CN115011625A - 用于嗜酸性喜温硫杆菌的iptg诱导型启动子载体及其应用 - Google Patents
用于嗜酸性喜温硫杆菌的iptg诱导型启动子载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体，该载体命名为pJRD215‑lacI‑Ptac(I(II)‑luc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；本发明还公开了所述IPTG诱导型启动子载体在嗜酸性喜温硫杆菌中诱导表达目的基因的应用或在嗜酸性喜温硫杆菌中研究基因表达调控规律的应用。本发明为嗜酸性喜温硫杆菌的基因功能研究提供了有效的诱导型启动子载体，将其可用于人为高效表达目的基因，利用IPTG诱导型启动子可以在A.caldus中高效的研究基因表达调控规律，为这种微生物在工业应用过程中的开发和设计提供了有力的分子工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种IPTG诱导的启动子及其应用，尤其涉及一种适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体及其在基因表达调控研究中的应用。属于微生物基因工程和生物技术领域。
背景技术
嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)从元素硫和还原硫化合物的氧化中获得能量，用来支持自养生长。嗜酸性喜温硫杆菌是地质微生物学和环境微生物学的重要模式微生物，也是生物冶金等产业中的核心优势功能菌群。因此，嗜酸性喜温硫杆菌的基础理论研究对于该微生物的改造开发利用，扩大其工业应用效率具有重要理论价值。
诱导型启动子是微生物分子生物学和合成生物学研究的重要工具，选择启动子来驱动基因表达是合成生物学应用中的最重要考虑因素之一，通过特异性启动子对基因表达进行合理调控，对于从合成生物学到菌株开发利用等多种应用来说既是必要的也是一种有力技术，但目前在嗜酸性硫杆菌中仍缺乏诱导型启动子，严重阻碍了嗜酸性硫杆菌研究工作的开展，因此开发适用于嗜酸性硫杆菌中的诱导型启动子，对该类微生物分子机制研究和合成生物学改造具有重要意义。经检索，有关适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体 pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc及其在基因表达调控研究中的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG 诱导型启动子载体及其在基因表达调控研究中的应用，以实现目的基因定时定量表达，并利用诱导型启动子载体在A.caldus研究基因表达调控规律。
本发明所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体，其特征在于：所述载体命名为pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-luc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述载体是以质粒 pJRD215为母体并构建改造的tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)、萤火虫荧光素酶基因luc、氯霉素抗性基因cat、链霉素抗性基因Smr，复制子oriV、接合转移基因mob、复制蛋白基因repA,repB, repC和卡那霉素抗性基因Kanr、大肠杆菌rnB基因的终止子T、优化的阻遏蛋白基因lacI、四环素抗性基因启动子P制得；其中，所述改造的tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)是在原有tac启动子的基础上，将其-35区和-10区之间的序列替换为lacO序列，使得Ptac(Ⅰ(Ⅰ)中含有两个lacO 序列，该tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的阻遏蛋白基因lacI是根据A.caldus密码子偏好性进行优化，该优化后的阻遏蛋白基因lacI的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
上述的适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体中：所述萤火虫荧光素酶基因luc的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
本发明所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体在嗜酸性喜温硫杆菌中诱导表达目的基因的应用。
本发明所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体在嗜酸性喜温硫杆菌中研究基因表达调控规律的应用。
其中：所述基因优选是表达铁摄取调控蛋白Fur的基因fur；所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体最佳诱导时间为在A.caldus培养的7～9天。
本发明还提供了一种用于检验上述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体诱导效果的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是重组嗜酸性喜温硫杆菌菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)，其携带如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的IPTG诱导型启动子载体，是利用检测萤火虫荧光素酶催化底物荧光虫荧光素发出的荧光来表征IPTG诱导型启动子载体的诱导效果。
具体的，将上述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体通过接合转移技术转入嗜酸性喜温硫杆菌(A.caldus)中，获得重组菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)。通过IPTG诱导后，检测萤火虫荧光素酶催化底物荧光虫荧光素发出的荧光来表征诱导型启动子载体的诱导效果，通过比较在A.caldus的不同生长时期进行诱导，确定该诱导型启动子载体在A.caldus培养的第7～9天为最佳诱导时间。
利用IPTG诱导型启动子研究铁摄取调控蛋白(ferric uptake regulator，Fur)的调控作用，铁摄取调控蛋白Fur是一个全局性的转录调节因子，利用本发明所述IPTG诱导启动子载体构建Fur蛋白表达载体pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-fur-luc，将Fur表达载体通过接合转移技术转入 A.caldusΔfur菌株中，然后在不同生长时间诱导fur基因表达来研究fur基因对其他基因的转录影响，以四三肽重复蛋白基因(A5904_RS00190)、过氧化物氧还蛋白基因(A5904_RS07320)、转录阻遏因子基因(A5904_RS05385)、超氧化物歧化酶基因(A5904_RS06865)、普遍应激蛋白基因(A5904_RS10070)为例，充分挖掘Fur蛋白的调控功能，并以fur基因作为报告基因在转录水平上验证诱导型启动子载体的功能，以实现研究不同时期诱导Fur蛋白表达对其他基因的调控作用。
其中，基因fur以PCR的方式从A.caldus染色体上获取，其核苷酸序列如SEQ IDNo.6 所示；PCR扩增引物是：
NdeI-fur-F：
TTCACACAGGAAACACATATGATGCACAGCGATGAATTGAAAA
NdeI-fur-R:
GTTTTTGGCGTCTTCCATATGTCACGATTTGACCGAGCCG
本发明公开了一种适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体及其在基因表达调控研究中的应用。其中所述的IPTG诱导型启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-luc是以质粒 pJRD215为母体，包含广宿主范围的复制子(oriV)、复制蛋白基因(repA，repB，repC)、接合转移基因(mob)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、萤火虫荧光素酶基因(luc)、氯霉素抗性基因(cat)、链霉素抗性基因(Smr)、改造的Ptac(I(II)启动子、大肠杆菌rnB基因的终止子T、优化的阻遏蛋白基因lacI、四环素抗性基因启动子P。本发明首次实现阻遏蛋白LacI在A.caldus 中表达并执行其功能，进而实现双lacO启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)在A.caldus中可被IPTG诱导。诱导型启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)含有两个lacO序列能够最大化的依赖阻遏蛋白来阻止启动子转录，实现较为严谨的诱导调控。
在当前自养微生物中缺乏可利用的诱导型启动子背景下，本发明为嗜酸性喜温硫杆菌的基因功能研究提供了有效的诱导型启动子载体，将其可用于定时人为高效表达目的基因，利用IPTG诱导型启动子可以在A.caldus中高效的研究基因表达调控规律，为这种微生物在工业应用过程中的开发和设计提供了有力的分子工具。
附图说明
图1诱导启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc构建示意图。
图2诱导启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc连接电泳验证图。
其中：泳道1-4：诱导启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc；M：DNA maker。
图3重组菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)菌落PCR验证图。
其中：泳道1-8：重组菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-luc)；M：DNAmaker。
图4重组菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)在不同生长时期启动子诱导活性检测。
图5 pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-fur-luc重组质粒构建。
图6 pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-fur-luc重组质粒验证。
其中：泳道1-5：pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-fur-luc；M：DNA maker。
图7重组菌株Δfur(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc)菌落PCR验证图
其中：1-8泳道：重组菌株Δfur(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc)；M：DNAmaker。
图8 fur基因在不同时间的相对表达量。
图9 A.caldusΔfur(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc)不同生长时期相关基因表达情况。
其中：(A)在第5天诱导编导Fur蛋白对相关基因的转录影响，(B)在第9天诱导编导Fur蛋白对相关基因的转录影响，(C)在第14天诱导编导Fur蛋白对相关基因的转录影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
同时，本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
下述实施例中，所使用的材料、菌株、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中，所述质粒pJRD215构建参照(Davison et al.,1987)。
Davison,J.,Heusterspreute,M.,Chevalier,N.,Ha-Thi,V.,and Brunel,F.(1987).Vectors with restriction site banks.V.pJRD215,a wide-host-range cosmidvector with multiple cloning sites. Gene 51,275-280.
