CN110169972A - 葫芦素e在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了葫芦素E在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，本发明属于医药技术领域。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理学基础，防治动脉粥样硬化是防治心脑血管疾病的重要措施。葫芦素E，也称为α‑苦瓜素，是从甜瓜、苦瓜、南瓜、喷瓜、药西瓜等植物中提取得到的一种含氧四环三萜晶体化合物，为葫芦素家族一员，葫芦素已经被用于慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。本发明首次发现葫芦素E可通过减少炎症反应，减少动脉粥样硬化斑块面积，减少动脉粥样硬化斑块中脂质的沉积，抑制血管内皮细胞的凋亡来达到防治动脉粥样硬化的目的。本发明的提出为动脉粥样硬化的预防或治疗提供了新的技术手段。

Description

葫芦素E在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种治疗动脉粥样硬化的药物成分，特别涉及葫芦素E在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理学基础，防治动脉粥样硬化是防治心脑血管疾病的重要措施，市面上防治动脉粥样硬化的药物主要包括抗血脂药物降低如他汀类、消胆胺等，抗血小板药物如阿司匹林，以及扩血管药物、溶血栓和抗凝血药物。然而随着对动脉粥样硬化发表机制研究的深入，现在普遍认为动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，2017年欧洲心脏病学会公布了著名的卡那单抗抗炎性血栓结局研究试验结果，结果表明抗炎药卡那奴单抗显著降低复发的心血管事件，这一作用并不依赖于胆固醇水平，证明单纯抗炎即可对心血管疾病起到控制作用。

植物化合物葫芦素是从葫芦科植物甜瓜、苦瓜、南瓜、喷瓜、药西瓜等中提取并分离得到的一类三萜化合物，葫芦素E(Cucurbitacin E，CuE)为其中一种。葫芦素已经被用于慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。

本发明首次发现葫芦素E可以显著减少动脉粥样硬化斑块大小，机制可能是通过AMPK减少血管粘附因子的表达(抗炎)，也可通过减少血管内皮细胞的凋亡，进而减少动脉粥样硬化斑块大小。本发明的提出为动脉粥样硬化的预防或治疗提供了一种新的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于提供葫芦素E(Cucurbitacin E，CuE)在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明通过给予ApoE-/-小鼠含1.25％胆固醇的高脂膳食诱导动脉硬化模型，明确葫芦素E对动脉硬化病变的影响。结果表明，低剂量葫芦素E(0.5mg/kg体重)对主动脉窦部斑块形成有缓解的效果，高剂量葫芦素E(1.0mg/kg体重)能减少主动脉窦及主动脉全段斑块的形成。接着，本发明选用C57BL/6小鼠雄性和AMPKα2-/-小鼠AMPKα2-/-小鼠各10只，分别按体重随机分组：野生炎症组(CMC+WT-LPS)，CuE野生炎症组(CuE+WT-LPS)，AMPKα2-/-炎症组(CMC+AMPKα2-/--LPS)，CuE AMPKα2-/-炎症组(CuE+AMPKα2-/--LPS)，每组5只。以葫芦素E或羧甲基纤维素预先灌胃7天，灌胃剂量为1.0mg/kg·d，随后应用LPS对各组小鼠进行血管炎症诱导。通过ELISA试剂盒检测血浆中粘附因子的表达，以及免疫荧光检测小鼠主动脉内皮VCAM-1的原位表达情况得出结论，CuE对内皮功能障碍有保护作用。最后，本发明选用8周龄C57BL/6小鼠30只，分别按体重随机分组，每组10只：正常对照组(CMC)，高脂对照组(HFD+CMC)，高脂+CuE组(HFD+CuE)。正常对照组给予AIN93M，其余两组给予高脂饲料，高脂饲料是以AIN93M为基础调整供能比，脂肪供能比45％。高脂喂养8周后，以羧甲基纤维素或CuE灌胃，灌胃剂量为1.0mg/kg·d，灌胃8周后处死小鼠，通过cleaved-Caspase3的表达反应凋亡情况，结果发现，与正常饲料喂养小鼠相比，高脂喂养小鼠血管动脉内皮cleaved-Caspase 3表达增加；与高脂喂养小鼠相比，高脂喂养小鼠给予CuE后动脉内皮cleaved-Caspase3表达降低，说明CuE可以改善血管内皮的凋亡。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了葫芦素E(Cucurbitacin E，CuE)在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

