CN115029312B

CN115029312B - 一种血小板外泌体的提取方法

Info

Publication number: CN115029312B
Application number: CN202210963728.9A
Authority: CN
Inventors: 谢海涛; 谢天仲; 薛卫巍
Original assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xiankangda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2042-08-11
Also published as: CN115029312A

Abstract

本发明公开了一种高浓度血小板外泌体的提取方法，包括步骤：将高倍浓缩血小板装入冻存管后直接放入液氮中冷冻20~40分钟；从液氮中取出冻存管，并使用35~42℃水浴溶解高倍浓缩血小板；待高倍浓缩血小板完全溶解后，冰浴下对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得高倍浓缩血小板外泌体。血小板浓缩倍数高，高倍浓缩的血小板比普通PRP血小板浓度高，制得外泌体浓度更高，且血小板外泌体的提取方法简单，时间短。

Description

一种血小板外泌体的提取方法

技术领域

本发明涉及血液分离提取技术，尤其涉及一种高倍浓缩血小板外泌体的提取方法。

背景技术

外泌体（Exosome）是由活细胞分泌的直径约为30-150 nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。

外泌体（exosome）因来源细胞差异大小不一，变异范围从30～100nm到40～200nm不等，是生物活性蛋白、脂质、信使核糖核酸（mRNA）和微小核糖核酸（miRNA）的载体，在细胞间通讯及介导生物功能方面起至关重要的作用。外泌体起源于胞内早期内小体（earlyendosome），内小体膜内陷并发育成熟形成多囊体（MVBs），与质膜融合后通过胞吐作用释放。生理条件下，几乎所有代谢活跃的细胞均能释放外泌体，并通过血液、淋巴液、脑脊液等体液系统转运至机体各处，可广泛存在于血液、唾液、脑脊液、母乳、尿液等处。有确凿证据表明，外泌体具有与来源细胞相似的功能作用，而组织损伤、缺氧等应激条件，可影响相关细胞外泌体的成分组成及合成、分泌，进而参与损伤修复等病理过程。血小板是没有基因组DNA的无核细胞，但它含有丰富多样的mRNA和miRNA，是人体循环血浆中外泌体的主要来源，甚至有文献报道，血小板源外泌体数量多达血清外泌体总数的70％，并参与炎症和动脉粥样硬化等多种重要病理生理机制。

富血小板血浆（PRP）是一种将动物或人全血经过反复离心所获得的多功能血小板浓聚物，其血小板浓度为生理血液中的3～5倍。成分包括高浓度多种类的生长因子、纤维蛋白、白细胞及炎症介质等，PRP具有促进细胞增殖分化、胞外基质生成、抗炎等作用，目前已广泛应用于骨组织、软骨组织、肌腱、韧带、皮肤缺损、神经损伤及美容、生发等的再生修复治疗。

富血小板血浆来源外泌体（PRP－exos）是通过过滤、离心等多种方法从PRP中提取获得的血小板源外泌体，其大小、形态及部分蛋白标记物与其他细胞的外泌体相似，同样是细胞间通讯作用的主要媒介，不同的是血小板外泌体内部含有更多的趋化因子、生长因子等活性物质。

近年来，已有大量报道证实了PRP在促进骨、软骨等组织中的修复作用，而PRP－exos在其中充当着重要角色，据研究报道，PRP的组织修复活性可能是由于生长因子和其他生物活性分子的有效细胞间通讯作用所致，这些分子通过搭载于PRP－exos来介导。

发明内容

基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种高倍浓缩血小板外泌体的提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种高浓度血小板外泌体的提取方法，包括如下步骤：

将高倍浓缩血小板装入冻存管后直接放入液氮中冷冻20~40分钟；

从液氮中取出冻存管，并使用35~42℃水浴溶解高倍浓缩血小板；

待高倍浓缩血小板完全溶解后，冰浴下对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得高倍浓缩血小板外泌体。