实施例1诱导启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc构建
以四环素抗性基因启动子P、优化后的阻遏蛋白基因lacI基因、大肠杆菌rnB基因的终止子T及启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)形成的序列命名为T-lacI-P-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)，其构建示意图如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
上述四环素抗性基因启动子P、优化后的阻遏蛋白基因lacI基因、大肠杆菌rnB基因的终止子T及启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)所形成的目的片段T-lacI-P-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)由金唯智公司制备。
用限制性内切酶MluI和NdeI对全基因合成目的基因片段T-lacI-P-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)和质粒载体pJRD215-luc进行双酶切，利用DNA纯化回收试剂盒(Omega)回收酶切的目的片段，使用 T4连接酶(TaKaRa公司)将目的片段与线性化质粒pJRD215-luc连接，形成重组质粒pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc。其中，纯化回收、酶切连接具体步骤参考试剂盒使用说明书，构建过程见附图1。
将重组产物转化至大肠杆菌感受态DH5α中，利用载体引物F：ATCCCCGGGTACCATAAGT和载体引物R：CCTGGTAATCCGTTTTAGAATC通过菌落PCR 筛选阳性克隆，实验结果如图2所示。
提取阳性克隆质粒送至北京擎科生物有限公司进行测序分析，经测序分析无误的即命名为诱导启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc，即为适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2嗜酸性喜温硫杆菌(A.caldus)中pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc活力测定
将测序无误的质粒pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc转化至E.coli SM10中，并以含有重组质粒的E.coli SM10为供体菌，以野生型A.caldus为受体菌，通过接合转移的方式将重组质粒转移进入嗜酸性喜温硫杆菌(A.caldus)，以卡那霉素和链霉素为筛选标记获得重组菌株，该重组菌株命名为A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)。重组菌株PCR验证如图3所示。
其中接合转移操作中供体菌与受体菌震荡培养至对数中期，为确保供、受体菌性菌毛不受损坏，震荡培养转速不可高于150rpm/min，菌体离心收集时使用较低的转速，应不高于 8000rpm/min，供体菌与受体菌接合比例为体积比1:2。
按1×107个/ml的接种量将重组菌A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)接种到150mL 新鲜培养基中，40℃，150rpm震荡培养，在培养第5天、第9天、第14天分别用1.0mMIPTG 诱导12小时收菌，使用
Single-Luciferase(Firefly)Reporter AssayKit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)检测萤火虫荧光素酶催化底物荧光虫荧光素发出的荧光来研究诱导启动子的诱导效果，操作步骤如下:
(1)取A.caldus培养液70mL，10000rpm离心7min，除去培养基，用1mL PBS缓冲液将菌体悬浮，3000rpm，30s离心除去硫粉，将菌液转移至新的离心管中。
(2)由于A.caldus所用培养基pH值较低，除硫粉后用3.5mL PBS缓冲液洗菌3～5次，用PBS缓冲液将菌液OD600调至0.5，取1mL菌液至新的1.5mL离心管中(每个样品三个生物学重复)，10000rpm离心2min，除去上清。
(3)向每个离心管中加入200μL 1×Cell Lysis Buffer，涡旋混匀，常温裂解30min。4℃， 10000rpm离心2min，取细胞裂解液备用。
(4)将荧光素酶反应试剂(Luciferase Reaction Reagent)平衡至室温，在黑色96孔板中加入 90μL荧光素酶反应试剂，吸取100μL细胞裂解液至黑色96孔板中，小心混匀。
(5)使用多功能微孔板光谱仪(PerkinElmer(USA)，EnSpire)测定荧光值(测定时间1s，距离1mm)。
重组菌株启动子诱导活性检测结果如附图4所示，在生长第5天、第9天、第14天分别用1.0mM IPTG诱导，启动子活性有着低高低的变化趋势，启动子活性分别有31倍、94倍、55倍的动态变化，结果表明启动子有着良好的诱导效果；三个时间点相比较，第9天诱导效果最好，故确定该诱导型启动子载体最佳诱导时间为培养的7～9天。
实施例3利用诱导型启动子载体研究Fur蛋白的调控功能
利用诱导型启动子载体构建Fur蛋白表达质粒，构建过程如图5所示。
以A.caldus基因组为模板，设计如下引物，PCR扩增获得fur基因
NdeI-fur-F：TTCACACAGGAAACACATATGATGCACAGCGATGAATTGAAAA
NdeI-fur-R：GTTTTTGGCGTCTTCCATATGTCACGATTTGACCGAGCCG
上述PCR扩增条件是：预变性95℃3min；95℃15sec；退火57℃15sec；延伸72℃30s；30个循环；72℃延伸5min；4℃保温。
PCR产物利用胶回收试剂盒(OMEGA)对产物进行回收，用同源重组酶
II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞公司)将fur基因连接到经NdeΙ单酶切过的pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc质粒中，得到重组质粒pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc。
将连接产物转化至E.coli DH5α中后，涂布在含有卡那霉素和链霉素抗性的LB平板上，过夜培养后，挑取单菌落，用载体引物F：ATCCCCGGGTACCATAAGT和载体引物R：CCTGGTAATCCGTTTTAGAATC通过菌落PCR筛选阳性克隆，菌落PCR结果如图6所示，泳道1的单菌落可能为构建成功的阳性克隆。然后提取阳性克隆质粒送至北京擎科生物有限公司进行测序分析，经测序分析无误的即为重组质粒pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc。
将测序无误的重组质粒转化至E.coli SM10中，并以含有重组质粒的E.coli SM10为供体菌，以A.caldusΔfur为受体菌，通过接合转移的方式将重组质粒转移进入嗜酸性喜温硫杆菌fur基因敲除株(A.caldusΔfur)中，以卡那霉素和链霉素为筛选标记获得重组菌株，该重组菌株命名为A.caldusΔfur(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-fur-luc)，菌落PCR筛选如图7所示。
然后分别在重组菌株培养的第5天、第9天、第14天用1.0mM IPTG诱导12小时，以不加诱导剂的重组菌株为对照，收菌提取RNA进行荧光定量实验。
RNA提取试剂盒为RNAsimple Total RNA Kit(天根生化科技(北京)有限公司)，反转录试剂盒为PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(TaKaRa公司)，荧光定量所用试剂为 2×HotStart
Green Master Mix(北京蓝景科信公司)，具体操作步骤参考使用说明书。
以提取的RNA为模板反转录为cDNA，然后将cDNA稀释为100ng/μL。以gapdh基因为内参基因进行荧光定量实验，使用2-ΔΔct方法对fur基因的相对转录情况进行数据分析，实验结果如图7所示。
结果显示重组菌株在诱导条件下fur基因的转录水平明显提高，第5天、第9天和第14 天诱导相对转录水平分别提高了154倍、85倍和42倍。这在基因水平上验证了诱导启动子功能。
以反转录的cDNA为模板，对四三肽重复蛋白基因(A5904_RS00190)、过氧化物氧还蛋白基因(A5904_RS07320)、转录阻遏因子基因(A5904_RS05385)、超氧化物歧化酶基因(A5904_RS06865)、普遍应激蛋白基因(A5904_RS10070)设计如下引物，进行荧光定量实验，使用2-Δct方法进行分析。
表1荧光定量引物
表2荧光定量PCR反应体系
荧光定量PCR程序如下：
两步法PCR扩增标准程序
Stage 1：预变性，95℃30s，Reps：1
Stage 2：PCR反应，95℃5s，60℃30s，Reps：40
Stage 3：Melt Curve Stage，95℃5s，60℃60s，95℃
Acquisition Mode：Continuous，Reps：1
Stage 4：冷却，50℃30s，Reps：1
实验结果如图8所示，在第五天，fur的诱导表达对这些基因没有明显影响；在第9天， fur的诱导表达使这些基因发生转录下调；在第14天，fur的诱导表达使得这些基因发生转录上调。这说明Fur蛋白在不同生长时期诱导其调控功能可能是不同的。