其中，优选的葫芦素E通过减少炎症反应，减少动脉粥样硬化斑块面积，减少动脉粥样硬化斑块中脂质的沉积，抑制血管内皮细胞的凋亡来达到防治动脉粥样硬化的目的。

与现有的CuE的应用相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的化合物CuE能够减少ApoE(载脂蛋白E)基因缺陷动脉粥样硬化小鼠斑块面积，减少动脉粥样硬化斑块中脂质的沉积。CuE可以通过抗炎保护血管内皮的功能障碍，同时可以保护血管内皮细胞的凋亡等多种作用机制防治动脉粥样硬化。本发明发现了CuE新的药物用途，动脉粥样硬化的预防或治疗提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为油红“O”染色分析CuE对小鼠主动脉内膜粥样斑块面积的影响；

其中，图1A为油红“O”染色时各组主动脉内膜及粥样斑块情况；图1B为定量分析斑块面积与整个主动脉内膜面积的比值。图注：不同字母表示具有统计学差异，P＜0.05；

图2为油红“O”染色分析CuE对小鼠主动脉窦粥样斑块面积的影响；

其中，图2A为油红“O”染色表示各组主动脉窦横切面及粥样斑块；图2B为定量分析斑块面积与整个主动脉窦部横切面面积的比值，图注：不同字母表示具有统计学差异，P＜0.05；

图3为CuE对各组小鼠血管粘附因子表达水平的影响；

其中，图3A为ELISA法检测血浆中VCAM-1、ICAM-1水平；图3B为免疫荧光法检测各组小鼠主动脉内皮VCAM-1水平，图注：不同字母表示具有统计学差异，P＜0.05；

图4为免疫组化法比较各组小鼠主动脉内皮cleaved-Caspase3表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1CuE对动脉粥样硬化小鼠斑块面积的影响

(一)材料与方法

1、药物：

葫芦素E(Cucurbitacin E，CuE，纯度≥98％)购于成都德思特生物技术有限公司，溶于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，储存浓度为1mg/ml，保存4℃备用。给药时以0.5％羧甲基纤维素钠溶液稀释后，经灌胃给药。

2、实验动物分组、喂养及给药：

本实验选用ApoE-/-小鼠(雄性10周龄，30只，北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006)，适应性喂养一周后将30只10周龄大小的雄性ApoE-/-小鼠按照体重随机分为6组：羧甲基纤维素对照组(CMC)，葫芦素E低剂量组(CuE-LD)、葫芦素E高剂量组(CuE-HD)、AMPK慢病毒羧甲基纤维素组(sh-AMPK-CMC)、AMPK慢病毒葫芦素E低剂量组(sh-AMPK-LD)、AMPK慢病毒葫芦素E高剂量组(sh-AMPK-HD)。各组实验动物分别注射sh-AMPK慢病毒或空载体。在实验期间给予含有质量比为1.25％胆固醇及供能比40％脂肪的高脂饲料，自由摄食摄水，单笼饲养。实验动物每天灌胃给药，羧甲基纤维素对照组给予0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，葫芦素E低剂量组按照0.5mg/kg体重给予葫芦素E羧甲基纤维素钠水溶液，葫芦素E高剂量组按照1.0mg/kg体重给予葫芦素E羧甲基纤维素钠水溶液。饲养10周后处死。

3、形态学检测方法(油红“O”染色)：

先用异戊巴比妥钠腹腔注射，对小鼠进行麻醉，剂量为64mg/kg体重。沿腹中线剪开小鼠腹腔，随后暴露小鼠胸腔，进行心尖采血，然后在左心室用带有0.45mm针头的注射器进行插管，同时在右心房剪口，其后于冰上用20mL预冷的PBS对小鼠的循环系统进行灌注冲洗，去除残留的血液。先摘取小鼠的心脏，心脏要含有一部分主动脉，以便保留窦部，主动脉弓部要与余下的主动脉连在一起，取下的心脏要在新鲜配制的4％多聚甲醛中固定过夜。将固定好的心脏在预冷的PBS中轻轻涮洗，然后将心脏的腹面向上，把主动脉根摆在竖直方向，在心脏中部沿水平方向切开，用OCT包埋剂在速冻台上包埋。包埋好的组织块以6mm厚度进行切片，留取主动脉窦部。将切片在室温下晾干，然后在PBS中洗涤3次去除包埋剂。先配制油红O储存液，10mL异丙醇中加入0.05g油红O粉末，配成0.5％油红O异丙醇溶液，溶解后过滤；再配制油红O工作液，即含60％油红O储存液的去离子水溶液(v/v)，工作液要现用现配。将有油红O工作液加到组织切片上，避光染色15min，然后在60％异丙醇水溶液中脱色5min。在自来水中漂洗2min，去除多余的异丙醇，然后加入Mayer'苏木素染液中染核3min，然后在自来水中漂洗2min返蓝。将片子上多余的水擦去，用甘油封片，并用透明甲油固定盖玻片后即可拍照。把已经摘除心脏的小鼠的脏器取下，沿小鼠脊柱从上到下将小鼠主动脉整条取下，于体视显微镜下进行精细解剖，去除多余的肌肉及结缔组织，并剪去血管外膜。将精细解剖后的小鼠血管置于预冷的4％多聚甲醛溶液中固定。将固定好的血管在预冷的PBS中简单冲洗，于体视显微镜下沿主动脉弓小弯一侧剖开，暴露内膜，在大弯侧剪开到主动脉弓结束。把解剖好的主动脉全段放到避光的1.5mLEP管内，加入1mL油红O工作液，室温避光染色2h。染色完毕后先在PBS中洗一下，然后在60％异丙醇水溶液中脱色3次，每次10min。脱色完毕后放入PBS中保存并拍照。