一实施例，所述提取方法中，所述高倍浓缩血小板采用如下步骤制得：

采集静脉血注入50ml离心管中，随后将所述50ml离心管离心200g、10分钟，停止离心，取上层血浆注入15ml离心管中；

往所述15ml离心管中加入血小板浓缩液，上下颠倒混匀；

将所述15ml离心管离心1000g、10分钟，停止离心；从上往下吸弃所述15ml离心管中上层血浆，保留底部悬液，并不断吹打悬液，获得高倍浓缩的血小板外泌体。

一实施例，所述提取方法中，所述血小板浓缩液的加入量为血浆体积的15~25%；优选，血小板浓缩液的加入量为血浆体积的20%。

一实施例，所述提取方法中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液包括: 乙二胺四乙酸钠1.82~2.52g、枸橼酸3.0~3.5g、枸橼酸钠25.93~27.1g、磷酸二氢钠1.80~2.42g、葡萄糖30.1~32.9g、腺嘌呤0.20~0.32g、人血白蛋白45~55ml、余量为无菌去离子水；优选，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液包括:乙二胺四乙酸钠2.02g、枸橼酸3.25g、枸橼酸钠26.1g、磷酸二氢钠1.98g、葡萄糖31.1g、腺嘌呤0.28g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水。

一实施例，所述提取方法中，所述冻存管放入液氮中冷冻30分钟。

一实施例，所述提取方法中，所述超声破碎步骤中，使用超声波细胞破碎仪对高倍浓缩血小板进行超声破碎，超声波细胞破碎仪的超声频率为20KHZ。

一实施例，所述提取方法中，所述超声破碎步骤中，还包括工艺步骤：超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟。

一实施例，所述提取方法中，所述超声破碎步骤中，还包括工艺步骤：破碎循环3次，每次间隔2分钟。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、血小板浓缩倍数高，高倍浓缩的血小板比普通PRP血小板浓度高，制得外泌体浓度更高；

2、血小板外泌体的提取方法简单，时间短。

附图说明

图1为本发明高倍浓缩血小板的制备工艺流程；

图2为本发明高倍浓缩血小板外泌体的提取工艺流程；

图3为初始血液样本中血小板浓度检测图；

图4为实施例1中高倍浓缩血小板浓度检测图；

图5为实施例2中高倍浓缩血小板浓度检测图；

图6为实施例3中高倍浓缩血小板浓度检测图；

图7为对比例1中高倍浓缩血小板浓度检测图；

图8为实施例1中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图；

图9为实施例2中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图；

图10为实施例3中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图；

图11为对比例1中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图；

图12为对比例2中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图；

图13为对比例3中高倍浓缩血小板外泌体浓度检测图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。

本发明中，为了获得一定量的高倍浓缩血小板，采用了两支50ml离心管进行采样和收集。如果采用一支50ml离心管也可以，但是血液样本离心后获得高倍浓缩血小板的量少，可能存在不够后续试验操作，如，获取高倍浓缩血小板外泌体。

本发明中，高倍浓缩血小板采用如下步骤制得：

S1、使用肝素钠采血管静脉采血50ml；

S2、将血液平分至两支50ml离心管中，离心200g、10分钟；

S3、离心结束，吸取上层血浆到另外两支15ml离心管中，往两支15ml离心管中分别加入血小板浓缩液，上下颠倒，各自混匀；

S4、两支15ml离心管离心1000g、10分钟，离心结束后，将上层血浆吸弃，共保留底部悬液5ml，分别吹打混匀后移至新的另一只新离心管，得高倍浓缩血小板。

进一步地，上述步骤S3中，添加血小板浓缩液的体积数为血浆体积的15~25%；优选地，添加血小板浓缩液的体积数为血浆体积的18-22%，也可以是添加血小板浓缩液的体积数为血浆体积的15%、18%、20%、22%、25%等。

进一步地，上述步骤S3中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠1.82~2.52g、枸橼酸3.0~3.5g、枸橼酸钠25.93~27.1g、磷酸二氢钠1.80~2.42g、葡萄糖30.1~32.9g、腺嘌呤0.20~0.32g、人血白蛋白45~55ml、余量为无菌去离子水；

优选地，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠2.02~2.22g、枸橼酸3.22~3.34g、枸橼酸钠26.13~26.81g、磷酸二氢钠2.10~2.32g、葡萄糖30.9~31.9g、腺嘌呤0.25~0.30g、人血白蛋白48~52ml、余量为无菌去离子水。

具体地，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括:乙二胺四乙酸钠2.02g、枸橼酸3.25g、枸橼酸钠26.1g、磷酸二氢钠1.98g、葡萄糖31.1g、腺嘌呤0.28g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水；或者

