CN115029268A - 一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用。该委内瑞拉链霉菌为Streptomyces venezuelae S2‑2，该菌株对栝楼炭疽病菌有很好的抑制作用，可明显降低栝楼炭疽病菌的侵染，在离体试验中效果良好。该菌株可用于制备一种生物防治菌剂，应用于作物栝楼炭疽病害防治；另外，该菌株对其他植物病原菌也有较好的抑菌作用，包括茶炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌、无花果炭疽病菌、玉米穂腐病菌、水稻纹枯病菌和猕猴桃溃疡病菌等。相比于传统的化学防治手段，该委内瑞拉链霉菌能够安全、高效、无污染地进行植物病害防治，减少对生态环境的污染，提高农产品的质量安全，保障人类的健康。

Description

一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用
技术领域
本申请涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用。
背景技术
植物病害的发生严重影响作物的产量及其产品的品质。由于农业防治成本相对较高，现阶段防治主要仍以化学药剂防治为主，选育抗病品种为辅，而化学防治容易对环境造成污染，培育抗病品种周期长，病原菌变异快而导致植物抗病性减弱或丧失等原因也被人们所诟病。
栝楼又名瓜蒌，是葫芦科、栝楼属多年生攀缘型草本植物。它的果皮、根、茎是重要的中药材，籽是抢手的休闲食品，经济价值很高。我国华南、华中、西南、华东、华北地区均有分布。栝楼炭疽病在叶片、茎蔓、果实上均可为害，是栝楼生产中最严重的真菌性病害，严重时会导致栝楼减产乃至绝收，并影响品质。
目前化学防治仍然是控制栝楼炭疽病的主要手段，常规药剂有戊唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺、百菌清等。但随着这些药剂使用时间的延长，使得栝楼炭疽病菌对部分杀菌剂产生了一定抗药性，而且农药的残留已严重影响到栝楼的品质和消费者的健康。
生物防治近年来被认为是很有前景的一种防治途径。生物防治作为一种潜在的新的病害防治手段，就是利用生物物种间的相互作用，以一种或一类生物抑制另一种或另一类生物，从而对病害进行防控。通过这种防治手段，不会对环境造成不可逆的污染、安全性高，并且不会产生定向选择的作用而使病菌产生抗性，因此，寻找对环境友好的生物防治菌剂或高效低毒的化学药剂来防治栝楼炭疽病具有重要的实践和科学价值。
发明内容
鉴于化学防治手段在防治栝楼炭疽病害带来了一系列问题，诸如：栝楼炭疽病菌对杀菌剂产生抗药性、污染环境、影响消费者的健康等，而生物防治手段不会产生上述问题，因此，本申请主要目的在于提供一种全新的生物防治手段，应用于栝楼炭疽病害的防治。进一步地，本申请目的在于提供一种全新的应用于栝楼炭疽病害的生防菌剂，以解决或缓解上述技术问题。
第一方面，本申请实施例公开了一株委内瑞拉链霉菌，该菌株命名为Streptomyces venezuelae S2-2，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO:M2022389，保藏日期为2022年4月6日。
第二方面，本申请实施例公开了一种冻干管，所述冻干管包含第一方面所述的委内瑞拉链霉菌。
第三方面，本申请实施例公开了第二方面所述冻干管的制作方法，其步骤包括：
委内瑞拉链霉菌株的培养，离心，收集菌体；
制备含有保护剂的菌体混悬液；
将菌体混悬液在无菌环境中分装到已灭菌的冷冻管中，用液氮或干冰进行预冻；
将预冻好的菌体，放入真空冷冻干燥设备中进行冻干；
冻干管抽真空后，保存于-80℃超低温冰箱。
第四方面，本申请实施例公开了一种生物防治菌制剂，其包含第一方面所述委内瑞拉链霉菌，所述生物防治菌制剂应用于作物病害的防治。
第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述委内瑞拉链霉菌的筛选方法，其步骤包括：
菌株的分离和纯化；
拮抗菌株的筛选；
菌株抑菌谱测定；以及
拮抗菌株的鉴定。
进一步地，用于分离菌株的材料来源包括健康的栝楼植株、果实、种子及其根围土壤的至少一种。
进一步地，菌株的分离方法为稀释分离法。
进一步地，拮抗菌株的筛选方法为平板对峙法。
进一步地，委内瑞拉链霉菌的鉴定方法包括形态学特征及多基因序列分析鉴定。
