CN115025075B

CN115025075B - Fk3的药物新用途

Info

Publication number: CN115025075B
Application number: CN202110248973.7A
Authority: CN
Inventors: 李玉婷; 刘永祥; 杨洋; 谢复开; 王桂香
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2021-03-08
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2041-03-08
Also published as: CN115025075A

Abstract

本发明公开了式Ⅰ所示FK3的药物新用途，包括下述(b1)‑(b6)中至少一种：(a1)制备促进神经干细胞增殖的产品；(a2)制备促进神经干细胞分化的产品；(a3)制备逆转酒精造成的神经干细胞自我更新能力的抑制的产品；(a4)制备逆转酒精对神经干细胞造成的伤害的产品；(a5)制备用于预防和/或治疗由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病的产品；(a6)制备用于预防和/或治疗神经退行性疾病的产品。本发明的发明人从大量的化合物中筛选出FK3化合物，与现有促神经发生化合物相比，具有更小的EC50，更大的在体安全性，更强的促进神经干细胞增殖与分化的作用，并且可以显著逆转酒精对脑神经造成的伤害。

Description

FK3的药物新用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及FK3的药物新用途。

背景技术

成体神经发生受到物理、化学、病理、药理等因素的影响，如衰老、乙醇、运动、抗抑郁药和中风等，这也是成体神经发生的特点之一。自主跑步能增加成年海马中细胞的增殖，丰富的环境则有利于新生神经元的存活。据文献报道以及本课题组前期研究结果表明急性大剂量的摄入酒精对海马脑区的细胞增殖具有抑制作用[1]。黄酮类衍生物7，8-二羟基黄铜(7，8-DHF)和姜黄素(Curcumin)可能作为神经营养因子选择性的激动TrkB受体来对海马脑区的神经发生起到促进作用[2,3]。学习记忆对海马神经发生的调控取决于学习的模式和新生细胞的成熟程度[4,5]。癫痫患者脑中SGZ增殖细胞增多，但是新生神经元的连接和迁移显示异常。中风可以诱导神经元的生成和迁移，但是迁移到病灶的神经元由于缺乏营养和保护大部分无法存活。

神经退行性疾病与神经发生的关系及其复杂，一方面在神经退行性疾病中由原病灶的小胶质细胞、星形胶质细胞和外周巨噬细胞过多释放的细胞因子、趋化因子、神经递质和活性氧对神经发生存在影响[6]。另一方面神经干细胞在合理的诱导和保护下形成的胶质细胞和神经元对神经退行性疾病的病灶区可能存在改善作用[7]。目前我们对中枢神经系统退行性疾病如阿尔茨海默(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森综合征(Parkinson’sdisease，PD)等的研究仍然亟待深入。研究表明，在AD患者中存在神经纤维缠结和淀粉样蛋白沉积等病理特征，但是它们和AD患者的痴呆呈度呈现微弱的相关性[8]。Gage课题组研究发现，通过BDNF提高神经发生水平后，AD模型的小鼠学习和认知得到改善[9]。Murer等人发现BDNF水平与神经纤维缠结呈现负相关[10]。PD作为第二大神经退行性疾，其黑质多巴胺能神经元的丢失导致多巴胺递质减少，表现为运动控制中断[11,12]，提高神经发生的水平对PD的症状有所改善。

黄酮类(Flavonoids)化合物一般作为次级代谢产物，广泛存在于多种植物中，不仅数量和种类繁多，而且结构复杂。黄酮类化合物是以苯并吡喃环为母核的2-苯基色原酮化合物如图Fig1.1A所示，根据结构不同可分为黄酮、黄烷酮、查尔酮、橙酮、黄烷醇等[13]。正是由于其结构的多样性而对哺乳动物以及其他细胞呈现出多种活性，如中枢神经保护活性、消除自由基抗氧化活性、肿瘤抑制活性等。尤其是中枢神经系统保护作用引起了广泛重视，对黄酮类化合物以及根据中枢神经系统特定的靶点设计合成的类黄酮化合物(Bioflavonoid)药物的筛选研究无疑潜力巨大。

以神经系统退行性疾病和精神疾病为代表的中枢系统疾病已经为我国乃至世界带来巨大社会和经济影响。脑部疾病由于其病理状态的特殊性，手术治疗应用十分有限，药物治疗也仅仅是缓解症状。虽然我们已经发现了大量化合物，但是对于中枢神经系统的治疗来说，能否跨过血脑屏障(The blood-brain barrier BBB)是大部分化合物都面临的巨大挑战。黄酮类化合物由于其能作用于中枢神经系统的受体和酶，因此，对中枢神经系统疾病的治疗有一定的优势[14]。

参考文献

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3.Namgyal,D.,et al.,The neuroprotective effect of curcumin againstCd-induced neurotoxicity and hippocampal neurogenesis promotion through CREB-BDNF signaling pathway.Toxicology,2020.442:p.152542.

