CN114994206A - 一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法 - Google Patents
一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯的总含量为1.9～14.5mg。干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定均采用液相色谱法测定。本申请的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定白花蛇舌草标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立白花蛇舌草汤剂可行的质量标准，实现白花蛇舌草标准汤剂质量的有效控制。
Description
技术领域
本申请涉及中药材质量控制技术领域，具体是涉及到一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物，根细长，分枝，白花，茎略带方形或扁圆柱形，光滑无毛，从基部发出多分枝，味苦、淡，性寒。主要功效是清热解毒、消痛散结、利尿除湿。尤善治疗各种类型炎症。在临床实践中，发现白花蛇舌草若配伍得当，可治疗多种疾病。目前，关于白花蛇舌草药材的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测白花蛇舌草汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本申请的目的是要解决现有技术的不足，提供一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，以更好的控制白花蛇舌草汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本申请采用如下技术方案：
通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯的总含量为1.9～14.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以白花蛇舌草对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以车叶草苷酸对照品制成的溶液作为对照品溶液，以白花蛇舌草标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
在其中一个实施例中，所述煎煮法包括：取白花蛇舌草饮片加水浸泡30～40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30～40min，第二次煎煮时长为25～30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得白花蛇舌草标准汤剂干膏粉。
在其中一个实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取白花蛇舌草标准汤剂样品0.5g，加乙醇20mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取白花蛇舌草对照药材5.0g，加水100mL，煎煮并保持微沸30min，滤过，蒸干，残渣加乙醇10mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为对照药材溶液a；
(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各2μL；展开剂：体积比为20:40:14:1的石油醚-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
在其中一个实施例中，所述照薄层色谱法中，所述石油醚的沸程规格为30～60℃。
在其中一个实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取1g白花蛇舌草对照药材，加80％甲醇25mL，称定重量，回流20分钟，放冷，称重，补足失重，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取车叶草苷酸对照品适量，精密称定，加30％甲醇溶解，制得浓度为100μg/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取白花蛇舌草标准汤剂样品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液b。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量包括：
进行液相色谱仪分析，以车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以白花蛇舌草标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1mm×150mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：236nm。
在其中一个实施例中，采用液相色谱法测定车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量，精密称定，加30％甲醇溶解，制成每1mL含车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯各100μg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取白花蛇舌草标准汤剂样品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
本申请的有益效果是：