第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述委内瑞拉链霉菌在作物病害防治的应用。
优选地，所述应用包括对栝楼炭疽病菌、茶炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌、无花果炭疽病菌、玉米穂腐病菌、水稻纹枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑制。
更优选地，所述应用包括栝楼炭疽病的防治。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请中涉及一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用，所述委内瑞拉链霉菌为Streptomyces venezuelae S2-2，所述委内瑞拉链霉菌对栝楼炭疽病菌有很好的抑制作用，可明显降低栝楼炭疽病菌的侵染，在离体试验中效果良好。所述委内瑞拉链霉菌可用于制备一种生物防治菌剂，应用于作物栝楼炭疽病害防治；另外，该菌株对其他植物病原菌也有较好的抑菌作用，包括茶炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌、无花果炭疽病菌、玉米穂腐病菌、水稻纹枯病菌和猕猴桃溃疡病菌等。相比于传统的化学防治手段，所述委内瑞拉链霉菌能够安全、高效、无污染地进行植物病害防治，减少对生态环境的污染，提高农产品的质量安全，保障人类的健康。
附图说明
图1为本申请实施例提供的拮抗菌株S2-2对栝楼炭疽病菌的菌丝生长抑制作用图；其中A为对照，B为菌株S2-2与栝楼炭疽病菌的平板对峙。
图2为本申请实施例提供的菌株S2-2的菌落、气生菌丝及孢子形态图；其中A为高氏1号培养基上的菌落形态，B为显微镜观察的气生菌丝形态，C为显微镜观察的孢子形态。
图3为本申请实施例提供的基于多基因序列对菌株S2-2及其近缘种构建的系统进化树。
图4为本申请实施例提供的菌株S2-2无菌滤液和高温处理滤液对栝楼炭疽病菌菌丝生长的抑制作用图；其中A为菌株S2-2发酵滤液对栝楼炭疽病菌丝生长的抑制作用图，B为高温灭菌后的菌株S2-2发酵滤液对栝楼炭疽病菌丝生长的抑制作用图。
图5为本申请实施例提供的菌株S2-2产真菌细胞壁裂解酶的测定结果图；其中A为产纤维素酶结果图，B为产β-1,3-葡聚糖酶结果图，C为产蛋白酶结果图，D为产几丁质酶结果图。
图6为本申请实施例提供的喷施S2-2菌悬液21天后对栝楼炭疽病的防治效果对比图；其中A为采用预防处理的栝楼症状图，B为接种栝楼炭疽病菌后的栝楼症状图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
实施例所用材料如下：
1、供试菌株：栝楼炭疽病菌(Colletotrichum fructicola)、甜瓜蔓枯病菌(Stagonosporopsis citrulli)、玉米穂腐病菌(Fusarium graminearum)、茶炭疽病菌(Colletotrichum fructicola)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、无花果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)。所有供试菌株均为安徽农业大学植物病理系分离和保存菌株。
2、供试培养基：PDA培养基(马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1.0L)，高氏合成1号培养基(可溶性淀粉20g，K2HPO40.5g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、KNO3 1g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂15g、蒸馏水1L)，小米浸汁培养基(小米10.0g，葡萄糖10.0g，蛋白胨3.0g，氯化钠2.5g，碳酸钙2.0g，蒸馏水1.0L)。
委内瑞拉链霉菌的筛选和鉴定
1、菌株的分离和纯化
采集健康的栝楼植株、果实、种子及其根围土壤，分别称取不同样品10g，经无菌研钵碾碎后，将不同组织样品和根围土放入盛有50mL无菌水的三角瓶中，180r·min-1振荡10min，获得不同样品的悬浮液；