4.Drapeau,E.,et al.,Learning-induced survival of new neurons dependson the cognitive status of aged rats.J Neurosci,2007.27(22):p.6037-44.

5.Mouret,A.,et al.,Learning and survival of newly generated neurons:when time matters.J Neurosci,2008.28(45):p.11511-6.

6.Winner,B.,Z.Kohl,and F.H.Gage,Neurodegenerative disease and adultneurogenesis.Eur J Neurosci,2011.33(6):p.1139-51.

7.Gallarda,B.W.and P.M.Lledo,Adult neurogenesis in the olfactorysystem and neurodegenerative disease.Curr Mol Med,2012.12(10):p.1253-60.

8.Berg,L.,et al.,Clinicopathologic studies in cognitively healthyaging and Alzheimer's disease:relation of histologic markers to dementiaseverity,age,sex,and apolipoprotein E genotype.Arch Neurol,1998.55(3):p.326-35.

9.Choi,S.H.,et al.,Combined adult neurogenesis and BDNF mimicexercise effects on cognition in an Alzheimer's mouse model.Science,2018.361(6406).

10.Murer,M.G.,et al.,An immunohistochemical study of the distributionof brain-derived neurotrophic factor in the adult human brain,with particularreference to Alzheimer's disease.Neuroscience,1999.88(4):p.1015-32.

11.Tysnes,O.B.and A.Storstein,Epidemiology of Parkinson's disease.JNeural Transm(Vienna),2017.124(8):p.901-905.

12.de Lau,L.M.and M.M.Breteler,Epidemiology of Parkinson'sdisease.Lancet Neurol,2006.5(6):p.525-35.

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14.Bavin,P.M.,et al.,Compounds affecting the central nervoussystem.V.Substituted 3-dialkylaminoalkylindenes.J Med Chem,1969.12(3):p.513-6.

发明内容

本发明的目的是提供一种FK3化合物的药物新用途。

所述FK3化合物，其结构式如式Ⅰ所示：

第一方面，本发明所提供的FK3化合物的药物新用途为下述(a1)-(a6)中至少一种：

(a1)FK3或其药学上可接受的盐在制备促进神经干细胞增殖的产品中的应用；

(a2)FK3或其药学上可接受的盐在制备促进神经干细胞分化的产品中的应用；

(a3)FK3或其药学上可接受的盐在制备逆转乙醇造成的神经干细胞自我更新能力的抑制的产品中的应用；

(a4)FK3或其药学上可接受的盐在制备逆转乙醇对神经干细胞分化形成成熟神经元造成的损伤的产品中的应用；

(a5)FK3或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病的产品中的应用；

(a6)FK3或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗神经退行性疾病的产品中的应用；

(a7)FK3或其药学上可接受的盐在制备抗衰老产品中的应用。

第二方面，本发明所提供的FK3化合物的药物新用途为下述(b1)-(b7)中至少一种：

(b1)FK3或其药学上可接受的盐在促进神经干细胞增殖中的应用；

(b2)FK3或其药学上可接受的盐在促进神经干细胞分化中的应用；

(b3)FK3或其药学上可接受的盐在逆转酒精造成的神经干细胞自我更新能力的抑制中的应用；

(b4)FK3或其药学上可接受的盐在逆转酒精对神经干细胞造成的伤害中的应用；

(b5)FK3或其药学上可接受的盐在预防和/或治疗由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病中的应用；

(b6)FK3或其药学上可接受的盐在预防和/或治疗神经退行性疾病中的应用。

(b7)FK3或其药学上可接受的盐在抗衰老中的应用。

第三方面，本发明还要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，其活性成分为FK3或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：

