CN115011597A

CN115011597A - Linc 02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用

Info

Publication number: CN115011597A
Application number: CN202210454386.8A
Authority: CN
Inventors: 孟宁; 车彤彤; 李宁; 孙春辉; 钟英楠
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-04-27
Also published as: CN115011597B

Abstract

本发明公开了Linc02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用，属于生物医药技术领域。本发明构建了linc02454小干扰RNA，转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，结果表明由ox‑LDL诱导的HUVECs在转染linc02454小干扰RNA后细胞血管生成数量明显减少，细胞迁移距离受到抑制。因此，可以认为linc02454小干扰RNA可以抑制由ox‑LDL引起的内皮细胞血管生成，具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用，能够抑制动脉粥样硬化的发展。因此，linc02454可以作为检测抑制动脉粥样硬化的靶点，也可以此为靶点开发制备治疗动脉粥样硬化的小分子药物。

Description

Linc 02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种Linc 02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)在多种危险因素作用下,血管内皮细胞功能或结构受损，导致通透性发生改变，血脂异常沉积，伴随有炎症产生，巨噬细胞源性和平滑肌细胞泡沫化，最终形成凸向管腔的占位性病变，即As斑块。As斑块中的血管生成在As的病理生理机制中起着至关重要的作用。在缺氧、炎症、氧化应激情况下使得斑块内的动态失衡,导致血管生成，增加斑块的不稳定性，增加心血管事件的发生率。破裂的斑块随血流至血管狭窄处易阻塞血管，造成器官缺血、机能下降，进而威胁人类生命。

LncRNA的一般定义为不具备蛋白编码能力且长度大于200nt的转录产物。大部分lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，经过5’加帽和3’多聚腺苷化，最终形成成熟的线性RNA，在组织和细胞中表现出较强的特异性。近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。与已发现的lncRNA的数量相比，目前对lncRNA功能研究所取得成果依旧很少，其主要原因如下：

首先，lncRNA物种之间保守性不高，这使得不同生物之间进行lncRNA功能比对更加困难，同时也导致了一个给定的lncRNA功能的不确定性；其次，lncRNA数据库还不充足，lncRNA功能预测工具还很少，以及lncRNA功能研究的实验技术还不完善等原因，都会对lncRNA的功能研究有一定的限制。

目前虽然已经在人血浆和动脉粥样硬化样本以及不同的疾病模型中报道了lncRNA调节，但仅有少数lncRNA的功能和作用机制是已知的。因此，开发鉴定新的与动脉粥样硬化治疗相关的lncRNA具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种Linc 02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供Linc 02454作为靶点在如下(1)或(2)中的应用：

(1)制备诊断动脉粥样硬化的产品；

(2)制备治疗动脉粥样硬化的药物；

所述Linc 02454的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：

GATTTCAATTTGGAAAATGGCATGGAAATAATCCAGCTTGAACATCGTCCTCCTCACCTCCTGGACTAGGGCGAGGGCCCCTTATATTTCTTCATGGCAATTGTGTCACAGTTCAAACGCTCGTACCCTGACTCCATCTGGGATTTGGAATGCACTCAGGGAAGTGGCTGTGCATGGAGACTAGAAATGGAAGAGGCTTCCAAGGTCATGCCTTTCAGGCTCCCTTCAAATTCTACAGCTACTGTGAAGAGAGTTGCATTCCCACAGAGAACATGTCAGACTGGAGGAAAATTGTGACAAAAGGTCTCCCCAAAGGTCTCTGAAACTTCGATCTTATCTCATTCCACAAGGCAAAGGCCAGTTTCCTAAATCAAAGAATGAAACAAAGTACATCTTTTTCAAGCATTGTTTTGACATCACTCCCTTTTATACAACTGGACAGGCACTCCCATTCTCTTTAAATAATTTTTAAACACTCCTGAACTTTGGCTTGGAGATCCTCATTTGAAATGATTTTATCACTCTAGACATACTAGCTCATATTTTTTAACTTCAACCTGGCAAAAGTTAATATCCCTCATAAAACTCT。