按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠1.82g、枸橼酸3.0g、枸橼酸钠25.93g、磷酸二氢钠1.80g、葡萄糖30.1g、腺嘌呤0.20g、人血白蛋白45ml、余量为无菌去离子水；或者

按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠2.52g、枸橼酸3.5g、枸橼酸钠27.1g、磷酸二氢钠2.42g、葡萄糖32.9g、腺嘌呤0.32g、人血白蛋白55ml、余量为无菌去离子水；或者

按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠2.02g、枸橼酸3.22g、枸橼酸钠26.13g、磷酸二氢钠2.10g、葡萄糖30.9g、腺嘌呤0.25g、人血白蛋白48ml、余量为无菌去离子水；或者

按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠2.22g、枸橼酸3.34g、枸橼酸钠26.81g、磷酸二氢钠2.32g、葡萄糖31.9g、腺嘌呤0.30g、人血白蛋白52ml、余量为无菌去离子水。

本发明中，高倍浓缩血小板外泌体的提取方法，步骤如下：

S11、将上述高倍浓缩血小板装入冻存管后直接放入液氮中冷冻；

S12、冷冻结束后，从液氮中取出，使用35℃~42℃水浴溶解；

S13、待高倍浓缩血小板完全溶解后，冰浴下对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得高倍浓缩血小板外泌体。

优选地，上述步骤S11中，液氮中冷冻的时间为25~35分钟，如，25分钟、28分钟、30分钟、32分钟、35分钟等。

优选地，上述步骤S12中，水浴温度优选37℃，也可以是35℃、36℃、39℃、41℃、42℃。

优选地，上述步骤S13中，超声破碎采用超声波细胞破碎仪，超声频率为20KHZ；超声破碎过程还包括：超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟，作为一个循环流程；进一步地，破碎循环执行3次（即3个循环流程），每次间隔2分钟。

一、下面通过具体实施例来进一步说明

实施例1

（一）、高倍浓缩血小板的制备方法

静脉采血50ml，平分加入两支50ml离心管中进行离心200g、10分钟，离心结束后，吸取上层血浆平分加入到两支15ml离心管中，每支加入血浆体积20%的血小板浓缩液；其中，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，血小板浓缩液包括组分:乙二胺四乙酸钠2.02g、枸橼酸3.25g、枸橼酸钠26.1g、磷酸二氢钠1.98g、葡萄糖31.1g、腺嘌呤0.28g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水；

两支15ml离心管离心1000g、10分钟，离心结束后，从上往下吸弃上层血浆，保留总体积5ml，吹打混匀，获得浓度为1249×10⁹/L的高倍浓缩血小板，如图3所示。

（二）、血小板外泌体的提取方法

取高倍浓缩血小板装入冻存管后放入液氮中冷冻10分钟；

时间到后，从液氮中取出，使用37℃水浴溶解；

溶解完成后，将高倍浓缩血小板冰浴并使用超声波细胞破碎仪以20KHZ，超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟，作为一个循环流程；破碎循环执行3次（即3个循环流程），每次间隔2分钟，对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得到浓度为5000×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图8所示。

实施例2

（一）、高倍浓缩血小板的制备方法

静脉采血50ml，平分加入两支50ml离心管中进行离心500g、10分钟，离心结束后，吸取上层血浆平分加入到两支15ml离心管中，每支加入血浆体积15%的血小板浓缩液；其中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，血小板浓缩液包括组分: 乙二胺四乙酸钠1.82g、枸橼酸3.0g、枸橼酸钠25.93g、磷酸二氢钠1.80g、葡萄糖30.1g、腺嘌呤0.20g、人血白蛋白45ml、余量为无菌去离子水；

两支15ml离心管离心1000g、10分钟，离心结束后，从上往下吸弃上层血浆，保留总体积5ml，吹打混匀，获得浓度为5529×10⁹/L的高倍浓缩血小板，如图4所示。

（二）、血小板外泌体的提取方法

取高倍浓缩血小板装入冻存管后放入液氮中冷冻25分钟；

时间到后，从液氮中取出，使用35℃水浴溶解；

溶解完成后，将高倍浓缩血小板冰浴并使用超声波细胞破碎仪以20KHZ，超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟，作为一个循环流程；破碎循环执行3次（即3个循环流程），每次间隔2分钟，对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得到浓度为35×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图9所示。