综上所述的结果，可以看出：蛋白水平：在第9天进行诱导，启动子活性有将近100倍的动态变化；转录水平：在第5天的诱导基因表达量有150倍差距，但是可能由于蛋白水平具有延滞性，所以转录水平和蛋白水平的最佳诱导时间不同，我们建议该诱导型启动子载体最佳诱导时间为培养的7～9天。
总之本发明提供的在嗜酸性喜温硫杆菌中适用的诱导型启动子具有良好的诱导效果，证明利用IPTG诱导型启动子载体可以在A.caldus中高效的研究基因表达调控规律，为今后嗜酸性喜温硫杆菌的基因表达调控及合成生物学研究提供了重要的分子工具。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> 用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体及其应用
<141> 2022-06-1
<160> 6
<210> 1
<211> 14039
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> IPTG诱导型启动子载体pJRD215-lacI-Ptac(I&II)-luc的核苷酸序列
<222> （1）…（14039）
<400> 1
atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg 60
gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg 120
ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg 180
acattgtgag cggataacaa ttataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 240
aggaaacaca tatggaagac gccaaaaaca taaagaaagg cccggcgcca ttctatccgc 300
tagaggatgg aaccgctgga gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc 360
ctggaacaat tgcttttaca gatgcacata tcgaggtgaa catcacgtac gcggaatact 420
tcgaaatgtc cgttcggttg gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca 480
gaatcgtcgt atgcagtgaa aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat 540
ttatcggagt tgcagttgcg cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca 600
gtatgaacat ttcgcagcct accgtagtgt ttgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt 660
tgaacgtgca aaaaaaatta ccaataatcc agaaaattat tatcatggat tctaaaacgg 720
attaccaggg atttcagtcg atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta 780
atgaatacga ttttgtacca gagtcctttg atcgtgacaa aacaattgca ctgataatga 840
actcctctgg atctactggg ttacctaagg gtgtggccct tccgcataga actgcctgcg 900
tcagattctc gcatgccaga gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga 960
ttttaagtgt tgttccattc catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga 1020
tatgtggatt tcgagtcgtc ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ttacgatccc 1080
ttcaggatta caaaattcaa agtgcgttgc tagtaccaac cctattttca ttcttcgcca 1140
aaagcactct gattgacaaa tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctgggggcg 1200
cacctctttc gaaagaagtc ggggaagcgg ttgcaaaacg cttccatctt ccagggatac 1260
gacaaggata tgggctcact gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg 1320
ataaaccggg cgcggtcggt aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg 1380
ataccgggaa aacgctgggc gttaatcaga gaggcgaatt atgtgtcaga ggacctatga 1440
ttatgtccgg ttatgtaaac aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat 1500
ggctacattc tggagacata gcttactggg acgaagacga acacttcttc atagttgacc 1560
gcttgaagtc tttaattaaa tacaaaggat accaggtggc ccccgctgaa ttggagtcga 1620
tattgttaca acaccccaac atcttcgacg cgggcgtggc aggtcttccc gacgatgacg 1680
ccggtgaact tcccgccgcc gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag 1740
agatcgtgga ttacgtcgcc agtcaagtaa caaccgccaa aaagttgcgc ggaggagttg 1800
tgtttgtgga cgaagtaccg aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag 1860
agatcctcat aaaggccaag aagggcggaa agtccaaatt gtaaaattgt gagcggataa 1920
caatttcaca caggaaacaa tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc 1980
ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa 2040
ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa 2100
gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg 2160
tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt 2220
tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg 2280
gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt 2340
ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac 2400
cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg 2460
caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc 2520
cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga 2580
gtggcagggc ggggcgtaaa gaaggccatc ctgacggatg gccttttact agtatagtct 2640
atagtccgtg gaattattat atttatctcc gacgatattc tcatcagtga aatccagggg 2700
aattctcatg tttgacagct tatcatcgat aagctttaat gcggtagttt atcacagtta 2760
aattgctaac gcagtcaggc accgtgtatg aaatctaaca atgcgctcat cgtcatcctc 2820
ggcaccgtca ccctggatgc tgtaggcata ggcttggtta tgccggtact gccgggcctc 2880
ttgcgggata actgcacatt cgggatattt ctctatattc gcgcttcatc agaaaactga 2940
aggaacctcc attgaatcga actaatattt tttttggtga atcgcattct gactggttgc 3000