(1)通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定白花蛇舌草标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立白花蛇舌草汤剂可行的质量标准，实现白花蛇舌草标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)白花蛇舌草饮片依方案煎煮制得白花蛇舌草饮片标准汤剂，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均为5.044mg/g，实测含量范围为1.237mg/g～12.289mg/g，SD(标准差)为3.154。按均值的70％～130％计算，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为3.531mg/g～6.557mg/g。按照均值-SD～均值+3SD来算，含量允许范围为1.890mg/g～14.506mg/g，故拟定白花蛇舌草标准汤剂标准的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为1.9mg/g～14.5mg/g。车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均转移率为83.77％，测得转移率范围为64.56％～111.84％，SD为11.54。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，含量转移率允许范围为58.64％～108.90％，按照均值-SD～均值+3SD来算，含量转移率允许范围为72.23％～118.39％。考虑到转移率上限为100.00％，故拟定白花蛇舌草标准汤剂的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量转移率范围为58.6％～100.0％。本申请多个批次标准汤剂中车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量及其转移率均在允许范围之内，因此本申请可为白花蛇舌草配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
图1为本申请一实施例中白花蛇舌草饮片标准汤剂薄层鉴别图谱；其中，1组图谱为阴性对照样品薄层图谱，2组为白花蛇舌草对照药材溶液薄层图谱，3～16组为白花蛇舌草饮片14批次标准汤剂薄层图谱。
图2为本申请一实施例中白花蛇舌草饮片标准汤剂薄层鉴别图谱；其中，17组图谱为白花蛇舌草对照药材溶液薄层图谱，18～33组为白花蛇舌草饮片16批次标准汤剂薄层图谱。
图3为本申请色谱条件确定中不同检测波长的对比图。
图4为本申请色谱条件确定中不同柱温的对比图。
图5为本申请色谱条件确定中不同流速的对比图。
图6为本申请色谱条件确定中不同流动相的对比图。
图7为本申请色谱条件确定中不同梯度的对比图。
图8为本申请提取方法考察中不同提取方法对比图。
图9为本申请提取时间考察中不同提取时间对比图。
图10为本申请提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图。
图11为本申请样品取用量考察中不同样品量对比图。
图12为本申请专属性考察中空白溶剂对比图。
图13为本申请重复性试验共有峰叠加特征图谱。
图14为本申请精密度试验共有峰叠加特征图谱。
图15为本申请稳定性试验共有峰叠加特征图谱。
图16为本申请标准汤剂特征图谱测定中车叶草苷酸对照品图谱。
图17为本申请标准汤剂特征图谱测定中车叶草苷酸对照品和供试品叠加图谱。
图18为本申请标准汤剂特征图谱测定中白花蛇舌草对照药材图谱。
图19为本申请标准汤剂特征图谱测定中28批白花蛇舌草中药饮片叠加图谱；其中，S1～S28表示1～28批白花蛇舌草中药饮片叠加图谱。
图20为本申请标准汤剂特征图谱测定中28批白花蛇舌草中药饮片共有峰图谱。
图21为本申请28批白花蛇舌草标准汤剂叠加图谱；其中，S1～S28表示1～28批白花蛇舌草标准汤剂叠加图谱。
图22为本申请标准汤剂特征图谱测定中28批白花蛇舌草标准汤剂拟合图谱。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本申请进一步详细说明。
本申请提供一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法：
通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯的总含量为1.9～14.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定均采用液相色谱法测定。
本实施例中：
制备白花蛇舌草标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的固定前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等相关参数进行煎煮，再进行固液分离、浓缩干燥。具体的，取30批次白花蛇舌草饮片加水至没过药材约4～5cm，浸泡30～40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30～40min，第二次煎煮时长为25～30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得30批次白花蛇舌草标准汤剂干膏粉。
1.性状考察
根据30批次白花蛇舌草标准汤剂的实物性状特征，描述为棕色至棕褐色的粉末，气微，味微苦。
2.干浸膏出膏率测试
取30批次白花蛇舌草饮片，按上述制法制得30批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，平均得率为13.01％。标准汤剂出膏率允许范围按照均值加减3倍SD计算，为7.85％～18.17％；按照均值的70％～130％计算，为9.11％～16.91％，故拟定标准汤剂出膏率允许范围为9.1％～16.9％。
表1：出膏率
上述结果表明，30批次标准汤剂干浸膏出膏率为9.86％～15.92％，均符合拟定限度范围9.1％～16.9％。
3.薄层鉴别
本品为单味饮片白花蛇舌草的干燥提取物，统计所有省份公布的中药配方颗粒白花蛇舌草配方颗粒薄层方案，以及《中药配方颗粒薄层色谱彩色图集》一书中的白花蛇舌草配方颗粒薄层方案，共有四种方案。其中湖南、上海，以及安徽、北京等13省公布的方法，经过试验，特征点效果不及图集中的方法，故采用《中药配方颗粒薄层色谱彩色图集》一书中公布薄层方案。经30批次标准汤剂样品检验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
供试品溶液制备：取白花蛇舌草标准汤剂样品0.5g，加乙醇20mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：取白花蛇舌草对照药材5.0g，加水100mL，煎煮并保持微沸30min，滤过，蒸干，残渣加乙醇10mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为对照药材溶液。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液与对照药材溶液各2μL；展开剂：体积比为20:40:14:1的石油醚-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
结果：供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，详见图1和图2。
4.浸出物测定
取30批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：浸出物测定结果
