CN111317736A - 一种喹啉生物碱在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了喹啉生物碱在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，属于喹啉生物碱的医药用途技术领域。本发明研究发现，scandine能通过抑制斑块内血管生成和趋化因子CX3CL1的水平发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用，因此，scandine可以作为一种有效的工具，用于动脉粥样硬化的分子机制研究，或用于制备治疗动脉粥样硬化药物，同时本发明为研制开发新的有关治疗动脉粥样硬化的药物奠定了基础。

Description

一种喹啉生物碱在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域

本发明涉及喹啉生物碱的医药用途技术领域，具体涉及一种喹啉生物碱在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

背景技术

景东山橙(Melodinus khasianus)是夹竹桃科(Apocynaceae)山橙属(Melodinus)植物。景东山橙主要产于云南、贵州以及四川地区，生长在海拔1.6-2.9km左右的原始森林中。景东山橙全株都可作为药材使用，具有消除内热、镇痉、消散瘀滞等功效，常用于跌打损伤、折伤。山橙属富含生物碱类化合物，且结构复杂，种类繁多，出新率高，其化学成分已得到了广泛研究，山橙属中已有80多个化合物得到分离和鉴定，大多数化合物为单萜吲哚生物碱、双吲哚生物碱及喹啉生物碱。

Scandine是一种喹啉生物碱，其分子式为C₂₁H₂₂O₃N₂，分子量为350，结构式如下：

目前对于Scandine的研究主要集中在该化合物的分离、鉴定以及化学合成方面，但对于Scandine的生物活性还很少见有报道。

动脉粥样硬化(AS)是一种起始于血管内皮细胞功能紊乱，并以动脉壁形成由纤维帽、巨噬细胞、泡沫细胞和脂质构成的斑块为主要特点的代谢性疾病。动脉粥样硬化斑块的不稳定及破裂会导致血栓形成，进而引发急性冠状动脉综合症等一系列并发症，对人类健康造成巨大威胁。

尽管目前有一些关于生物碱(例如：黄连生物碱、海南狗牙花总生物碱)抗动脉粥样硬化的报道，但是，由于生物碱种类的多样性和结构的复杂性，不同来源、不同种类的生物碱的生物活性会存在较大差异，对于喹啉生物碱scandine在动脉粥样硬化发生发展中的作用，目前国内外尚未见有报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种喹啉生物碱scandine的新用途。本发明研究发现，scandine能通过抑制斑块内血管生成和趋化因子CX3CL1的水平发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用，因此，scandine可以作为制备治疗动脉粥样硬化的药物进行应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供scandine在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

上述应用中，所述scandine通过增加动脉粥样硬化斑块的稳定性来抑制动脉粥样硬化的发生发展。

进一步的，所述scandine通过抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量来增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。

上述应用中，所述scandine可以通过商业途径购买获得；也可从景东山橙(Melodinus khasianus)中提取获得。

本发明的第二方面，提供scandine在制备增加动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的应用。

上述应用中，所述scandine通过抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量来增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。

本发明的第三方面，提供scandine在制备抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量的药物中的应用。

本发明的有益效果：

动脉粥样硬化斑块以脂代谢的紊乱、炎症的发生为初始病理事件，而斑块内新生血管的增加是导致动脉粥样硬化发生发展、促使斑块不稳定的重要原因。破裂的斑块随血流至血管狭窄处易阻塞血管，造成器官缺血、机能下降，进而威胁人类生命。本发明首次研究发现，scandine通过抑制斑块内血管生成和降低趋化因子CX3CL1的水平，发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。因此，scandine可以作为一种有效的工具，用于动脉粥样硬化的分子机制研究，或用于制备治疗动脉粥样硬化药物，同时本发明为研制开发新的有关治疗动脉粥样硬化的药物奠定了基础。

附图说明：

图1：实验线路图。

图2：scandine处理对ApoE^-/-小鼠斑块稳定性的影响；其中，HE：HE染色检测斑块内坏死核心的大小；油红o：油红o染色法检测斑块内脂质含量；Masson：Masson染色检测斑块内胶原纤维的含量；巨噬细胞：免疫组化法检测斑块内巨噬细胞的含量；平滑肌细胞:免疫组化法检测斑块内平滑肌细胞的含量。