本发明的第二方面，提供用于检测上述Linc 02454的试剂在制备诊断动脉粥样硬化的产品中的应用。

优选的，所述试剂为引物；更优选的，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；具体如下：

上游引物：5'-TCAAGAGAGCACGCGATAGA-3'，(SEQ ID NO.2)

下游引物：5'-CATTCCCACAGAGAGGCTGT-3'。(SEQ ID NO.3)

本发明的第三方面，提供抑制Linc 02454的试剂在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

上述应用中，所述抑制Linc 02454的试剂选自微小RNA分子(microRNA，miRNA)、干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)或人工miRNA(artificial microRNA，amiRNA)中的一种或多种。

优选的，所述试剂为靶向长链非编码RNALRA-1的siRNA；更优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；具体如下：

正义链：GGUGACUGCUCUUUCAUUUTT；(SEQ ID NO.4)

反义链：AAAUGAAAGAGCAGUCACCTT。(SEQ ID NO.5)

上述应用中，所述siRNA通过如下(1)-(3)任一项途径实现动脉粥样硬化治疗：

(1)减少血管生成数量；

(2)抑制细胞迁移距离；

(3)稳定动脉粥样硬化斑块。

本发明的有益效果：

本发明通过qRT-PCR分析动脉粥样硬化患者和正常健康人血清中linc 02454的表达水平，发现动脉粥样硬化患者血清中linc 02454表达水平明显上调，且与斑块旁组织中linc 02454的表达量相比，斑块组织中linc 02454d表达量水平明显提高。进一步地，本发明构建了linc 02454小干扰RNA，转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，结果表明由ox-LDL诱导的HUVECs在转染linc 02454小干扰RNA后细胞血管生成数量明显减少，细胞迁移距离受到抑制。因此，可以认为linc 02454小干扰RNA可以抑制由ox-LDL引起的内皮细胞血管生成，具有稳定动脉粥样硬化斑块的作用，能够抑制动脉粥样硬化的发展。因此，linc 02454可以作为检测抑制动脉粥样硬化的靶点，也可以此为靶点开发制备治疗动脉粥样硬化的小分子药物。

附图说明

图1：Linc 02454在动脉粥样硬化患者及正常健康人的血清中表达量的量化统计。分析可知在动脉粥样硬化患者血清中linc 02454的表达量为(21.89±0.65)，在正常健康人血清中linc 02454的表达量为(5.45±0.26)，***p<0.001vs.正常健康人，n＝8。

图2：Linc 02454在动脉粥样硬化患者主动脉斑块组织中及斑块旁组织中表达量的量化分析。分析可知在动脉粥样硬化患者主动脉斑块组织中linc 02454的表达量为(13.34±0.34)，在正常血管组织(斑块旁组织)中linc 02454的表达量为(4.82±0.36)，***p<0.001vs.正常血管组织，n＝8。

图3：Linc 02454小干扰RNA在HUVECs中成功转染。在HUVECS细胞中转染不同浓度的linc 02454的小干扰RNA，培养24h后qPCR检测linc 02454的表达量，***p<0.001vs.Ctr，n＝3。

图4：Linc 02454小干扰RNA抑制ox-LDL诱导的linc 02454的表达量上调。分别转染linc 02454小干扰和linc 02454小干扰RNAnegative control处理24h后，分别加入LDL或ox-LDL处理18h，qPCR检测linc 02454的表达量。***p<0.001vs.LDL，###p<0.001vs.ox-LDL，n＝3。

图5：Linc 02454小干扰RNA抑制ox-LDL诱导的内皮细胞血管生成；图中，A.分别转染linc 02454小干扰和linc 02454小干扰RNAnegative control处理24h后，接种至matrigel基质胶上，分别与0/3/6h观察并用100×显微镜拍照分析血管生成情况；B.Linc02454小干扰RNA抑制血管生成的量化分析，***p<0.001vs.LDL，##p<0.01vs.ox-LDL，n＝3。

