素；电穿孔仪产生的单脉冲电压为2000V。
图3为菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中(A)为电穿孔仪产生的单脉冲电压2000V制备的单克隆菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；(B)为电穿孔仪产生的单脉冲电压1800V制备的单克隆菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；M1:DL10000 Marker；M2:D2000Marker。
图4为pNCMO2质粒酶切琼脂糖凝胶电泳图。其中(A)为电穿孔仪产生的单脉冲电压2000V制备的pNCMO2质粒EcoRI单酶切琼脂糖凝胶电泳图；(B)为电穿孔仪产生的单脉冲电压1800V制备的pNCMO2质粒EcoRI单酶切琼脂糖凝胶电泳图；M1:DL10000 Marker；M2:D2000Marker。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。下述实施例中，TM固体培养基每升中含有以下组分：多价蛋白胨10g，肉浸粉5g，酵母粉2g，琼脂粉25g；LBS液体培养基每升中含有以下组分：0.5M山梨醇，10gNacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物；洗涤液每升中含有以下组分：0.5M甘露醇，0.5M山梨醇，10％甘油。
实施例1
一种将pNCMO2质粒(Takara公司，code:HB112)转入短短芽孢杆菌BrevibacillusHB200(Takara公司，code：HB200)的电转化方法；
(1)将短短芽孢杆菌HB200在LB平板上活化；
(2)以三线划法画于TM固体培养基上，37℃培养24小时；
(3)挑取单菌落于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220r培养24小时；
(4)取60μL菌液于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养24小时；
(5)取240μL菌液于12mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养4小时；
(6)用分光光度计监测的光密度在600nm(OD600)达到0.4-0.6；
(7)洗涤液洗涤四次：10000g、4℃条件下离心10min，去上清液，加5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液；得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；
(8)取60μL电感受态细胞与2.5μL质粒pNCMO2混合。在冰上孵育3分钟后，将混合物装入预冷0.1cm电极间隙的电击杯，应用电转仪(Bio-Rad，Hercμles，美国CA)于1600V电压产生的单脉冲电转化；得混合物。
(9)电脉冲后，立即将1mL LBMS(每1L水中含有NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘露醇0.5M，山梨醇0.38M)加入混合物中；
(10)在37℃，200rpm摇床3小时后，涂布于含有100μg/mL氨苄抗生素的LB平板筛选，可得含有pNCMO2质粒的HB200单克隆菌株；
(11)稀释菌液100倍，吸取100μL菌液涂板。37℃过夜孵育，对转化子进行计数；
实施例2
一种将pNCMO2质粒(Takara公司，code:HB112)转入短短芽孢杆菌BrevibacillusHB200(Takara公司，code：HB200)的电转化方法；
(1)将短短芽孢杆菌HB200在LB平板上活化；
(2)以三线划法画于TM固体培养基上，37℃培养24小时；
(3)挑取单菌落于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220r培养24小时；
(4)取60μL菌液于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养24小时；
(5)取240μL菌液于12mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养4小时；
(6)用分光光度计监测的光密度在600nm(OD600)达到0.4-0.6；
(7)洗涤液洗涤四次：10000g、4℃条件下离心10min，去上清液，加5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液；得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；
(8)取60μL电感受态细胞与2.5μL质粒pNCMO2混合。在冰上孵育3分钟后，将混合物装入预冷0.1cm电极间隙的电击杯，应用电转仪(Bio-Rad，Hercμles，美国CA)于1800V电压产生的单脉冲电转化；得混合物。
(9)电脉冲后，立即将1mL LBMS(每1L水中含有NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘露醇0.5M，山梨醇0.38M)加入混合物中；
(10)在37℃，200rpm，振荡3小时后，可得含有pNCMO2质粒的HB200菌株；
(11)稀释菌液100倍，吸取100μL菌液涂于含有100μg/mL氨苄抗生素的LB平板。37℃过夜孵育后对转化子进行计数。
实施例3
一种将pNCMO2质粒(Takara公司，code:HB112)转入短短芽孢杆菌BrevibacillusHB200(Takara公司，code：HB200)的电转化方法；
(1)将短短芽孢杆菌HB200在LB平板上活化；
(2)以三线划法画于TM固体培养基上，37℃培养24小时；
(3)挑取单菌落于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220r培养24小时；
(4)取60μL菌液于3mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养24小时；
(5)取240μL菌液于12mL LBS液体培养基，37℃振荡220rpm培养4小时；
(6)用分光光度计监测的光密度在600nm(OD600)达到0.4-0.6；
(7)洗涤液洗涤四次：10000g、4℃条件下离心10min，去上清液，加5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液，加2.5mL洗涤液；10000g、4℃条件下离心5min，去上清液；得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；