图3：scandine注射期间小鼠体重变化图。

图4：scandine处理对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内血管生成的影响。

图5：scandine处理对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内皮细胞中趋化因子CX3CL1的影响。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，尽管山橙属植物的粗生物碱混合物具有抗肿瘤和抗菌活性，但有关喹啉生物碱scandine在动脉粥样硬化发生发展中的作用以及在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，目前国内外尚未见报道。

基于此，本发明对喹啉生物碱scandine的生物活性进行了深入研究。本发明研究发现，scandine能有效增强动脉粥样硬化斑块的稳定性，进而抑制ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化发展。

动脉硬化发展过程中，会形成不稳定的易碎斑块，易损斑块的破裂是造成急性心肌梗死促发死亡的重要原因。易损斑块中平滑肌细胞数量减少，巨噬细胞数量增加，胶原含量减少，坏死核心面积增大，脂质含量增多。因此，动脉粥样硬化斑块的稳定性是决定动脉粥样硬化发生发展的关键因素。为考察scandine对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响，本发明利用评价抗动脉粥样硬化药物药效的经典动物模型ApoE^-/-小鼠对scandine在AS方面的作用进行评价。ApoE^-/-小鼠被随机分为对照组(Control)、scandine低剂量注射组(5mg/kg)和scandine高剂量注射(10mg/kg)，采取腹腔注射方式，每24h注射一次，连续注射6周，注射期间随时跟踪小鼠体重变化。具体注射方式见图1。

对ApoE-/-小鼠血管切片分别进行HE、Masson、油红o染色，及通过免疫荧光染色检测斑块中平滑肌细胞marker a-actin、巨噬细胞markerCD11C含量，并观察统计斑块中坏死核心、脂质、胶原纤维及肌纤维的面积，及平滑肌细胞和巨噬细胞的分布状况。(见图2)。

结果表明：

与Control组相比，5mg/mL及10mg/mL组ApoE-/-小鼠血管斑块中的坏死核心面积显著减小、脂质含量及巨噬细胞数量减少，平滑肌细胞数量、胶原水平增多，说明注射scandine使动脉粥样硬化斑块更加趋于稳定、不易破裂。

血管内壁上的内皮细胞由于脂质的附着，导致内皮细胞向斑块内增殖并形成血管，造成斑块内空泡组织变多。因此，斑块内新生血管数目增多是斑块不稳定重要诱因。趋化因子是指对白细胞有引导作用的小细胞因子，主要在炎症反应中发挥作用。CX3CL1对单核细胞、T细胞有较强趋化、促黏附作用，并能促进滚动的白细胞附着于管壁上。为进一步研究scandine是通过何种机制来影响动脉粥样硬化斑块的稳定性，本发明分别进一步考察了scandine对斑块内血管生成的影响、scandine对趋化因子CX3CL1的影响，结果发现：scandine能够抑制斑块内血管生成，并能有效降低内皮细胞中CX3CL1的表达量，进而增加斑块稳定性。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：scandine的CAS No:24314-59-8，为市售产品。

实施例1：scandine处理对ApoE^-/-小鼠斑块稳定性的影响。

取八周龄的ApoE^-/-小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司购买)进行高脂饲料(配方：0.15％胆固醇+21％猪油+79％普通饲料)，至取材截止。实验小鼠随机分成三组：对照(Control)组，scandine低剂量注射组(5mg/kg)以及scandine高剂量注射组(10mg/kg)。所有试验组在高脂喂养20周之后开始按照每24h腹腔注射一次。给药6周后解剖，分离心脏和主动脉包埋并制成10mm冰冻切片置于-80℃。

复温后，将主动脉根的冷冻切片置于10％甲醛钙中固定10min后进行油红O染色，于Bouin’s中常温固定过夜后进行Masson染色，倒置显微镜下观察拍照，使用ImagePro图片分析软件测量油红O着色的斑块面积，计算脂质/斑块的面积比值；对胶原纤维着色区进行面积统计。