图6：Linc 02454小干扰RNA抑制ox-LDL诱导的内皮细胞迁移；图中，A.分别转染linc 02454小干扰和linc 02454小干扰RNAnegative control处理24h后，用200μL枪尖划出痕迹，分别与0/12h观察并用100×显微镜拍照分析内皮细胞迁移情况。B.Linc 02454小干扰RNA抑制内皮细胞迁移的量化分析，***p<0.001vs.LDL，##p<0.01vs.ox-LDL，n＝3。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1.血清中linc 02454表达水平分析

1.血清中lnc RNA的提取

(1)取400μL冻存的动脉粥样硬化患者血清，加入750μL裂解液MRL，吹打混匀成匀浆。

(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，室温下孵育5min，待静置分层后小心吸取上清转移至一个新的RNase free的离心管中。

(3)每750μL裂解液加200μL氯仿，剧烈震荡15s并将其在室温下孵育3min。

(4)4℃12000rpm离心10min，样品分成3层，去上层水相，移到新的RNase free EP管中。

(5)加入0.6倍体积的70％乙醇，颠倒混匀，得到的混合液全部转入吸附柱RA中。

(6)10000rpm离心45s，收集滤液，加入2/3体积的无水乙醇，颠倒混匀，将混合液倒入吸附柱RB，10000rpm离心30s，弃掉废液。

(7)加入700μL漂洗液RW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(8)加入500μLRW，12000rpm离心60s，弃掉废液。

(9)将吸附柱RB放回空收集管，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

(10)取出RB，放入到一个新的RNase free EP管中，在吸附膜中间加30μLRNasefree water，室温放置2min，12000rpm离心1min。收集得到纯净lcn RNA用Nanodrop 2000检测其浓度，并保存于-80℃。

2.lcn RNA反转录为cDNA

(1)以上述提取的RNA浓度进行计算总RNA，按照表1-表2配制混合液。

表1：

PCR仪中，42℃，2min，将产物4℃保存；

表2：

(2)37℃，5min；85℃，5s后4℃保存，得到的lnc RNA的cDNA可用于后续实验，或置于-20℃保存。

3.qRCR检测linc 02454水平

(1)以上述逆转录反应得到的cDNA为模板，每个待测基因每个模板设置三个复孔，在冰上操作，反应体系配制如表3。

表3：

Linc 02454Forwardprimer的序列如SEQ ID NO.2所示；Linc 02454Roverseprimer的序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)按照两步法PCR设定反应步骤。

(3)反应结束，根据熔解曲线和Ct值，按照2^-ΔΔCT计算得到目的基因在这一模板中的相对表达值后进行分析。

在动脉粥样硬化的临床诊断中，血清检测作为无创诊断表现出巨大的优势，lncRNA等小分子在血清中的表达量变化往往表征着动脉粥样硬化的发展进程。通过quantitative real-time PCR分别检测健康人群与动脉粥样硬化患者血清中linc 02454表达水平，通过2^-ΔΔCT公式计算得到linc 02454的相对表达量，应用graphpadprism软件分析，对不同组linc 02454的表达进行U检验。

结果表明：与健康人群血清相比，linc 02454在动脉粥样硬化患者血清中的表达量上调(图1)。

实施例2：动脉粥样硬化患者主动脉斑块组织中linc 02454表达水平分析

1.组织中lnc RNA的提取

(1)手术切除的动脉粥样硬化主动脉斑块组织，及正常血管组织于-80℃保存。

(2)实验时将组织取出，加入Trizol溶液500μL于4℃裂解30min，1000g离心10min。

(3)加入0.25mL氯仿，剧烈震荡20s，静置2-3min；4℃，12000g，离心15min；

(4)取上层水相加入等体积的异丙醇，混匀于-20℃放置4h或过夜，产生RNA白色沉淀；12000g，离心10min，弃上清，

(5)用4℃DEPC水配制的75％酒精洗涤沉淀，7500g，离心5min，去上清，重复2次，空气干燥；

(6)待乙醇挥发后用10-20μLDEPC水溶解RNA；取出1μL样品，用DEPC水1:50稀释后，用Nanodrop 2000对总RNA的浓度进行定量。

2.RT-qPCR检测组织中linc 02454水平

(1)用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。

(2)使用实时荧光定量PCR试剂盒对linc 02454的表达量进行检测，配套使用荧光定量PCR仪进行检测(检测方法参照实施例1)。

通过quantitative real-time PCR分别检测动脉粥样硬化斑块组织和正常血管组织中linc 02454表达水平，应用2^-ΔΔCT公式计算得到linc 02454的相对表达量。