(c1)促进神经干细胞增殖；

(c2)促进神经干细胞分化；

(c3)逆转酒精造成的神经干细胞自我更新能力的抑制；

(c4)逆转酒精对神经干细胞分化成成熟神经元造成的损伤；

(c5)预防和/或治疗由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病；

(c6)预防和/或治疗神经退行性疾病；

(c7)抗衰老。

第四方面，本发明还保护一种体外培养神经干细胞的方法。

本发明所保护的体外培养神经干细胞的方法，包括在含神经干细胞的培养基中加入FK3或其药学上可接受的盐。

所述FK3或其药学上可接受的盐在所述培养基中的终浓度可为0.1μΜ-1μΜ。

第五方面，本发明还保护一种体外促进神经干细胞增殖的方法。

本发明所保护的体外促进神经干细胞增殖的方法，包括用FK3或其药学上可接受的盐与神经干细胞共培养。

本发明中，所述神经干细胞分化具体可分化为神经元和/或星形胶质细胞。

本发明中，所述由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病包括乙醇脑损伤、成瘾药物成瘾、衰老、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森综合征(Parkinson’s disease，PD)、自闭综合征、神经分裂症、抑郁症、癫痫。

本发明中，所述抗衰老可通过逆转衰老对神经干细胞激活及分化的抑制作用而实现。

本发明中，所述产品可为药物或药物制剂。

本发明所述产品除含有FK3或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂，以及包含其他起配伍协同作用的有效成分。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明的发明人从大量的化合物中筛选出FK3化合物，该化合物系黄酮类小分子化合物，与现有促神经发生化合物相比，具有更小的EC50，更大的在体安全性，更强的促进神经干细胞增殖与分化的作用，并且可以显著逆转酒精对脑神经造成的伤害。

附图说明

图1为FK3剂量依赖性增加体外神经球形成；(A-B)不同浓度FK3处理的神经球的代表性图像和统计分析；(C)FK3的浓度-效应曲线；(D)FK1处理后神经球形成没有增加。比例尺＝100μm。数值代表平均值±标准差(n＝12，**P<0.01，**P<0.001；One-way ANOVA分析)；图中Veh:是Vehicle，代表对照品，这里是指与FK3处理组中相同浓度DMSO。

图2为FK3逆转酒精对神经干细胞自我增殖能力抑制作用。(A)图中所示为免疫荧光代表图，Nestin为神经干细胞标记物，用绿色荧光标记；Ki67为增殖细胞标记物，用红色荧光标记；DAPI为细胞核标记物，用蓝色荧光标记。标尺为100μm。(B-C)计算比较乙醇与对照组相比神经干细胞Nestin⁺与激活型神经干细胞Nestin⁺Ki67⁺在培养细胞中DAPI⁺所占比例的改变情况，每组柱形图中从左到右依次为Veh、0.1μM FK1、0.1μM FK3、5μM DHF。(D)计算比较乙醇与对照组相比，激活型神经干细胞Nestin⁺Ki67⁺在神经干细胞Nestin⁺所占比例的改变情况。数值为mean±S.E.M.(n＝9,**p<0.01,***p<0.001；##p<0.01，###p<0.01；One-way ANOVA).

图3为体外原代培养神经干细胞分化成神经元情况。图中所示为免疫荧光代表图，Tuj1为神经元标记物，用绿色荧光标记；DAPI为细胞核标记物，用蓝色荧光标记。标尺为25μm.。

图4为体外原代培养神经干细胞分化成星型胶质细胞情况。图中所示为免疫荧光代表图，GFAP为星型胶质细胞标记物，用绿色荧光标记；DAPI为细胞核标记物，用蓝色荧光标记。标尺为25μm。

图5为FK3对50周龄NestinCreER^T2::Ai14-tdTomato转基因小鼠海马神经干细胞增殖与分化的影响。GFAP为类神经胶质细胞及干细胞标志物，用绿色荧光标记；Tomato为成熟神经元，显红色；MCM2为神经细胞增殖标记物，用白色荧光标记；DAPI为细胞核标记物，用蓝色荧光标记。标尺：100μm。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、化合物FK1和FK3的制备

取一洁净干燥150mL烧瓶，加入邻溴代苯甲醛1(10.0mmol)、双三苯基膦二氯化钯(0.2mmol)和碘化亚铜(0.1mmol)溶解在无水无氧的THF(50mL)中，密封后氮气保护，搅拌至固体溶解，氮气环境下注射无水无氧三乙胺(50.0mmol)和三甲基乙炔基硅烷(20.0mmol)，室温下溶液剧烈搅拌12h，直至底物反应完全，干燥硅藻土过滤反应液，滤液除去溶剂后使用硅胶的快速柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚体系展开剂)得到目标中间体2。