将主动脉根的冷冻切片置于冷丙酮4℃固定10min，对ApoE^-/-小鼠血管切片分别进行HE、平滑肌细胞marker和巨噬细胞marker进行免疫荧光染色，观察斑块中坏死核心、平滑肌细胞及巨噬细胞的数量。ImagePro图片分析软件检测坏死核心与斑块面积百分比；使用Leica DMI8荧光显微镜观察染色结果并拍照，通过Leica Confocal Software分析荧光强度计算出各组平滑肌细胞以及巨噬细胞的相对水平。结果见图2。

结果表明：

与Control相比，5mg/kg和10mg/kg组小鼠血管斑块中的脂质含量降低，胶原纤维含量升高、坏死核心数量减少；同时平滑肌细胞数量增多、巨噬细胞数量降低。说明scandine能使斑块趋于稳定、不易破裂。

实施例2：scandine注射期间小鼠体重及脏器系数无影响。

在注射期间，每周记录各组小鼠平均体重；scandine注射完毕后将每只小鼠心、肝、脾、肺、肾称重，取各组平均值并计算脏器系数。结果见图3和表1。

表1：ApoE^-/-小鼠器脏统计表

结果表明：

在注射期间，Control组与5mg/kg和10mg/kg组之间体重及脏器系数无差异，说明5mg/mL及10mg/mL scandine注射剂量在小鼠的正常承受范围之内，对ApoE^-/-小鼠没有毒副作用。

实施例3：scandine处理对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内血管生成的影响。

ApoE-/-小鼠主动脉根冷冻切片复温后于冷丙酮中固定，利用内皮细胞标记物CD31对主动脉根切片进行免疫荧光染色，用Leica DMI8荧光显微镜拍照分析CD31阳性区域面积。结果见图4。

结果表明：

与Control相比，5mg/kg和10mg/kg组ApoE^-/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块中新生血管面积显著降低，说明scandine有能通过抑制斑块内皮细胞血管新生，增加斑块稳定性。

实施例4：scandine处理对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内皮细胞中趋化因子CX3CL1的影响。

CX3CL1在动脉粥样硬化斑块的不稳定中起重要促进作用，其通过增强氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)与巨噬细胞的结合而使斑块不稳定。我们通过免疫组织荧光内皮细胞-CX3CL1双染法对斑块内CX3CL1进行定量分析。首先将冷冻切片复温并于冷丙酮中固定，利用内皮细胞markerCD31及CX3CL1抗体对斑块进行孵育，用Leica DMI8荧光显微镜观察拍照，photoshop融合图片呈现CX3CL1在内皮细胞中的表达情况。结果见图5。

结果表明：Control组内皮细胞中CX3CL1表达量明显高于5mg/kg、10mg/kg组，证明scandine能够从细胞水平调控趋化因子CX3CL1而稳定动脉粥样硬化斑块。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

动脉粥样硬化斑块以脂代谢的紊乱，炎症的发生为初始病理事件，而斑块内新生血管的增加是导致动脉粥样硬化发生发展，促使斑块不稳定的重要原因。破裂的斑块随血流至血管狭窄处易阻塞血管，造成器官缺血、机能下降，进而威胁人类生命。我们的结果表明，scandine能够有效促进ApoE^-/-小鼠斑块稳定性，而对ApoE^-/-小鼠体重及脏器系数无毒副作用，其可能的机制为scandine通过抑制斑块内血管生成和趋化因子CX3CL1的水平发挥稳定动脉粥样硬化斑块的作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.scandine在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述scandine通过增加动脉粥样硬化斑块的稳定性来抑制动脉粥样硬化的发生发展。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述scandine通过抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量来增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述scandine的结构式如下：

5.scandine在制备增加动脉粥样硬化斑块稳定性的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述scandine通过抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量来增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。

7.scandine在制备抑制动脉粥样硬化斑块内血管生成和降低内皮细胞中CX3CL1的表达量的药物中的应用。

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