结果表明：与正常血管组织相比，动脉粥样硬化患者的斑块组织中linc 02454表达明显提高(图2)。

实施例3：linc 02454干扰实验及效率检测

1.细胞的获取及培养

HUVECs，胶原酶法从健康产妇脐带中提取，在含有20％胎牛血清的MCDB 131培养基中贴壁培养，待细胞铺满皿底，改用含有20％胎牛血清的M199培养液进行传代、扩增、冻存等。

2.设计linc 02454的小干扰RNA

为对linc 02454进行功能性研究，合成了linc 02454的小干扰RNA。其中，linc02454小干扰RNA(linc 02454siRNA)序列如下：

S：GGUGACUGCUCUUUCAUUUTT；(SEQ ID NO.4)

AS：AAAUGAAAGAGCAGUCACCTT。(SEQ ID NO.5)

linc 02454小干扰RNAnegative control组处理所使用的scamble siRNA，其序列如下：

S：UUCUCCGAACGUGUCACG；(SEQ ID NO.6)

AS：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。(SEQ ID NO.7)

3.细胞转染

(1)提前用RNase free H₂O将linc 02454小干扰RNA充分溶解。

(2)实验前一天将HUVECs细胞接种于培养皿中，在5％CO₂、37℃培养箱中培养至细胞密度为80％左右。

(3)取8μL的linc 02454siRNA或scamble siRNA稀释于500μL M199培养基中，室温孵育5min。

(4)取12μL Lipofectamine2000脂质体稀释于500μLM199培养基中，室温孵育5min。

(5)将孵育好的脂质体与linc 02454siRNA或scamble siRNA混合，室温孵育20min。

(6)将(5)中混合液加入到培养皿中，轻轻摇动混匀。

(7)在37℃，5％CO₂培养箱中培养6-8h后，更换为完全培养基继续培养18h。

4.细胞总RNA的提取

按TRIzol(Invitrogen)试剂说明进行，步骤如下：

(1)取处理后的细胞，1×PBS冲洗3次后吸尽；加入1mLTriZol吹打裂解细胞并收集；

(2)随后取上清液用苯酚－氯仿－异戊醇抽提，无水乙醇沉淀。待残留乙醇完全挥发后加入10-20μLDEPC水溶解RNA，取出1μL样品，用DEPC水1:50稀释后，用Nanodrop 2000对总RNA的浓度进行定量。

5.qPCR检测linc 02454的转染效率

(1)用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。

(2)使用实时荧光定量PCR试剂盒对linc 02454的表达量进行检测，配套使用荧光定量PCR仪进行检测。

通过quantitative real-time PCR检测linc 02454表达水平，应用2^-ΔΔCT公式计算得到linc 02454的相对表达量。

结果表明：与negative control组(Ctr)相比，转染linc 02454小干扰RNA组，linc02454表达受到抑制；且抑制效果与转染linc 02454siRNA的浓度相关(图3)。

实施例4：ox-LDL促进linc 02454的表达

1.细胞转染

按实施例3中所述方法，在HUVECS细胞中分别转染linc 02454siRNA和scamblesiRNA(转染浓度均为40nM)。

2.细胞加药处理

按分组分别加入LDL或ox-LDL处理18h，LDL或ox-LDL的处理浓度均为10μg/ml。

3.细胞总RNA的提取：总RNA的提取方法同实施例3中的步骤4。

4.qPCR检测linc 02454表达量

结果表明：与LDL组相比，ox-LDL显著促进linc 02454的表达；与negativecontrol组相比，转染linc 02454小干扰RNA组显著抑制了ox-LDL诱导的linc 02454的表达(图4)。