取一洁净干燥150mL烧瓶，加入中间体2(10mmol)和原甲酸三甲酯(20mmol)溶解在无水甲醇(50mL)中，搅拌至固体溶解，加入一水合对甲苯磺酸(0.1mmol)密闭后室温下剧烈搅拌5h，直至底物完全转化，随后向溶液中加入碳酸钾(50mmol)剧烈搅拌1h，直至中间体完全转化，干燥硅藻土过滤反应液，滤液除去溶剂后使用硅胶的快速柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚体系展开剂)得到目标中间体3。

中间体3的结构鉴定数据如下：

黄色油状物(1.60g)91％收率:Rf＝0.4(EtOAc/石油醚＝1:100，v/v)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.60(d,J＝7.7Hz,1H),7.52(d,J＝7.6Hz,1H),7.38(td,J＝7.6,0.9Hz,1H),7.29(td,J＝7.5,1.2Hz,1H),5.72(s,1H),3.39(s,6H),3.33(s,1H).

取一洁净干燥150mL烧瓶，加入中间体3(5mmol)，溶解在无水四氢呋喃(50mL)中，密封后氮气保护，置于-78℃搅拌，逐滴加入正丁基锂溶液(2.5M in hexane,2.0mL)，在-78℃下继续搅拌1h，随后逐滴加入苯甲醛(5.0mmol，用于制备FK1)或对氯苯甲醛(5.0mmol，用于制备FK3)的四氢呋喃溶液，移至室温搅拌3h，直至底物完全转化，使用饱和氯化铵溶液将反应液淬灭，使用乙酸乙酯萃取水相三次，将有机相合并后水洗(60mL)一次，饱和食盐水洗(60mL)二次，有机相使用无水硫酸钠干燥，移除溶剂。

取一洁净干燥100mL烧瓶，加入上述粗产品，溶解在二氯甲烷中(30mL)，分二次加入活性二氧化锰(25.0mmol)，室温下搅拌12h，直至底物完全转化，干燥硅藻土过滤反应液，滤液除去溶剂后使用硅胶的快速柱层析分离(乙酸乙酯/石油醚体系展开剂)得到目标产物FK1或FK3。

黄色油状物(981mg)70％收率:Rf＝0.4(EtOAc/石油醚＝1:10，v/v)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36–8.17(m,2H),7.73–7.67(m,2H),7.64(t,J＝7.4Hz,1H),7.56–7.48(m,3H),7.40(td,J＝7.6,1.0Hz,1H),5.76(s,1H),3.43(s,6H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ178.1,141.6,137.2,134.3,134.1,130.8,129.8,128.82,128.80,126.9,119.1,102.2,91.3,90.5,54.2；IR(thin film,cm^-1)2988,2933,2830,2198,1640,1599,1492,1449,1365,1174,1009,763,700；HRMS(ESI):m/z Calcd.for C₁₈H₁₆O₃Na[M+Na]+303.0992,Found303.0995.

白色固体(1.35g)86％收率:Rf＝0.4(EtOAc/石油醚＝1:10，v/v)；Mp 55.6–57.3℃；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.27–8.16(m,2H),7.70(t,J＝7.2Hz,2H),7.53–7.47(m,3H),7.40(td,J＝7.6,1.0Hz,1H),5.73(s,1H),3.41(s,6H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.8,141.6,140.9,135.6,134.3,131.2,130.9,129.1,128.8,127.1,118.8,101.9,91.1,91.0,53.9；IR(thin film,cm-1)2934,2830,2197,1638,1586,1490,1447,1400,1365,1078,1050,1007,757,741；HRMS(ESI):m/z Calcd.for C₁₈H₁₅ClO₃Na[M+Na]+337.0602,Found337.0604.