4、统计分析方法：

应用SPSS 13.0软件对实验结果进行分析，各实验结果以均数±标准差表示。两组之间比较用t检验，多组比较用单因素方差分析，P＜0.05被认为具有统计学差异。

(二)实验结果

1、CuE对小鼠主动脉粥样硬化斑块面积的影响：

对各组小鼠主动脉全段进行油O染色，结果如图1所示，由该结果可以看出，CMC组主动脉斑块有明显分布，主动脉弓部及分支均有明显动脉硬化斑块形成；CuE-HD组的动脉斑块面积小，主动脉弓部及分支处斑块很小；与CMC组相比，sh-AMPK-CMC组主动脉的斑块面积有所增加，主动脉弓部及分支的动脉硬化斑块形成严重；与CuE-LD组相比，sh-AMPK-LD组的主动脉斑块面积有所增加，主动脉弓部及分支处斑块增多；与CuE-HD组相比，sh-AMPK-HD组的主动脉斑块面积有所增加。以上实验结果表明，CuE对ApoE-/-小鼠动脉硬化斑块形成有一定的缓解作用，通过慢病毒敲减AMPK能部分减弱CuE的保护作用，说明AMPK是CuE的一个作用靶点。

2、CuE对小鼠主动脉窦粥样硬化斑块面积的影响：

油红“O”染色分析CuE对小鼠主动脉窦粥样斑块面积的影响如图2所示，由该结果可以看出，经过10周的高脂高胆固醇膳食的诱导，CMC组主动脉窦部有明显的动脉硬化斑块形成，病变已经十分明显，主动脉窦部已经有一定程度的扩张；

CuE-LD组与CMC组相比动脉硬化斑块面积减小，病变有所减轻；CuE-HD组是各实验组中斑块面积最小，病变程度最轻的一组；与CMC组相比，sh-AMPK-CMC组动脉硬化斑块面积有所增加，主动脉窦部扩张更为明显，病变更加严重；

sh-AMPK-LD组比CuE-LD组动脉硬化斑块面积大，sh-AMPK-HD组比CuE-HD动脉硬化斑块面积大。sh-AMPK-HD组斑块面积比sh-AMPK-CMC组和sh-AMPK-LD组有所减小，以上实验结果说明CuE对动脉粥样硬化的保护作用，以及AMPK是CuE发挥作用的一个靶点。

(三)实验讨论及化合物评价：

内皮功能障碍及粘附分子的表达是动脉粥样硬化病变的起始环节，血管内皮的“损伤-反应”能募集血液中的血小板、白细胞和单核巨噬细胞。粘附分子参与炎症细胞在血管内皮的粘附，CuE在细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)诱导的内皮功能障碍中发挥保护作用，我们推测其对动脉硬化也有一定的保护和治疗作用。C57BL/6遗传背景的LDL-/-和ApoE-/-小鼠是目前研究动脉硬化的经典模型。