采用稀释分离法将各悬浮液进行梯度稀释后，取100μL分别涂布在BPA平板上，然后放于28℃恒温培养箱中倒置培养；
待细菌和放线菌的菌落长出后，挑取形态特征不同的代表性单菌落，于BPA平板上划线纯化，然后保存于试管斜面备用。
2、拮抗菌的筛选
采用平板对峙法对获得的菌株进行拮抗病原菌的筛选。
初筛：将栝楼炭疽病菌的菌丝块接种于PDA平板活化培养3～4d，同时将纯化的菌株在BPA平板进行活化24～48h；
待菌株长好后，将栝楼炭疽病菌的菌丝块(Ф＝6mm)接种于PDA平板中央，然后用接种针将活化的细菌和放线菌点接于距离病原菌丝块2.5cm处，每皿点接4个菌株，3次重复，25℃黑暗培养，观察各平板病原菌的菌落生长情况，从中筛选出具有显著拮抗作用的菌株；
复筛：预先将栝楼炭疽病菌及初筛的拮抗菌株进行活化，然后在PDA平板中央接种已活化的栝楼炭疽病菌，在距离病原菌丝块2.5cm左右的一侧接种拮抗菌株，另一侧不接任何拮抗菌作为对照，每处理重复3次。置于25℃黑暗培养，48h后观测并记录结果。
抑制率计算方法：抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/(对照菌落半径-3mm)×100％。
3、菌株抑菌谱测定
真菌抑菌谱测定：采用平板对峙法，将目标病原真菌(甜瓜蔓枯病菌、玉米穂腐病菌、茶炭疽病菌、水稻纹枯病菌、无花果炭疽病菌)的菌丝块接种于PDA平板活化培养3～4d，同时将拮抗菌株在高氏合成1号平板进行活化24～48h。
待活化菌株长好后，将目标病原真菌的菌丝块(Ф＝6mm)分别接种于PDA平板中央，然后用接种针将活化的菌株点接于距离病原菌丝块2.5cm处，25℃黑暗培养，观察各平板病原菌的菌落生长情况。
细菌抑菌谱测定：将拮抗菌株接种于装有80mL高氏1号液体培养基的三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养3d，制成种子液；
再按10％的接种量接入装有80mL小米浸汁培养液的三角瓶中，在上述条件下振荡培养6d，于4℃、10000r/min条件下离心20min，用0.22μm微孔滤器过滤，所得上清液即为无菌发酵滤液；
采用琼脂扩散法测定发酵滤液对3种病原细菌(番茄青枯病菌、猕猴桃溃疡病菌、水稻白叶枯病菌)的抑菌活性。
4、拮抗菌株的鉴定
4.1细菌形态学与生理生化试验
将筛选获得的广谱强拮抗菌株接种至高氏1号培养基上，37℃培养24h，初步观察菌落形态特征；再将菌株分别接种到ISP1、ISP2、ISP4、ISP6和ISP7培养基上，28℃培养7～15d，观察其培养特征，包括生长情况、气生菌丝颜色、基内菌丝颜色、孢子丝特征和有无可溶性色素产生等。对照《链霉菌鉴定手册》和《植物病原细菌的分类和鉴定》的方法进行拮抗菌S2-2的培养特性测定。
4.2分子鉴定
采用CTAB法提取前述链霉菌基因组DNA，选取4个看家基因gyrB、recA、rpoB和trpB，以及16S rRNA作为目的位点。各目的基因PCR扩增的条件参照Guo等的方法，扩增后取5μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，选择条带明亮清晰无杂带且与所扩基因片段长度相同的扩增产物送至测序公司(擎科)测序。
使用DNAstar软件对获得的序列进行分析和校对，将校对的序列放入NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行BLAST比对，明确与测试菌株序列同源性高的参考菌株及其物种地位，并在GenBank下载该种链霉菌相关或相近的参考序列。
使用MEGA7.0软件将参考菌株和自测菌株各个基因的序列分别进行比对，切除两端杂乱序列，再按gyrB、recA、rpoB、trpB基因序列，与16S rRNA序列按顺序依次连接，采用最大似然法构建系统发育树，以自展法进行检测，循环1000次，构建链霉菌代表性菌株的多基因系统发育树，确定前述拮抗菌株的分类地位。
5、结果
5.1拮抗菌株的分离和筛选
从植物组织内和根围土壤中共分离获得178株细菌，经初筛得到23株细菌对栝楼炭疽病菌的菌丝生长均有抑制作用。初筛出抑菌带宽大于5mm的菌株23株用于复筛。复筛结果如图1所示，此类菌株(命名为S2-2)拮抗效果最好，其抑菌率可达到71.88％，对栝楼炭疽病菌的生长具有抑制作用，最终挑选抑菌带宽最大、抑菌效果最好的菌株S2-2，用于分类鉴定及抑菌谱和防效测定。