实施例5：linc 02454在促进血管生成中的研究实验

(1)Matrigel基质胶于4℃过夜慢溶，将其置于冰上并在无菌超净台中分装。准备实验所需枪尖、Ep管及孔板，提前置于-20℃预冷。

(2)取适量matrigel基质胶用1-2倍预冷的M199原液稀释，用枪尖轻轻吹打混匀。

(3)取300μL/孔matrigel混合液均匀加到预冷的24孔板中置于37℃5％CO₂培养箱中凝固1h。

(4)按10⁴个/孔分别接种经过转染linc 02454siRNA和scamble siRNA(转染浓度均为40nM)处理的HUVECs，分别加入LDL或ox-LDL处理，LDL或ox-LDL的处理浓度均为10μg/ml；于显微镜下观察细胞血管生成并拍照；

(5)3/6h后观察血管生成情况并用光学显微镜拍照。

结果表明：在ox-LDL处理条件下，与negative control组相比，linc 02454siRNA可抑制ox-LDL诱导的内皮细胞血管生成。表明转染linc 02454小干扰RNA能够抑制ox-LDL引起的血管生成(图5)。

实施例6：linc 02454在促进细胞迁移中的研究实验

(1)实验前一天将HUVECs细胞接种于培养皿中，在5％CO₂、37℃培养箱中培养至细胞密度达80％左右。

(2)分别转染linc 02454siRNA和scamble siRNA(转染浓度均为40nM)，6-8h换液，继续培养24h。

(3)用200μL枪尖于皿底均匀划线，分别加入LDL或ox-LDL进行处理，LDL或ox-LDL的处理浓度均为10μg/ml；并于0h时拍照。

(4)12h后观察细胞迁移情况并用光学显微镜拍照。

迁移率＝[(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度]×100％

结果表明：在ox-LDL处理条件下，与negative control组相比，linc 02454siRNA可抑制ox-LDL诱导的内皮细胞迁移。表明转染linc 02454小干扰RNA能够抑制ox-LDL引起的细胞迁移。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> Linc 02454及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用

<130> 2022

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 589

<212> DNA

<213> Linc 02454

<400> 1

gatttcaatt tggaaaatgg catggaaata atccagcttg aacatcgtcc tcctcacctc 60

ctggactagg gcgagggccc cttatatttc ttcatggcaa ttgtgtcaca gttcaaacgc 120

tcgtaccctg actccatctg ggatttggaa tgcactcagg gaagtggctg tgcatggaga 180

ctagaaatgg aagaggcttc caaggtcatg cctttcaggc tcccttcaaa ttctacagct 240

actgtgaaga gagttgcatt cccacagaga acatgtcaga ctggaggaaa attgtgacaa 300

aaggtctccc caaaggtctc tgaaacttcg atcttatctc attccacaag gcaaaggcca 360

gtttcctaaa tcaaagaatg aaacaaagta catctttttc aagcattgtt ttgacatcac 420

tcccttttat acaactggac aggcactccc attctcttta aataattttt aaacactcct 480

gaactttggc ttggagatcc tcatttgaaa tgattttatc actctagaca tactagctca 540

tattttttaa cttcaacctg gcaaaagtta atatccctca taaaactct 589

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tcaagagagc acgcgataga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cattcccaca gagaggctgt 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggugacugcu cuuucauuut t 21

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<211> 21

<212> DNA

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<400> 5

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<212> DNA

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<400> 6

uucuccgaac gugucacg 18

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.Linc 02454作为靶点在如下(1)或(2)中的应用：

(1)制备诊断动脉粥样硬化的产品；

(2)制备治疗动脉粥样硬化的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Linc 02454的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

3.用于检测Linc 02454的试剂在制备诊断动脉粥样硬化的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂为引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

6.抑制Linc 02454的试剂在制备治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制Linc 02454的试剂选自miRNA、siRNA或amiRNA中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制Linc 02454的试剂为siRNA。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述siRNA通过如下(1)-(3)任一项途径实现动脉粥样硬化治疗：

(1)减少血管生成数量；

(2)抑制细胞迁移距离；

(3)稳定动脉粥样硬化斑块。