ApoE-/-小鼠的特点是有明显的泡沫细胞、纤维帽和坏死灶的形成，是与人动脉硬化病变过程最为相似的实验动物。ApoE-/-小鼠在正常饮食情况下就能形成动脉硬化，通过给予ApoE-/-小鼠含1.25％胆固醇的高脂膳食加速诱导动脉硬化模型，明确CuE对动脉硬化病变的影响。结果表明，低剂量葫芦素E(0.5mg/kg体重)对主动脉窦部斑块形成有缓解的效果，高剂量葫芦素E(1.0mg/kg体重)能减少主动脉窦及主动脉全段斑块的形成。对于其分子机制，实验结果已经明确葫芦素E能激活AMPK，为验证CuE是否通过激活AMPK缓解ApoE-/-小鼠的动脉硬化病变，我们设置了sh-AMPK慢病毒敲减组。结果表明，敲减AMPK能加重ApoE-/-小鼠的动脉硬化，CuE的保护作用有所减弱。与单纯敲减AMPK组相比，敲减同时给予高剂量葫芦素E仍能部分减少斑块形成。这些结果说明CuE能通过激活AMPK发挥对ApoE-/-小鼠动脉硬化的缓解作用，但其可能不是唯一靶点。

实施例2 CuE对C57小鼠动脉内皮功能障碍的影响

(一)材料与方法

1、药物准备：

同实施例1药物准备

2、动物模型分组、给药方法：

本实验选用C57BL/6小鼠雄性(北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006)和AMPKα2-/-小鼠(B.Voillet教授惠赠，在实验室进行繁殖及鉴定)各10只，分别按体重随机分组：野生炎症组(CMC+WT-LPS)，CuE野生炎症组(CuE+WT-LPS)，AMPKα2-/-炎症组(CMC+AMPKα2-/--LPS)，CuE AMPKα2-/-炎症组(CuE+AMPKα2-/--LPS)，每组5只。以葫芦素E或羧甲基纤维素预先灌胃7天，灌胃剂量为1.0mg/kg·d，随后应用LPS对各组小鼠进行血管炎症诱导。

3、其他实验材料：

羧甲基纤维素钠(北京索莱宝科技有限公司)，多聚甲醛(天津永大化学试剂有限公司)，PBS粉末(北京博奥拓达科技有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(北京博奥拓达科技有限公司)，Triton-X 100(ACROS，USA)，Alexa 594标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Hoechst(碧云天生物技术研究所)，抗荧光淬灭封片剂(碧云天生物技术研究所)。

4、免疫荧光的检测方法：

小鼠血管先在4％多聚甲醛中4℃固定24h，然后在预冷的PBS中灌洗，再进行梯度脱水。脱水步骤为，先置于4℃15％蔗糖溶液中至血管组织完全下沉，后换至4℃30％蔗糖溶液中至血管组织完全下沉。完成脱水的血管组织在预冷的PBS溶液中灌洗干净，在冰冻切片机的速冻台上用OCT包埋剂进行包埋，然后切片。取出组织切片，室温平衡5min。先去除组织包埋剂。用PBS温和冲洗5遍，并浸泡3次，每次3min。再对组织进行穿透处理，穿透液为含有1％BSA及4％TritonX-100的PBS溶液，室温穿透2h。洗涤，用PBS温和冲洗5遍，并浸泡3次，每次3min。封闭切片，封闭液为含有5％BSA的PBS溶液，室温封闭2h。洗涤，条件同上。孵育一抗，PBS稀释抗体，在湿盒中4℃孵育过夜。洗涤，条件同上。孵育二抗，用PBS稀释抗体，室温湿盒中孵育1h。洗涤，条件同上。用含有0.5μg/mL Hoechst的PBS染核，室温30min，洗涤，条件同上。用抗荧光淬灭封片剂进行封片，在盖玻片周围涂适量透明甲油，然后在激光共聚焦显微镜下观察拍照。

(二)实验结果

CuE对血管内皮功能障碍的影响：

对各组小鼠进行血管炎症诱导，检测各组VCAM-1及ICAM-1水平，结果表明，对野生型炎症小鼠，CuE能显著降低血浆中VCAM-1水平(P＜0.05)，ICAM-1有降低趋势但无差异(P＝0.0757)；而AMPKα2-/-炎症小鼠在CuE作用下，血浆中VCAM-1水平仅有下降趋势，没有统计学差异，ICAM-1没有明显变化(图3A)。应用免疫荧光检测各组小鼠主动脉内皮VCAM-1的原位表达情况，结果表明，在野生型小鼠中，CuE的干预对LPS诱导的血管内皮炎症有一定的保护作用，能显著降低主动脉血管内皮VCAM-1的表达；而在AMPKα2-/-小鼠中，CuE的保护作用有所减弱(图3B)。这些结果进一步证明了CuE能通过激活AMPK抑制LPS诱导的VCAM-1表达，在血管内皮功能障碍中起保护作用。