5.2拮抗菌株S2-2对其他病原菌的抑制作用
试验结果表明，菌株S2-2对5种病原真菌均表现出较好的抑制效果，其中，该菌株对茶炭疽病菌抑制效果最好，抑菌率高达88.9％，对玉米穗腐病菌抑制效果最小，抑菌率为50.6％；在供试的病原细菌中对猕猴桃溃疡病菌和水稻白叶枯病菌均有抑制作用，在菌株S2-2发酵滤液的周边出现明显的抑菌圈。
5.3拮抗菌株S2-2的鉴定
5.3.1形态特征与培养特征观察
如图2所示，菌株接种至高氏1号培养基上(A)，气生菌丝初为银灰色，后逐渐转变为黄白色，基内菌丝为浅污黄色，有可溶性色素产生(B)。在显微镜下观察，孢子丝直有不规则弯曲(C)，孢子为卵圆至长圆形。
5.3.2多基因序列分析
PCR扩增获得菌株S2-2的4个看家基因gyrB、recA、rpoB、trpB基因与16S rRNA片段；对菌株S2-2五个目的基因的BLAST同源序列分析，发现5个位点序列分别与Streptomyces venezuelae(CP029196.1、CP013129.1、CP029194.1、CP029194.1、CP029194.1)的序列同源性分别为96.14％、97.32％、97.88％、95.85％、99.86％。
按gyrB、recA、rpoB、trpB基因序列，与16S rRNA序列拼顺序依次连接，采用最大似然法构建系统发育树，以自展法进行检测，循环1000次，如图3所示，构建链霉菌代表性菌株的多基因系统发育树，结果表明，菌株S2-2与参考菌株S.venezuelae ATCC 15068以自举值68％聚在一起。
结合菌株S2-2的形态和培养特征，最终将菌株S2-2鉴定为委内瑞拉链霉菌Streptomyces venezuelae S2-2。
委内瑞拉链霉菌拮抗菌株的抑菌活性研究
1、拮抗菌无菌滤液对栝楼炭疽病菌菌丝生长的抑制作用
采用菌丝生长速率法测定菌株Streptomyces venezuelae S2-2(后简称“S2-2”)对栝楼炭疽病菌的抑制作用。将拮抗菌株S2-2接种于高氏1号平板上，将菌株S2-2取5个直径为6mm的菌饼接种于装有80mL高氏1号液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min条件下振荡培养3d制成种子液，再按10％的接种量接入装有80mL小米浸汁培养液的250mL三角瓶中，在上述条件下振荡培养6d，于4℃、10000r/min条件下离心20min，用0.22μm微孔滤器过滤，所得上清液即为无菌发酵滤液。
将获得的无菌滤液与50℃左右的PDA液体培养基以1：9比例混合倒平板。在含有无菌滤液的PDA平板中央，将目标病原真菌的菌丝块(Ф＝6mm)置于PDA平板中央。同时设CK对照组，以无菌高氏合成1号液体培养基与PDA培养基混合制成平板，然后于平板中央接种目标病原菌。每个处理设3个重复，将接种病原真菌的平板放于25℃培养箱中培养5～6d，观察拮抗菌的代谢产物对目标病原菌菌丝生长的影响。
2、灭菌代谢液对栝楼炭疽病菌菌丝生长的抑制作用
将拮抗菌株S2-2的发酵液在121℃条件下高温灭菌20min，得到拮抗菌株的灭菌代谢液。将5mL的灭菌代谢液加入至45mL PDA培养基中混匀，倒平板。然后在所倒的平板中央，将直径为6mm的病原真菌菌丝块一面与培养基贴合。同时设CK对照组，以5mL液体培养基与45mL PDA培养基混合倒平板，并在平板中央接种目标真菌。每个处理设3个重复。将接种病原真菌的平板放于25℃培养箱中培养5～6d，观察拮抗菌的灭菌代谢液对目标病原菌菌丝生长的影响。
3、挥发性物质对栝楼炭疽病菌菌丝生长的影响
为了研究菌株S2-2产生的挥发性物质是否对栝楼炭疽病病菌菌丝生长具有抑制作用，本实验采用平板倒扣法测定，准备两个平板，将菌株发酵液涂板设为1，将新鲜培养的栝楼炭疽病病原菌接种于平板2，将两板密封对扣培养数日，以未经过菌株发酵液涂板的高氏1号平板为空白对照，待空白对照长至平板3/4时，观察其对栝楼炭疽病菌菌丝生长的影响。
4、蛋白酶K处理发酵滤液对栝楼炭疽病菌菌丝生长的抑制作用
将蛋白酶K加入菌株S2-2无菌发酵滤液中，使得蛋白酶在发酵滤液中的最终浓度为20mg/ml，再将混合液经过37℃水浴1h；然后将含有蛋白酶的发酵液以10％的含量加入到PDA培养基中，每组三次重复，并在平板中央接种目标真菌，将接种病原真菌的平板放于25℃培养箱中培养5～6d，测量其菌落直径记录数据、拍照并算出抑菌率。