实施例3

（一）、高倍浓缩血小板的制备方法

静脉采血50ml，平分加入两支50ml离心管中进行离心200g、10分钟，离心结束后，吸取上层血浆平分加入到两支15ml离心管中，每支加入血浆体积25%的血小板浓缩液；其中，按照每1000ml所述浓缩分离液总体积计算，血小板浓缩液包括组分: 乙二胺四乙酸钠2.52g、枸橼酸3.5g、枸橼酸钠27.1g、磷酸二氢钠2.42g、葡萄糖32.9g、腺嘌呤0.32g、人血白蛋白55ml、余量为无菌去离子水；

两支15ml离心管离心1000g、10分钟，离心结束后，从上往下吸弃上层血浆，保留总体积5ml，吹打混匀，获得浓度为1297×10⁹/L的高倍浓缩血小板，如图5所示。

（二）、血小板外泌体的提取方法

取高倍浓缩血小板装入冻存管后放入液氮中冷冻35分钟；

时间到后，从液氮中取出，使用42℃水浴溶解；

溶解完成后，将高倍浓缩血小板冰浴并使用超声波细胞破碎仪以20KHZ，超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟，作为一个循环流程；破碎循环执行3次（即3个循环流程），每次间隔2分钟，对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得到浓度为14000×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图10所示。

对比例1

（一）、现有高倍浓缩血小板的制备方法

静脉采血50ml，平分加入两支50ml离心管中进行离心200g、10分钟，离心结束后，吸取上层血浆平分加入到两支15ml离心管中；

两支15ml离心管离心1000g、10分钟，离心结束后，从上往下吸弃上层血浆，保留总体积5ml，吹打混匀，获得浓度为467×10⁹/L的高倍浓缩血小板，如图6所示。

（二）、本发明本发明血小板外泌体的提取方法

取高倍浓缩血小板装入冻存管后放入液氮中冷冻30分钟；

时间到后，从液氮中取出，使用37℃水浴溶解；

溶解完成后，将高倍浓缩血小板冰浴并使用超声波细胞破碎仪以20KHZ，超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟，作为一个循环流程；破碎循环执行3次（即3个循环流程），每次间隔2分钟，对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得到浓度为28×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图11所示。

对比例2

现有血小板外泌体的提取方法

取对比例1制得的高倍浓缩血小板，将PRP使用2000g、离心10分钟，去除细胞碎片，取上清去除沉淀，上清再使用10000g、离心10分钟去除微笑杂质，离心完成后取上清去除沉淀，在使用超速离心机100000g离心90分钟，得到外泌体，去除上清液，保留沉淀，沉淀即为外泌体，使用5mlPBS重悬，得到浓度为170×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图12所示。

对比例3

现有血小板外泌体的提取方法

采用实施例1的高倍浓缩血小板，将PRP使用2000g离心10分钟，去除细胞碎片，取上清去除沉淀，上清再使用10000g、离心10分钟去除微笑杂质，离心完成后取上清去除沉淀，在使用超速离心机100000g、离心90分钟，得到外泌体，去除上清液，保留沉淀，沉淀即为外泌体，使用5mlPBS重悬，得到浓度为59×10⁸/mL的高倍浓缩血小板外泌体，如图13所示。

二、检测试验结果分析

（一）、血小板浓度检测

实施例1至3中，实施例2中血小板制备时，血液样本离心力为500g，实施例1和2中血小板制备时，血液样本离心力为200g；

对比例1中，高倍浓缩血小板的制备，采用现有制备工艺，而高倍浓缩血小板外泌体的提取采用本发明提取工艺。

实施例1至3、对比例1所制备的高倍浓缩血小板悬液使用血球计数仪进行血小板浓度检测，检测结果，如表1及图3至7所示。

表1 各实施例、对比例中血小板浓度值表

由图表1及图3至7可知，不同离心力进行血小板的富集处理方式，以及不加血小板浓缩液的操作结果，测试结果可看出：

1）、实施例1和实施例3中，离心管中都添加有血小板浓缩液，获得血小板浓度为初始浓度的6倍以上；对比例1中，离心管中未添加血小板浓缩液，获得血小板浓度为初始浓度的2.3倍左右；因此，加入血小板浓缩液，可以防止血小板激活结团；