(三)实验讨论及化合物评价：

在血管内皮功能障碍过程中，内皮一氧化氮合酶活性降低，细胞中一氧化氮含量下降，引起VCAM-1表达增加。功能障碍的内皮细胞中活性氧簇和C反应蛋白等都能诱导粘附分子表达增加，所以检测粘附分子的表达能反映血管内皮功能状态，反应炎症反应。我们通过ELISA试剂盒检测血浆中粘附因子的表达，以及免疫荧光检测小鼠主动脉内皮VCAM-1的原位表达情况得出结论，CuE激活AMPK抑制LPS诱导的VCAM-1表达(抗炎)，在血管内皮功能障碍中起保护作用。

实施例3 CuE对高脂喂养的C57小鼠血管内皮凋亡的影响

(一)材料与方法

1、药物准备：

同实施例1药物准备

2、动物模型分组、给药方法：

本实验选用8周龄C57BL/6小鼠(北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006)，30只，分别按体重随机分组，每组10只：正常对照组(CMC)，高脂对照组(HFD+CMC)，高脂+CuE组(HFD+CuE)。正常对照组给予AIN93M；其余两组给予高脂饲料，高脂饲料是以AIN93M为基础调整供能比，脂肪供能比45％。高脂喂养8周后，以羧甲基纤维素或CuE灌胃，灌胃剂量为1.0mg/kg.d，灌胃8周后处死小鼠。

3、其他实验材料：

羧甲基纤维素钠、山羊血清、DAB显色液、苏木精(北京索莱宝科技有限公司)；多聚甲醛(天津永大化学试剂有限公司)；PBS粉末(北京博奥拓达科技有限公司)；HRP标记亲和素、生物素化山羊抗兔IgG(碧云天生物技术有限公司)；Triton-X 100(ACROS，USA)；无水乙醇、过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司)；cleaved-Caspase 3抗体(CST,USA)。

4、免疫组化的检测方法

小鼠的麻醉取主动脉窦，制备主动脉窦部切片参考实施例1。将放置于-80℃的冰冻切片PBS中浸泡2min，重复3次，以去除包埋剂。采用含0.01％的triton100的PBS溶液对组织穿透1.5h,PBS中浸泡5min重复3次3％H2O2室温孵育15min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS中浸泡5min，重复3次。滴加正常山羊血清，室温孵育15min，倾去血清，勿洗。孵育一抗Cleaved-Caspase3，PBS稀释，稀释比例1:200，二抗用PBS稀释200倍，滴加至完全覆盖组织，湿盒内37℃孵育30min，浸泡在PBS中5min，重复3次。取出切片，擦干，摆放在湿盒中，滴加HRP标记亲和素，用PBS按1:200稀释，37℃孵育30min。取出切片，摆放在切片架上，浸泡在PBS中5min，重复3次。将DAB显色试剂A、B等量混合。切片取出，擦干周围多余水分，滴加100μl显色试剂，待颜色刚刚变深时迅速置于水中终止反应。然后用苏木素复染、脱水、透明、封片，于显微镜下观察染色效果。实验中同时设有阴性对照。

(二)实验结果

CuE对高脂喂养小鼠动脉内皮凋亡的影响：

当凋亡启动时，Caspase降解产生Cleaved-Caspase3，因此常用Caspase3的表达反应凋亡情况，与正常饲料喂养小鼠相比，高脂喂养小鼠动脉血管内皮cleaved-Caspase 3表达增加；与高脂喂养小鼠相比，高脂喂养小鼠给予CuE后动脉血管内皮cleaved-Caspase3表达降低(图4)，说明CuE可以改善血管内皮的凋亡。

(三)实验讨论及化合物评价

高脂膳食可以导致血中游离脂肪酸升高、血糖升高，当血管内皮暴露于危险因素如高游离脂肪酸、高血糖等条件下，将发生一系列的改变，包括内皮炎症反应，血管通透性增加，血管张力下降，内皮功能障碍，最终会导致凋亡。凋亡是动脉粥样硬化的关键早期变化，动物实验证实CuE确实可以改善血管内皮细胞的凋亡。说明CuE改善血管内皮细胞的凋亡可能为其缓解动脉粥样硬化发展的一个机制。

Claims (2)

1.葫芦素E(Cucurbitacin E，CuE)在制备抗动脉粥样硬化药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，葫芦素E通过减少炎症反应，减少动脉粥样硬化斑块面积，减少动脉粥样硬化斑块中脂质的沉积，抑制血管内皮细胞的凋亡来达到防治动脉粥样硬化的目的。