ctgtcagagg cggagaatct ggtgattttg tttttcgacg tggtgacggg catgccttcg 3060
cgaaaatcgc acctgcttcc cgccgcggtg agctcgctgg agagcgtgac cgcctcattt 3120
ggctcaaagg tcgaggtgtg gcttgccccg aggtcatcaa ctggcaggag gaacaggagg 3180
gtgcatgctt ggtgataacg gcaattccgg gagtaccggc ggctgatctg tctggagcgg 3240
atttgctcaa agcgtggccg tcaatggggc agcaacttgg cgctgttcac agcctatcgg 3300
ttgatcaatg tccgtttgag cgcaggctgt cgcgaatgtt cggacgcgcc gttgatgtgg 3360
tgtcccgcaa tgccgtcaat cccgacttct taccggacga ggacaagagt acgccgctgc 3420
acgatctttt ggctcgtgtc gaacgagagc taccggtgcg gctcgaccaa gagcgcaccg 3480
atatggttgt ttgccatggt gatccctgca tgccgaactt catggtggac cctaaaactc 3540
ttcaatgcac gggtctgatc gaccttgggc ggctcggaac agcagatcgc tatgccgatt 3600
tggcactcat gattgctaac gccgaagaga actgggcagc gccagatgaa gcagagcgcg 3660
ccttcgctgt cctattcaat gtattgggga tcgaagcccc cgaccgcgaa cgccttgcct 3720
tctatctgcg attggaccct ctgacttggg gttgatgttc atgccgcctg tttttcctgc 3780
tcattggcac gtttcgcaac ctgttctcat tgcggacacc ttttccagcc tcgtttggaa 3840
agtttcattg ccagacggga ctcctgcaat cgtcaaggga ttgaaaccta tagaagacat 3900
tgctgatgaa ctgcgcgggg ccgactatct ggtatggcgc aatgggaggg gagcagtccg 3960
gttgctcggt cgtgagaaca atctgatgtt gctcgaatat gccggggagc gaatgctctc 4020
tcacatcgtt gccgagcacg gcgactacca ggcgaccgaa attgcagcgg aactaatggc 4080
gaagctgtat gccgcatctg aggaacccct gccttctgcc cttctcccga tccgggatcg 4140
ctttgcagct ttgtttcagc gggcgcgcga tgatcaaaac gcaggttgtc aaactgacta 4200
cgtccacgcg gcgattatag ccgatcaaat gatgagcaat gcctcggaac tgcgtgggct 4260
acatggcgat ctgcatcatg aaaacatcat gttctccagt cgcggctggc tggtgataga 4320
tcccgtcggt ctggtcggtg aagtgggctt tggcgccgcc aatatgttct acgatccggc 4380
tgacagagac gacctttgtc tcgatcctag acgcattgca cagatggcgg acgcattctc 4440
tcgtgcgctg gacgtcgatc cgcgtcgcct gctcgaccag gcgtacgctt atgggtgcct 4500
ttccgcagct tggaacgcgg atggagaaga ggagcaacgc gatctagcta tcgcggccgc 4560
gatcaagcag gtgcgacaga cgtcatacta gatatcaagc gacttctcct atcccctggg 4620
aacacatcaa tctcaccgga gaatatcgct ggccaaagcc ttagcgtagg attccgcccc 4680
ttcccgcaaa cgaccccaaa caggaaacgc agctgaaacg ggaagctcaa cacccactga 4740
cgcatgggtt gttcaggcag tacttcatca accagcaagg cggcactttc ggccatccgc 4800
cgcgccccac agctcgggca gaaaccgcga cgcttacagc tgaaagcgac caggtgctcg 4860
gcgtggcaag actcgcagcg aacccgtaga aagccatgct ccagccgccc gcattggaga 4920
aattcttcaa attcccgttg cacatagccc ggcaattcct ttccctgctc tgccataagc 4980
gcagcgaatg ccgggtaata ctcgtcaacg atctgataga gaagggtttg ctcgggtcgg 5040
tggctctggt aacgaccagt atcccgatcc cggctggccg tcctggccgc cacatgaggc 5100
atgttccgcg tccttgcaat actgtgttta catacagtct atcgcttagc ggaaagttct 5160
tttaccctca gccgaaatgc ctgccgttgc tagacattgc cagccagtgc ccgtcactcc 5220
cgtactaact gtcacgaacc cctgcaataa ctgtcacgcc cccctgcaat aactgtcacg 5280
aacccctgca ataactgtca cgcccccaaa cctgcaaacc cagcaggggc gggggctggc 5340
ggggtgttgg aaaaatccat ccatgattat ctaagaataa tccactaggc gcggttatca 5400
gcgcccttgt ggggcgctgc tgcccttgcc caatatgccc ggccagaggc cggatagctg 5460
gtctattcgc tgcgctaggc tacacaccgc cccaccgctg cgcggcaggg ggaaaggcgg 5520
gcaaagcccg ctaaacccca caccaaaccc cgcagaaata cgctggagcg cttttagccg 5580
ctttagcggc ctttccccct acccgaaggg tgggggcgcg tgtgcagccc cgcagggcct 5640
gtctcggtcg atcattcagc ccggctcatc cttctggcgt ggcggcagac cgaacaaggc 5700
gcggtcgtgg tcgcgttcaa ggtacgcatc cattgccgcc atgagccgat cctccggcca 5760
ctcgctgctg ttcaccttgg ccaaaatcat ggcccccacc agcaccttgc gccttgtttc 5820
gttcttgcgc tcttgctgct gttcccttgc ccgcacccgc tgaatttcgg cattgattcg 5880
cgctcgttgt tcttcgagct tggccagccg atccgccgcc ttgttgctcc ccttaaccat 5940
cttgacaccc cattgttaat gtgctgtctc gtaggctatc atggaggcac agcggcggca 6000
atcccgaccc tactttgtag gggagggcgc acttaccggt ttctcttcga gaaactggcc 6060
taacggccac ccttcgggcg gtgcgctctc cgagggccat tgcatggagc cgaaaagcaa 6120
aagcaacagc gaggcagcat ggcgatttat caccttacgg cgaaaaccgg cagcaggtcg 6180
ggcggccaat cggccagggc caaggccgac tacatccagc gcgaaggcaa gtatgcccgc 6240
gacatggatg aagtcttgca cgccgaatcc gggcacatgc cggagttcgt cgagcggccc 6300
gccgactact gggatgctgc cgacctgtat gaacgcgcca atgggcggct gttcaaggag 6360
gtcgaatttg ccctgccggt cgagctgacc ctcgaccagc agaaggcgct ggcgtccgag 6420
ttcgcccagc acctgaccgg tgccgagcgc ctgccgtata cgctggccat ccatgccggt 6480
ggcggcgaga acccgcactg ccacctgatg atctccgagc ggatcaatga cggcatcgag 6540
cggcccgccg ctcagtggtt caagcggtac aacggcaaga ccccggagaa gggcggggca 6600