2）、实施例1、2和3中，离心管中都添加有血小板浓缩液；但是，实施例1和2中获得血小板浓度为初始浓度的6倍以上，实施例2中获得血小板浓度为初始浓度的2.5倍左右；这是由于实施例2中初始血液离心力（500g）远大于实施例1和实施例2中的初始血液离心力（200g）；离心力大，血小板被激活后很大一部分血小板沉淀底部，导致上层血浆中血细胞数量边上，使得计数结果低，血小板浓缩倍数也就变低。

总体而言，本发明高倍浓缩血小板的提取方法，比较传统PRP的提取方法效率更高，且效果明显，血小板浓度更高。

（二）、血小板外泌体浓度检测

实施例1至3、对比例1至3所制备的高倍浓缩血小板外泌体悬液使用纳米颗粒跟踪分析仪（制造商：德国PARTICLE METRIX公司；型号：Zeta View PMX-120）进行血小板外泌体浓度检测，检测结果，如表2及图8至13所示。图8至图13中，对应峰图为样本池内样本的检测结果，由仪器自行导出，并进行平滑处理。峰图对应面积表示为高倍浓缩血小板外泌体颗粒浓度。

Zeta View纳米颗粒跟踪分析仪检测参数如下：

1）样本参数：温度：随检测样本而定；pH值：7.0；样本稀释液：PBS; 其中：样本温度分别：实施例1为28.62℃；实施例2为31.41℃；实施例3为29.10℃；对比例1为31.98℃；对比例2为27.98℃；对比例3为31.78℃；

2）仪器参数：激光波长：488nm；过滤波长：散射。

表2 各实施例、对比例中血小板外泌体浓度值表

由表2及图8至13可知，血小板外泌体检测结果表明：

1）、实施例1、实施例3、对比例1至3中，实施例1和实施例3提取到的血小板外泌体浓度远超对比例1至3中提取到的血小板外泌体浓度；说明本发明血小板外泌体的提取方法效率高；

2）、实施例1至3中，实施例1和实施例3中提取到的血小板外泌体浓度远超实施例2中提取到的血小板外泌体浓度；这是由于实施例2中用于提取血小板外泌的初始血小板浓度过低造成；

3）实施例1和实施例3中，实施例3中提取到的血小板外泌体浓度（14000×10⁸/mL）为实施例1中提取到的血小板外泌体浓度（5000×10⁸/mL）的2.8倍；这是由于实施例1中高倍浓缩血小板装入冻存管后放入液氮中冷冻只有10分钟，降温的时间端，10分钟还不足够让血小板变脆，不利于后期对于血小板的破碎，故检测到高倍浓缩血小板外泌体浓度相对小。

应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种高浓度血小板外泌体的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

待高倍浓缩血小板完全溶解后，冰浴下对高倍浓缩血小板进行超声破碎；破碎结束后，得高倍浓缩血小板外泌体；

其中,所述高倍浓缩血小板采用如下步骤制得：

往所述15ml离心管中加入血小板浓缩液，上下颠倒混匀；

将所述15ml离心管离心1000g、10分钟，停止离心；

吸弃所述15ml离心管中上层血浆，保留底部悬液，并不断吹打悬液，获得高倍浓缩的血小板外泌体;

按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠1.82~2.52g、枸橼酸3.0~3.5g、枸橼酸钠25.93~27.1g、磷酸二氢钠1.80~2.42g、葡萄糖30.1~32.9g、腺嘌呤0.20~0.32g、人血白蛋白45~55ml、余量为无菌去离子水。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述血小板浓缩液的加入量为血浆体积的15~25%。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述血小板浓缩液的加入量为血浆体积的20%。

4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，按照每1000ml浓缩分离液总体积计算，所述血小板浓缩液组分包括: 乙二胺四乙酸钠2.02g、枸橼酸3.25g、枸橼酸钠26.1g、磷酸二氢钠1.98g、葡萄糖31.1g、腺嘌呤0.28g、人血白蛋白50ml、余量为无菌去离子水。

5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述冻存管放入液氮中冷冻30分钟。

6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述超声破碎步骤中，使用超声波细胞破碎仪对高倍浓缩血小板进行超声破碎，所述超声波细胞破碎仪的超声频率为20KHZ。

7.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，所述超声破碎步骤中，还包括工艺步骤：超声8秒、静止4秒，交替循环持续8分钟。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述超声破碎步骤中，还包括工艺步骤：破碎循环3次，每次间隔2分钟。