实施例2、FK3化合物促进神经干细胞增殖与分化

1.实验试剂与抗体

1.1实验试剂

1.2实验抗体

2.实验方法

2.1神经干细胞培养液配制

(1)解剖液(Dissection solution,DS)：

CaCl₂ 1.26mM，MgCl₂-6H₂O 0.49mM，MgSO₄-7H₂O 0.41mM，KCl 5.330mM，KH₂PO₄0.44mM，NaHCO₃ 4.17mM，NaCl 137mM，Na₂HPO₄ 0.33mM，D-(+)-Glucose 10mM。

(2)培养液母液(SFM)

(3)消化液1mL(dissociation buffer,DB)：

0.5mL SFM+0.5mL L-15medium+DnaseI 0.2％

(4)增殖培养基(Proliferative Serum Free Medium，pSFM)

(5)分化培养基(Differentiation Serum Free Medium,dSFM)

2.2神经干细胞的培养

(1)神经干细胞的提取与培养

(a)将小鼠脱颈椎处死后立刻取出脑放于含有解剖液的培养皿中。

(b)在解剖显微镜下剥离小鼠的SVZ和SGZ脑区组织，用显微镊将其剪碎。

(c)用1mL的移液枪吸到预冷的含有解剖液的15mL的锥型管中，将锥型管外壁消毒移于超净台。

(d)将解剖液吸出，而后加入200μL Accutase Solution，37℃，消化8min。

(e)将Accutase Solution吸出加入250μL消化液用移液枪充分吹打，然后补加800μl SFM吹打均匀。

(f)用70μm孔径滤网过滤。

(g)500g离心6min，弃去上清。

(h)加20μL SFM充分吹打，再加入800μL SFM吹打均匀，接种细胞。

(i)在37℃，5％CO₂ 95％空气的条件下，神经干细胞在pSFM培液中原代神经球培养7-10天。

(2)神经干细胞的传代

(a)将细胞收于离心管。

(b)500g离心6min,弃去上清。

(c)加入200μL Accutase，37℃，消化8min。

(d)吸去Accutase加入500μL SFM吹打均匀。

(e)500g离心6min，吸去上清。

(f)加入200μL SFM用移液枪充分吹打，再加入800μL SFM将细胞吹打均匀。

(g)以1×10⁵cell/mL的密度接种于6孔板，37℃，5％CO₂在pSFM培养液中培养3天后可再次传代。

(3)神经干细胞的冻存与复苏

(a)将SFM(不包含EGF，FGF)：DMSO按照9：1(v/v)配制冻存液。收集细胞与锥型管，200g离心5min，加入冻存液，将细胞轻柔的吹打，重悬细胞。按照1.5ml每管放于冻存管，冻存盒于-80℃过夜，液氮中长期保存。

(b)神经干细胞的复苏，将细胞于39℃水浴中使其融化。200g离心5min，弃去上清。加入SFM轻柔吹打，使其重悬，接种于6孔板，37℃，5％CO₂培养3天可传代。

(4)神经干细胞球培养

在神经球增殖的体外实验中，以1000cell/孔接种于96孔板中，6h后加入FK3或FK1(最终浓度为0,0.001,0.003,0.01,0.03,0.1,0.3,1,3,10μM)及溶剂对照组培养3天后可考察对神经球增殖的影响。

(5)神经干细胞的贴壁培养

(a)用于贴壁培养的细胞一般需传代3代以上。接种细胞前8h用100μg/ml PLL(多聚L-赖氨酸)或PDL(多聚D-赖氨酸)，5μg/ml Laminin(层粘连蛋白)包被液于24孔板中包被爬片。室温下6-8h后用PBS充分清洗爬片4次，充分吹干后备用。

(b)其余步骤同1.2(2)神经干细胞传代，接种的细胞密度为2.5×10⁴cell/孔，增殖实验于6h后加入FK3或FK1(0,0.1μM)培养3天后可进行免疫荧光实验。

(6)神经干细胞的诱导分化

贴壁培养第1～2天仍采用pSFM，视细胞密度延长该培养时间，之后更换为dSFM。每3天更换液一次。分化培养14天，可用于免疫荧光实验。

3.实验结果

3.1 FK3显著促进神经球增殖，呈剂量依赖性，半数有效浓度EC50为40nM。

具体结果见图1。图1为FK3剂量依赖性增加体外神经球形成；(A-B)不同浓度FK3(0.001μΜ-10μΜ)处理的神经球的代表性图像和统计分析；(C)FK3的浓度-效应曲线；(D)FK1处理后神经球形成没有增加。比例尺＝100μm。数值代表平均值±标准差(n＝12，**P<0.01，**P<0.001；单因素方差分析)。