cagaagaccg aagcgctcaa gcccaaggca tggcttgagc agacccgcga ggcatgggcc 6660
gaccatgcca accgggcatt agagcgggct ggccacgacg cccgcattga ccacagaaca 6720
cttgaggcgc agggcatcga gcgcctgccc ggtgttcacc tggggccgaa cgtggtggag 6780
atggaaggcc ggggcatccg caccgaccgg gcagacgtgg ccctgaacat cgacaccgcc 6840
aacgcccaga tcatcgactt acaggaatac cgggaggcaa tagaccatga acgcaatcga 6900
cagagtgaag aaatccagag gcatcaacga gttagcggag cagatcgaac cgctggccca 6960
gagcatggcg acactggccg acgaagcccg gcaggtcatg agccagaccc agcaggccag 7020
cgaggcgcag gcggcggagt ggctgaaagc ccagcgccag acaggggcgg catgggtgga 7080
gctggccaaa gagttgcggg aggtagccgc cgaggtgagc agcgccgcgc agagcgcccg 7140
gagcgcgtcg cgggggtggc actggaagct atggctaacc gtgatgctgg cttccatgat 7200
gcctacggtg gtgctgctga tcgcatcgtt gctcttgctc gacctgacgc cactgacaac 7260
cgaggacggc tcgatctggc tgcgcttggt ggcccgatga agaacgacag gactttgcag 7320
gccataggcc gacagctcaa ggccatgggc tgtgagcgct tcgatatcgg cgtcagggac 7380
gccaccaccg gccagatgat gaaccgggaa tggtcagccg ccgaagtgct ccagaacacg 7440
ccatggctca agcggatgaa tgcccagggc aatgacgtgt atatcaggcc cgccgagcag 7500
gagcggcatg gtctggtgct ggtggacgac ctcagcgagt ttgacctgga tgacatgaaa 7560
gccgagggcc gggagcctgc cctggtagtg gaaaccagcc cgaagaacta tcaggcatgg 7620
gtcaaggtgg ccgacgccgc aggcggtgaa cttcgggggc agattgcccg gacgctggcc 7680
agcgagtacg acgccgaccc ggccagcgcc gacagccgcc actatggccg cttggcgggc 7740
ttcaccaacc gcaaggacaa gcacaccacc cgcgccggtt atcagccgtg ggtgctgctg 7800
cgtgaatcca agggcaagac cgccaccgct ggcccggcgc tggtgcagca ggctggccag 7860
cagatcgagc aggcccagcg gcagcaggag aaggcccgca ggctggccag cctcgaactg 7920
cccgagcggc agcttagccg ccaccggcgc acggcgctgg acgagtaccg cagcgagatg 7980
gccgggctgg tcaagcgctt cggtgatgac ctcagcaagt gcgactttat cgccgcgcag 8040
aagctggcca gccggggccg cagtgccgag gaaatcggca aggccatggc cgaggccagc 8100
ccagcgctgg cagagcgcaa gcccggccac gaagcggatt acatcgagcg caccgtcagc 8160
aaggtcatgg gtctgcccag cgtccagctt gcgcgggccg agctggcacg ggcaccggca 8220
ccccgccagc gaggcatgga caggggcggg ccagatttca gcatgtagtg cttgcgttgg 8280
tactcacgcc tgttatacta tgagtactca cgcacagaag ggggttttat ggaatacgaa 8340
aaaagcgctt cagggtcggt ctacctgatc aaaagtgaca agggctattg gttgcccggt 8400
ggctttggtt atacgtcaaa caaggccgag gctggccgct tttcagtcgc tgatatggcc 8460
agccttaacc ttgacggctg caccttgtcc ttgttccgcg aagacaagcc tttcggcccc 8520
ggcaagtttc tcggtgactg atatgaaaga ccaaaaggac aagcagaccg gcgacctgct 8580
ggccagccct gacgctgtac gccaagcgcg atatgccgag cgcatgaagg ccaaagggat 8640
gcgtcagcgc aagttctggc tgaccgacga cgaatacgag gcgctgcgcg agtgcctgga 8700
agaactcaga gcggcgcagg gcgggggtag tgaccccgcc agcgcctaac caccaactgc 8760
ctgcaaagga ggcaatcaat ggctacccat aagcctatca atattctgga ggcgttcgca 8820
gcagcgccgc caccgctgga ctacgttttg cccaacatgg tggccggtac ggtcggggcg 8880
ctggtgtcgc ccggtggtgc cggtaaatcc atgctggccc tgcaactggc cgcacagatt 8940
gcaggcgggc cggatctgct ggaggtgggc gaactgccca ccggcccggt gatctacctg 9000
cccgccgaag acccgcccac cgccattcat caccgcctgc acgcccttgg ggcgcacctc 9060
agcgccgagg aacggcaagc cgtggctgac ggcctgctga tccagccgct gatcggcagc 9120
ctgcccaaca tcatggcccc ggagtggttc gacggcctca agcgcgccgc cgagggccgc 9180
cgcctgatgg tgctggacac gctgcgccgg ttccacatcg aggaagaaaa cgccagcggc 9240
cccatggccc aggtcatcgg tcgcatggag gccatcgccg ccgataccgg gtgctctatc 9300
gtgttcctgc accatgccag caagggcgcg gccatgatgg gcgcaggcga ccagcagcag 9360
gccagccggg gcagctcggt actggtcgat aacatccgct ggcagtccta cctgtcgagc 9420
atgaccagcg ccgaggccga ggaatggggt gtggacgacg accagcgccg gttcttcgtc 9480
cgcttcggtg tgagcaaggc caactatggc gcaccgttcg ctgatcggtg gttcaggcgg 9540
catgacggcg gggtgctcaa gcccgccgtg ctggagaggc agcgcaagag caagggggtg 9600
ccccgtggtg aagcctaaga acaagcacag cctcagccac gtccggcacg acccggcgca 9660
ctgtctggcc cccggcctgt tccgtgccct caagcggggc gagcgcaagc gcagcaagct 9720
ggacgtgacg tatgactacg gcgacggcaa gcggatcgag ttcagcggcc cggagccgct 9780
gggcgctgat gatctgcgca tcctgcaagg gctggtggcc atggctgggc ctaatggcct 9840
agtgcttggc ccggaaccca agaccgaagg cggacggcag ctccggctgt tcctggaacc 9900
caagtgggag gccgtcaccg ctgaatgcca tgtggtcaaa ggtagctatc gggcgctggc 9960
aaaggaaatc ggggcagagg tcgatagtgg tggggcgctc aagcacatac aggactgcat 10020
cgagcgcctt tggaaggtat ccatcatcgc ccagaatggc cgcaagcggc aggggtttcg 10080
gctgctgtcg gagtacgcca gcgacgaggc ggacgggcgc ctgtacgtgg ccctgaaccc 10140
cttgatcgcg caggccgtca tgggtggcgg ccagcatgtg cgcatcagca tggacgaggt 10200