5、产真菌细胞壁裂解酶特性测定
采用平板透明圈法对供试菌株产细胞壁裂解酶(β-1，3-葡聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶和几丁质酶)的活性进行检测。
6、结果
6.1菌株S2-2发酵滤液和高温处理发酵滤液对栝楼炭疽病菌的抑制作用
如图4所示，拮抗菌株S2-2的发酵滤液对栝楼炭疽病菌的菌丝生长有明显的抑制作用，其抑制率为60.8％。然而，高温处理拮抗菌株的发酵滤液后，其代谢产物对供试病原菌的菌丝生长失去抑制活性，这表明抑菌物质不耐高温。
6.2挥发性物质对栝楼炭疽病菌菌丝生长的影响
实验结果表明，经挥发性物质作用的菌丝抑制率为8.47％，远低于发酵滤液对菌丝生长的抑制率，这表明挥发性物质抑制效果不明显。
6.3菌株S2-2产真菌细胞壁裂解酶的检测
真菌细胞壁裂解酶活性的检测结果如图5所示，纤维素酶(A)、β-1，3-葡聚糖酶(B)和蛋白酶(C)的检测平板中，菌株S2-2的菌体周围产生明显透明圈，而在几丁质酶检测平板(D)中，菌体周围未见透明圈或晕圈出现，表明菌株S2-2能产生纤维素酶、β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶，而不能产生几丁质酶；这说明拮抗菌株S2-2可以产生蛋白酶类物质，裂解蛋白类大分子化合物可能是该菌株抑制病菌菌丝生长的原因之一。
菌株S2-2对栝楼炭疽病的防效测定
选取大小、成熟度相同的“皖蒌9号”栝楼果实，自来水冲洗干净后，用75％酒精进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次。
菌株S2-2对栝楼炭疽病室内防效测定共设4个处理，包括：
处理1：在每个果实正反面两面的中间位置用灭菌的大头针扎三个点，用干净棉花擦去伤口胶渍，然后喷洒S2-2菌悬液(108cfu·mL-1)至表面湿润，置于25℃恒温气候箱，盖保鲜膜培养24h。然后用6mm打孔器在纯化好的栝楼炭疽病菌边缘打孔，将菌丝块贴在伤口上，置于25℃恒温气候箱，覆盖保鲜膜培养，21d后调查发病程度。
处理2：先接种炭疽病菌、过24h后用菌株S2-2的菌悬液处理，其余操作同处理1。
处理3：先喷施75％百菌清可湿性粉剂600倍液(浙江威原天盛作物科技有限公司)至果实表面湿润，晾干后再接种炭疽病菌。
处理4：以无菌水代替S2-2菌悬液作为对照。
结果：在栝楼离体果实接种试验中，如表1中所示，对照处理的栝楼接种炭疽病菌7d后开始发病，21d时病情指数达到19.15，百菌清处理的病情指数为3.66，S2-2菌悬液(预防)处理的为1.19，菌株S2-2(预防)处理对瓜蒌炭疽病的防治效果达到93.79％，75％百菌清处理为80.89％。
在菌株S2-2对栝楼炭疽病的治疗和预防效果比较试验中，先用菌株S2-2处理、后接种炭疽病菌的栝楼果实，图6所示的是喷施S2-2菌悬液21d后对栝楼炭疽病的防治效果图，其中A为采用预防处理的栝楼症状，B为接种栝楼炭疽病菌后治疗的栝楼症状。在接菌第7d时仍未发病，预防效果达到100％；先接种炭疽病菌、后用菌株S2-2处理栝楼果实，在接种第21d时病情指数为5.56，治疗效果达到70.97％。以上结果说明四种处理中，预防处理喷施生防菌S2-2的防治效果最好。
表1
处理 病情指数 防治效果(％)
菌悬液(预防) 1.19±0.46 93.79
菌悬液(治疗) 5.56±0.83 70.97
75％百菌清 3.66±0.73 80.89
对照 19.15±2.09 /
综上所述，本申请公开了一株委内瑞拉链霉菌及其在防治作物病害的应用。所述委内瑞拉链霉菌命名为Streptomyces venezuelae S2-2，所述委内瑞拉链霉菌对栝楼炭疽病菌有很好的抑制作用，可明显降低栝楼炭疽病菌的侵染；同时，该菌株对其他植物病原菌也有较好的抑菌作用，包括茶炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌、无花果炭疽病菌、玉米穂腐病菌、水稻纹枯病菌和猕猴桃溃疡病菌等。相比于传统的化学防治，所述委内瑞拉链霉菌能够安全、高效、无污染地进行植物病害防治，减少对生态环境的污染，提高农产品的质量安全，保障人类的健康。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株委内瑞拉链霉菌，该菌株命名为Streptomyces venezuelae S2-2，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCCNO:M 2022389，保藏日期为2022年4月6日。