3.2 FK3明显逆转乙醇造成的神经干细胞自我更新能力的抑制，但用量比7，8-DHF显著减少，安全性更高

除了分析形成神经球的克隆数之外，Nestin作为神经干细胞鉴定的重要标志物，与细胞周期标记物Ki67共染也能反映神经干细胞的增殖水平，所以我们利用免疫荧光染色方法结合共聚焦成像技术进一步考察神经干细胞的自我更新能力。我们运用pSFM增殖细胞培养液贴壁培养单层神经干细胞，分别用0.1μM FK1、0.1μM FK3、5μM 7，8-DHF(7,8-二羟黄酮)在正常和乙醇条件下考察对神经干细胞自我更新能力的影响。

实验结果如图2所示：对神经干细胞进行染色分析，随机选择10个不同视野下的细胞，数出分别标有DAPI⁺,Nestin⁺,Ki67⁺的细胞数目。分析得出，对照组中，Nestin⁺神经干细胞正常占比约为83％左右，提示原代培养的神经细胞大部分为神经干细胞。乙醇组则表现为明显抑制，仅占50％左右。0.1μM FK3、5μM 7，8-DHF组，Nestin⁺神经干细胞占比达到87％左右显著增加并且对乙醇所造成的Nestin⁺细胞的减少有所改善，如图(图2A和B)所示。Ki67+/DAPI增殖细胞正常情况下占比为77％。乙醇组则表现为明显抑制，仅占45％左右。0.1μM FK3、5μM 7，8-DHF组，Ki67+/DAPI增殖细胞可达85％，并且对乙醇所造成的Ki67+/DAPI增殖细胞的减少有所改善，如图(2A和C)所示。我们进一步分析了不同组别中Nestin⁺Ki67⁺/Nestin⁺比例，即神经干细胞激活和增殖所占比例，结果如图(图2D)所示。提示FK3通过提高神经干细胞激活和增殖能力而逆转乙醇造成的损伤。

3.3神经干细胞分化成神经元

FK3可以促进神经干细胞体外分化为神经元。对分化了的神经干细胞进行染色分析，随机选择10个不同视野下的细胞，数出分别标有DAPI⁺和Tuj1⁺标记的神经元的细胞数目。具体结果见图3，Tuj1⁺新生神经元占DAPI比例显著升高。

3.4神经干细胞分化成星形胶质细胞

FK3可以使神经干细胞体外分化为星型胶质细胞。对分化了的神经干细胞进行染色分析，随机选择10个不同视野下的细胞，数出分别标有DAPI⁺和GFAP⁺神经胶质细胞的细胞数目。具体结果见图4，GFAP⁺新生星型胶质细胞占DAPI比例没有明显变化，但是DAPI总数在FK3组显著升高，并且FK3组中GFAP⁺细胞分化形态更好。

3.5 FK3促进老年小鼠海马神经干细胞分化和神经元成熟

FK3可以促进老年小鼠海马神经干细胞的神经元的生成和成熟。对50周龄的NestinCreER^T2::Ai14-tdTomato进行为期一周的FK3脑海马埋管给药，而后给与Tamoxifen诱导Tomato表达。一个月后Tomato⁺代表新生成熟神经元。如图所见，Tomato⁺细胞具有成熟神经元形态。而后对此转基因小鼠海马区神经干细胞进行染色分析。冠状切片后，每只小鼠选择6个不同脑片，进行免疫荧光染色分析。结果显示，与对照组相比，Tomato⁺成熟神经元数目在FK3组显著升高，FK3显著升高GFAP⁺MCM2⁺新生神经干细胞的激活，提示FK3显著促进老年小鼠海马神经干细胞的分化和成熟，能够显著逆转衰老对神经干细胞激活及分化的抑制作用。

Claims

1.式Ⅰ所示的FK3或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病的产品中的应用；

所述由神经干细胞缺失和/或损伤和/或死亡所致疾病为乙醇脑损伤。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂。

3.一种体外培养神经干细胞的方法，包括在含神经干细胞的培养基中加入权利要求1中所述FK3或其药学上可接受的盐。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述FK3或其药学上可接受的盐在所述培养基中的终浓度为0.1μΜ-1μΜ。

5.一种体外促进神经干细胞增殖的方法，包括用权利要求1中所述FK3或其药学上可接受的盐与神经干细胞共培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述共培养时，所述FK3或其药学上可接受的盐在培养体系中的终浓度为0.1μΜ-1μΜ。