gcgggcgctg gacagcgaaa ccgcccgcct gctgcaccag cggctgtgtg gctggatcga 10260
ccccggcaaa accggcaagg cttccataga taccttgtgc ggctatgtct ggccgtcaga 10320
ggccagtggt tcgaccatgc gcaagcgccg ccagcgggtg cgcgaggcgt tgccggagct 10380
ggtcgcgctg ggctggacgg taaccgagtt cgcggcgggc aagtacgaca tcacccggcc 10440
caaggcggca ggctgacccc ccccactcta ttgtaaacaa gacattttta tcttttatat 10500
tcaatggctt attttcctgc taattggtaa taccatgaaa aataccatgc tcagaaaagg 10560
cttaacaata ttttgaaaaa ttgcctactg agcgctgccg cacagctcca taggccgctt 10620
tcctggcttt gcttccagat gtatgctctt ctgctcctgc agttcggggg catggatgcg 10680
cggatagccg ctgctggttt cctggatgcc gacggatttg cactgccggt agaactccgc 10740
gaggtcgtcc agcctcaggc agcagctgaa ccaactcgcg aggggatcga gcccggggtg 10800
ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg ctggaggatc atccagccgg cgtcccggaa 10860
aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg 10920
caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc gcctcgaggc gaaccccaga gtcccgctca 10980
gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc 11040
gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt 11100
agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc 11160
agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac 11220
gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag 11280
cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg 11340
tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt 11400
atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga 11460
tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt 11520
gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc 11580
tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg 11640
gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc 11700
ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc 11760
ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatcttg atcccctgcg 11820
ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt 11880
accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa ccgcccagtc 11940
tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt ctctttgcgc ttgcgttttc 12000
ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt cagcaccgtt tctgcggact 12060
ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc cctgagtgct tgcggcagcg 12120
tgaagctagc ttggctgcag gggggggggg gggacttcca ttgttcattc cacggacaaa 12180
aacagagaaa ggaaacgaca gaggccaaaa agcctcgctt tcagcacctg tcgtttcctt 12240
tcttttcaga gggtatttta aataaaaaca ttaagttatg acgaagaaga acggaaacgc 12300
cttaaaccgg aaaattttca taaatagcga aaacccgcga ggtcgccgcc ccgtaacctg 12360
tcggatcacc ggaaaggacc cgtaaagtga taatgattat catctacata tcacaacgtg 12420
cgtggaggcc atcaaaccac gtcaaataat caattatgac gcaggtatcg tattaattga 12480
tctgcatcaa cttaacgtaa aaacaacttc agacaataca aatcagcgac actgaatacg 12540
gggcaacctc atgtcccccc ccccccctgc aggtcgacgg atccccgggt accataagta 12600
gaagcagcaa cccaagtagc tttaccagca tccggttcaa ccagcatagt aagaatctta 12660
ctggacatcg gcagttcttc gaacagtgcg ccaactacca gctctttctg cagttcattc 12720
agggcaccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc 12780
ctgtctcttg atccatggat tacgcgtaaa aggccatccg tcaggatggc cttcttgttt 12840
ctcactgacc gctctccagg cggctcactt ggcgggccag ctgcatcagg ctgtcggcca 12900
gggcgcgggg gctcgccgtc tgcgtgttgg gcgccagggt ggtcttgcgc ttcaccaggc 12960
tcacgggcag cagctgattg cccttcacgg cttggccttg gctcagctgc agcaggcggt 13020
ccacgctcgt ttggcccagc aggcggaagt cttgtttgat ggtggtcagg ggggggatgt 13080
agcagctgct gtcctcggtg tcgtcgtagc ccaccacgct gatgtcggcg cccacccgca 13140
ggccggactc cgtgatggcg cgcatggcac ccagggccat ctgatcgttg gccaccagca 13200
tggcggtggg cacgatgccc tcgttcagca tctgcatggt ctgctgaaag ccgctcatgg 13260
cgctccagtc gccctcgcgc tcggcgatgg gctgaatctg attgcgggtc aggtacttgt 13320
gccagccggc caggcggagg cgcgcgctca cgctgctcag gggacccgcc agcagggcga 13380
tctgctgatg gcccagggcc acgaggtgct ccacgcccag gcgcgtaccg tcctcgtggc 13440
tgaagatgat gctgttgatg ggggtctgat cgctcacgtc caggaacagg gcgggcacgt 13500
tggtgcaggc ggcctccacg gcgatggcgt cttggtcatc cagggggtag ttgatgatca 13560
ggccgctcac gcgctgcgcc agcaggttgt gcacggcggc cttacaggcc tccacgccgc 13620
tgcgctccac catgctcacg accacgctcg cgcccagttg gtcggcgcgg ctcttgatgg 13680
cggccacgat ttggctcggg gcgtggaggg ccaggctgct cgtggccacg ccgatgagga 13740
gggattgctt gccggccagc tgctgcgcca cgcggttggg gatgtagttc agctcggcca 13800