2.一种冻干管，其包含权利要求1所述的委内瑞拉链霉菌。
3.权利要求2所述冻干管的制作方法，其步骤包括：
委内瑞拉链霉菌株的培养、菌体收集；
制备含有保护剂的菌体混悬液；
将菌体混悬液在无菌环境中分装到已灭菌的冷冻管中，用液氮或干冰进行预冻；
将预冻好的菌体，放入真空冷冻干燥设备中进行冻干；
冻干管抽真空后，保存于-80℃冰箱。
4.一种生防菌制剂，其包含权利要求1所述委内瑞拉链霉菌，所述生防菌制剂应用于作物病害的防治。
5.权利要求1所述委内瑞拉链霉菌的筛选方法，其步骤包括：
菌株的分离和纯化；
拮抗菌株的筛选；
菌株抑菌谱测定；以及
拮抗菌株的鉴定。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其中用于分离菌株的材料来源包括健康的栝楼植株、果实、种子及其根围土壤的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的筛选方法，其中菌株的分离方法为稀释分离法。
8.根据权利7所述的筛选方法，其中委内瑞拉链霉菌的鉴定方法包括形态学特征及多基因序列分析。
9.权利要求1所述委内瑞拉链霉菌在作物病害防治的应用，其包括对栝楼炭疽病菌、茶炭疽病菌、甜瓜蔓枯病菌、无花果炭疽病菌、玉米穂腐病菌、水稻纹枯病菌和猕猴桃溃疡病菌的抑制。
10.权利要求9所述的应用，其包括栝楼炭疽病的防治。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952362A (zh) * 2014-05-14 2014-07-30 浙江省柑桔研究所 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌
WO2016001125A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
CN108552225A (zh) * 2018-05-31 2018-09-21 佛山市陵谐环保科技有限公司 一种生物农药的制备方法
CN109207412A (zh) * 2018-11-12 2019-01-15 沈阳化工研究院有限公司 一种抗青枯病生防菌株及其应用
CN110760454A (zh) * 2018-07-26 2020-02-07 中国石油化工股份有限公司 一种委内瑞拉链霉菌及其鉴定方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952362A (zh) * 2014-05-14 2014-07-30 浙江省柑桔研究所 一株对多种植物病原菌具抑菌活性的柑橘内生放线菌
WO2016001125A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
CN108552225A (zh) * 2018-05-31 2018-09-21 佛山市陵谐环保科技有限公司 一种生物农药的制备方法
CN110760454A (zh) * 2018-07-26 2020-02-07 中国石油化工股份有限公司 一种委内瑞拉链霉菌及其鉴定方法和应用
CN109207412A (zh) * 2018-11-12 2019-01-15 沈阳化工研究院有限公司 一种抗青枯病生防菌株及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARGARET C M SMITH ET AL.: ""Evolutionary relationships among actinophages and a putative adaptation for growth in Streptomyces spp"", 《J BACTERIOL》, vol. 195, no. 21, pages 4924 - 4935 *
熊瑶瑶 等: ""3株拮抗内生放线菌的鉴定及其抑菌活性初步研究"", 《江西师范大学学报(自然科学版)》, vol. 39, no. 02, pages 171 - 176 *

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