(8)取60μL电感受态细胞与2.5μL质粒pNCMO2混合。在冰上孵育3分钟后，将混合物装入预冷0.1cm电极间隙的电击杯，应用电转仪(Bio-Rad，Hercμles，美国CA)于2000V电压产生的单脉冲电转化；得混合物。
(9)电脉冲后，立即将1mL LBMS(每1L水中含有NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘露醇0.5M，山梨醇0.38M)加入混合物中；
(10)在37℃，200rpm，振荡3小时后，可得含有pNCMO2质粒的HB200菌株；
(11)稀释菌液100倍，吸取100μL菌液摊板。37℃过夜孵育后对转化子进行计数。
本发明所得转化子效果验证实验。
通过实施例1、实施例2、实施例3提供的方法，分别将质粒pNCMO2转化至短短芽孢杆菌HB200中，得到一系列转化子，分别取等量涂布于含抗生素Amp(100ug/mL)的LB平板上，37℃放置约24小时可见板上有抗性菌落长出，图1、2分别为实施例2、实施例3中培养24h后于抗性平板上生长的菌落，可证明转化效率良好。
由于转化子数量较多，从实施例所得转化子中随机挑取单克隆利用特异引物进行菌落PCR筛选，以下为其中4个转化子的电泳图(图3)，证实实施例2、实施例3中所得转化子均能扩增出约2600bp的特异条带，与预期大小相符，可证明转化效果良好。
采用质粒的提取及酶切电泳进一步分析pNCMO2质粒是否已经成功转化，即转化子在含氨苄青霉素(100ug/mL)的5mL液体培养基中过夜培养，提取质粒并单酶切后电泳显示，在分子量大小约为5200bp处看到特异条带(图4)，可证明转化效果良好。
Figure BDA0003656819110000061
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，包括以下步骤：
S1.将短短芽孢杆菌HB200在TM固体培养基上活化；
S2.挑取步骤S1的单菌落于LBS液体培养基中培养；
S3.转接经步骤S2培养的菌液于LBS液体培养基中培养；
S4.转接经步骤S3培养的菌液于LBS液体培养基中培养；
S5.用分光光度计监测步骤S4获得菌液的光密度值；
S6.在冰上冷却10分钟，离心，弃去上清液；
S7.将步骤S6得到的沉淀在冰上用洗涤液纯化四次，得到沉淀加8％甘油混匀，获得感受态细胞；洗涤液每升中含有以下组分：0.5M山梨糖醇，0.5M甘露醇，10％甘油；
S8.取感受态细胞与质粒pNCMO2混合；在冰上孵育，将混合物装入预冷的电转杯，进行电转化；
S9.电脉冲后，立即将LBMS加入混合物中，200rmp震荡培养，即得含有pNCMO2质粒的HB200；
所述步骤S9中LBMS加入1mL；加入的LBMS每升中含有以下组分：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，甘露醇0.5M，山梨醇0.38M。
2.如权利要求1所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S1具体为将短短芽孢杆菌HB200在LB固体培养基的平板上活化；以三线划法画于TM固体培养基上、37℃培养24小时；其中每升LBS液体培养基含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物；每升TM固体培养基含有以下组分：多价蛋白胨10g，肉浸粉5g，酵母粉2g，琼脂粉25g。
3.如权利要求2所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S2的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养24小时；挑取步骤S1的单菌落于3mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
4.如权利要求3所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S3的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养16-24小时；转接经步骤S2培养的60μL菌液于3mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
5.如权利要求4所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S4的培养条件为：37℃、振荡220rpm、培养4小时；转接经步骤S3培养的240μL菌液于12mL LBS液体培养基中培养；每升LBS液体培养基中含有以下组分：0.5M山梨醇，10g氯化钠，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物。
6.如权利要求5所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S5检测菌液的光密度在600nm达到0.4-0.6。
7.如权利要求6所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S6离心条件为：10000g、4℃、10分钟。
8.如权利要求7所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S7用洗涤液纯化具体为：加洗涤液，先离心10分钟，弃上清，重复2次；加洗涤液离心5分钟，弃上清，重复2次；其中离心条件为10000g、4℃。
9.如权利要求8所述的一种将pNCMO2质粒转入短短芽孢杆菌HB200的电转化方法，其特征是，所述步骤S8具体为：取60μL电感受态细胞与2.5μL质粒pNCMO2混合。在冰上孵育3分钟后，将混合物装入预冷的0.1cm电极间隙的电击杯，应用穿孔仪产生的电压1600V或1800V或2000V进行脉冲。
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ZHANG JINGJING等: "Heterologous Expression of the Marine-Derived Quorum Quenching Enzyme MomL Can Expand the Antibacterial Spectrum of Bacillus brevis", MAR.DRUGS, vol. 17, pages 1 - 18 *
徐敏等: "高渗透压对细菌电转化率的影响", 无锡轻工大学学报, vol. 23, no. 4, pages 98 - 100 *
赵春云等: "高渗提高凝结芽孢杆菌P4-102B 菌株的电击转化效率", 微生物学通报, vol. 43, no. 6, pages 1388 *

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