tcgcggcctc caccttctcg cgggtcttgg cgctcacgtg gctcgcttgg ttcaccacgc 13860
ggctcacggt ctgatagctc acgccggcgt actcggccac gtcgtacagg gtcacgggct 13920
tcacaatatt agttcgattc atacacggtg cctgactgcg ttagcaattt aactgtgata 13980
aactaccgca ttaaacctta tggatgataa gctgtcaaac atgaatgcat gaattctca 14039
<210> 2
<211> 1083
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 优化后的阻遏蛋白lacI基因的核苷酸序列
<222> （1）…（1083）
<400> 2
gtgaagcccg tgaccctgta cgacgtggcc gagtacgccg gcgtgagcta tcagaccgtg 60
agccgcgtgg tgaaccaagc gagccacgtg agcgccaaga cccgcgagaa ggtggaggcc 120
gcgatggccg agctgaacta catccccaac cgcgtggcgc agcagctggc cggcaagcaa 180
tccctcctca tcggcgtggc cacgagcagc ctggccctcc acgccccgag ccaaatcgtg 240
gccgccatca agagccgcgc cgaccaactg ggcgcgagcg tggtcgtgag catggtggag 300
cgcagcggcg tggaggcctg taaggccgcc gtgcacaacc tgctggcgca gcgcgtgagc 360
ggcctgatca tcaactaccc cctggatgac caagacgcca tcgccgtgga ggccgcctgc 420
accaacgtgc ccgccctgtt cctggacgtg agcgatcaga cccccatcaa cagcatcatc 480
ttcagccacg aggacggtac gcgcctgggc gtggagcacc tcgtggccct gggccatcag 540
cagatcgccc tgctggcggg tcccctgagc agcgtgagcg cgcgcctccg cctggccggc 600
tggcacaagt acctgacccg caatcagatt cagcccatcg ccgagcgcga gggcgactgg 660
agcgccatga gcggctttca gcagaccatg cagatgctga acgagggcat cgtgcccacc 720
gccatgctgg tggccaacga tcagatggcc ctgggtgcca tgcgcgccat cacggagtcc 780
ggcctgcggg tgggcgccga catcagcgtg gtgggctacg acgacaccga ggacagcagc 840
tgctacatcc cccccctgac caccatcaaa caagacttcc gcctgctggg ccaaacgagc 900
gtggaccgcc tgctgcagct gagccaaggc caagccgtga agggcaatca gctgctgccc 960
gtgagcctgg tgaagcgcaa gaccaccctg gcgcccaaca cgcagacggc gagcccccgc 1020
gccctggccg acagcctgat gcagctggcc cgccaagtga gccgcctgga gagcggtcag 1080
tga 1083
<210> 3
<211> 248
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 改造的tac启动子Ptac(Ⅰ&Ⅱ)的核苷酸序列
<222> （1）…（248）
<400> 3
atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg 60
gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg 120
ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg 180
acattgtgag cggataacaa ttataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 240
aggaaaca 248
<210> 4
<211> 1480
<212> DNA
<213>人工序列
<221> T-lacI-P-Ptac(Ⅰ&Ⅱ)的核苷酸序列
<222> （1）…（1480）
<400> 4
aaaaggccat ccgtcaggat ggccttcttg tttctcactg accgctctcc aggcggctca 60
cttggcgggc cagctgcatc aggctgtcgg ccagggcgcg ggggctcgcc gtctgcgtgt 120
tgggcgccag ggtggtcttg cgcttcacca ggctcacggg cagcagctga ttgcccttca 180
cggcttggcc ttggctcagc tgcagcaggc ggtccacgct cgtttggccc agcaggcgga 240
agtcttgttt gatggtggtc agggggggga tgtagcagct gctgtcctcg gtgtcgtcgt 300
agcccaccac gctgatgtcg gcgcccaccc gcaggccgga ctccgtgatg gcgcgcatgg 360
cacccagggc catctgatcg ttggccacca gcatggcggt gggcacgatg ccctcgttca 420
gcatctgcat ggtctgctga aagccgctca tggcgctcca gtcgccctcg cgctcggcga 480
tgggctgaat ctgattgcgg gtcaggtact tgtgccagcc ggccaggcgg aggcgcgcgc 540
tcacgctgct caggggaccc gccagcaggg cgatctgctg atggcccagg gccacgaggt 600
gctccacgcc caggcgcgta ccgtcctcgt ggctgaagat gatgctgttg atgggggtct 660
gatcgctcac gtccaggaac agggcgggca cgttggtgca ggcggcctcc acggcgatgg 720
cgtcttggtc atccaggggg tagttgatga tcaggccgct cacgcgctgc gccagcaggt 780
tgtgcacggc ggccttacag gcctccacgc cgctgcgctc caccatgctc acgaccacgc 840
tcgcgcccag ttggtcggcg cggctcttga tggcggccac gatttggctc ggggcgtgga 900
gggccaggct gctcgtggcc acgccgatga ggagggattg cttgccggcc agctgctgcg 960
ccacgcggtt ggggatgtag ttcagctcgg ccatcgcggc ctccaccttc tcgcgggtct 1020
tggcgctcac gtggctcgct tggttcacca cgcggctcac ggtctgatag ctcacgccgg 1080
cgtactcggc cacgtcgtac agggtcacgg gcttcacaat attagttcga ttcatacacg 1140
gtgcctgact gcgttagcaa tttaactgtg ataaactacc gcattaaacc ttatggatga 1200
taagctgtca aacatgaatg catgaattct caatcgactg cacggtgcac caatgcttct 1260
ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 1320
ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 1380
ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacattgtg agcggataac aattataatg 1440
tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca 1480
<210> 5
<211> 1650
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 萤火虫荧光素酶基因luc的核苷酸序列
<222> （1）…（1650）
<400> 5
gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atccgctaga ggatggaacc 60
gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg aacaattgct 120
tttacagatg cacatatcga ggtgaacatc acgtacgcgg aatacttcga aatgtccgtt 180
cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc 240
agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca 300
gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat gaacatttcg 360
cagcctaccg tagtgtttgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa 420
aaattaccaa taatccagaa aattattatc atggattcta aaacggatta ccagggattt 480
cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga atacgatttt 540
gtaccagagt cctttgatcg tgacaaaaca attgcactga taatgaactc ctctggatct 600
actgggttac ctaagggtgt ggcccttccg catagaactg cctgcgtcag attctcgcat 660
gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt 720
ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg tggatttcga 780
gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttttac gatcccttca ggattacaaa 840
attcaaagtg cgttgctagt accaacccta ttttcattct tcgccaaaag cactctgatt 900
gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg ggggcgcacc tctttcgaaa 960
gaagtcgggg aagcggttgc aaaacgcttc catcttccag ggatacgaca aggatatggg 1020
ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa accgggcgcg 1080
gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg 1140
ctgggcgtta atcagagagg cgaattatgt gtcagaggac ctatgattat gtccggttat 1200
gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct acattctgga 1260
gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatag ttgaccgctt gaagtcttta 1320
attaaataca aaggatacca ggtggccccc gctgaattgg agtcgatatt gttacaacac 1380
cccaacatct tcgacgcggg cgtggcaggt cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc 1440
gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac 1500
gtcgccagtc aagtaacaac cgccaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa 1560
gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag 1620
gccaagaagg gcggaaagtc caaattgtaa 1650
<210> 6
<211> 492
<212> DNA
<213>人工序列
<221> 铁摄取调控蛋白基因fur的核苷酸序列
<222> （1）…（492）
<400> 6
atgcacagcg atgaattgaa aagggctggc ctcaaggcca cgctccctcg gctacggatc 60
ctgcagattc tggagaccag cgagagccgc cacctcaccg ccgaggaggt ctaccgccag 120
ctcctggagg ccgacgaaga ggtgggcctc gccacggtct accgggtcat gacccagttc 180
gagatggccg gactggtgcg gcggcaccac tttgagggcg accgcgccgt ttttgagctg 240
aacgaaagcg gccaccacga tcacatggtc tgcaccgcct gcggcagggt gctggagttt 300
tacgacgaga tcctggaggc acgccagcaa agcattgcca gcgagcgcgg ctttcatctc 360
tcggaccaca gcctctatct ctacggaacc tgtgtcggca tgcagaaaga gggggtctgt 420
tccctgcccg acgacagcgc agcgggcgcc cgttcccagg gagaggatca cggcggctcg 480
gtcaaatcgt ga 492
Claims (6)
1.一种适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体，其特征在于：所述载体命名为pJRD215-lacI-Ptac(I(II)-luc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述载体是以质粒pJRD215为母体并构建改造的tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)、萤火虫荧光素酶基因luc、氯霉素抗性基因cat、链霉素抗性基因Smr，复制子oriV、接合转移基因mob、复制蛋白基因repA,repB,repC和卡那霉素抗性基因Kanr、大肠杆菌rnB基因的终止子T、优化的阻遏蛋白基因lacI、四环素抗性基因启动子P制得；其中，所述改造的tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)是在原有tac启动子的基础上，将其-35区和-10区之间的序列替换为lacO序列，使得Ptac(Ⅰ(Ⅰ)中含有两个lacO序列，该tac启动子Ptac(Ⅰ(Ⅰ)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述优化的阻遏蛋白基因lacI是根据A.caldus密码子偏好性进行优化，该优化后的阻遏蛋白基因lacI的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
2.根据权利1所述的适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体，其特征在于：所述萤火虫荧光素酶基因luc的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
3.权利要求1所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体在嗜酸性喜温硫杆菌中诱导表达目的基因的应用。
4.权利要求1所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体在嗜酸性喜温硫杆菌中研究基因表达调控规律的应用。
5.根据权利3或4所述的应用，其特征在于：所述基因是表达铁摄取调控蛋白Fur的基因fur；所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体最佳诱导时间为在A.caldus培养的7～9天。
6.一种用于检验权利1所述适用于嗜酸性喜温硫杆菌的IPTG诱导型启动子载体诱导效果的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株是重组嗜酸性喜温硫杆菌菌株A.caldus(pJRD215-lacI-Ptac(Ⅰ(Ⅰ)-luc)，其携带如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的IPTG诱导型启动子载体，是利用检测萤火虫荧光素酶催化底物荧光虫荧光素发出的荧光来表征IPTG诱导型启动子载体的诱导效果。
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| CN202210622934.3A CN115011625A (zh) | 2022-06-02 | 2022-06-02 | 用于嗜酸性喜温硫杆菌的iptg诱导型启动子载体及其应用 |
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Citations (4)
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| CN112689676A (zh) * | 2018-09-11 | 2021-04-20 | 勃林格殷格翰Rcv两合公司 | 用于无质粒产生目的蛋白的诱导型表达系统 |
-
2022
- 2022-06-02 CN CN202210622934.3A patent/CN115011625A/zh active Pending
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