上述结果表明，30批次标准汤剂浸出物均值为27.69％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，即均值的70％为19.38％；参考标准限度允许范围(均值加减3倍SD)的下限，即均值减3SD，为16.80％。通过比较，均值70％的结果既低于30批标准汤剂的最低检测值21.55％，也与最低检测值更接近，因此，拟定本品醇溶性浸出物不得少于19.4％，30批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
5.特征图谱测试
5.1色谱条件确定
5.1.1最佳吸收波长的确定
基于方法的色谱条件结合PAD检测器对白花蛇舌草标准汤剂样品进行多波长的扫描，扫描波长200～400nm，并选取3种检测波长进行研究，确定最佳吸收波长。
取白花蛇舌草标准汤剂粉末约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液。
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津Shim-pack GIST C18-AQ,4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL，柱温为30℃，进样量为10μL，检测波长为210、254、270nm，扫描结果见图3。
表3：梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 1 | 99 |
| 5～8 | 1→2 | 99→98 |
| 8～38 | 2→21 | 98→79 |
| 38～53 | 21→26 | 79→74 |
| 53～65 | 26→42 | 74→58 |
| 65～85 | 42→90 | 58→10 |
| 85～88 | 90→1 | 10→99 |
| 88～98 | 1 | 99 |
如图3所示，样品在200～270nm之间有较强、较多的吸收，对3种检测波长210nm、254nm、270nm进行研究。通过对比3种检测波长色谱图，选取254nm作为检测波长时，各特征峰分离度较好，干扰较小，基线平稳，故选取254nm作为检测波长。
5.1.2柱温的考察
选取25℃、30℃、35℃柱温进行比较，检测波长为254nm，其他条件与5.1.1中相同，结果见图4。如图4所示，通过对比三种不同柱温的色谱图，三种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，故选取较为分离效果较好的25℃作为检测柱温。
5.1.3流速的考察
选取0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min这三种流速进行比较，检测波长为254nm，柱温为25℃，其他条件与5.1.1中相同，结果见图5。如图5所示，通过对比三种不同流速的色谱图，三种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取0.8mL/min作为流速时，峰分离度较好，故选取0.8mL/min作为流速。
5.1.4流动相的考察
选取0.5％甲酸、0.5％乙酸、0.1％磷酸溶液三种流动相进行比较，流速为0.8mL/min,柱温为25℃,检测波长为254nm,其他条件与5.1.1中相同，结果见图6。如图6所示，通过对比三种不同流动相的色谱图，选取0.1％磷酸溶液为流动相时，峰的信息完整，分离度符合要求，且基线平整，故选取0.1％磷酸作为流动相。
5.1.5梯度优化
选取下列三种梯度进行比较，梯度1见表4，梯度2见表5，梯度3见5.1.1中的表3，检测波长为254nm，其他条件与5.1.1中相同，结果见图7。
表4：梯度1洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～32 | 2→26 | 98→74 |
| 32～55 | 26→90 | 74→10 |
| 55～57 | 90→2 | 10→98 |
| 57～67 | 2 | 98 |
表5：梯度2洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～5 | 1 | 99 |
| 5～8 | 1→2 | 99→98 |
| 8～38 | 2→21 | 98→79 |
| 38～63 | 21→26 | 79→74 |
| 63～75 | 26→42 | 74→58 |
| 75～95 | 42→90 | 58→10 |
| 95～98 | 90→1 | 10→99 |
| 98～108 | 1 | 99 |
如图7所示，梯度3分离效果较好，故最终确定较为稳定的梯度3作为白花蛇舌草标准汤剂特征图谱的洗脱梯度。
5.2液相色谱法
通过5.1的测试结果，确定出液相色谱的色谱条件如下：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(岛津Shim-pack GIST C18-AQ，4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
(1)制备参照物溶液：取1g白花蛇舌草对照药材，加80％甲醇25mL，称定重量，回流20分钟，放冷，称重，补足失重，滤过，取续滤液，作为参照物溶液；
(2)制备对照品溶液：分别取车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量，精密称定，分别加30％甲醇溶解，分别制得浓度为100μg/mL的两种对照品溶液；
(3)制备供试品溶液：取白花蛇舌草标准汤剂样品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液、两种对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.3方法学考察
提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声提取、回流提取，按上述5.2试验方法进行测定。结果表明，如图8所示，主峰个数一致，不同提取方式峰形差别不大。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为5.63％，见表6，大于3.0％，故选择超声为样品提取方式。
表6：不同提取方法对比
提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.2试验方法进行测定。如图9所示，主峰个数一致，不同提取时间的差别不大。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为1.23％，小于3.0％，见表7。由于无明显差别，为节约时间，方便实验，故选择30min为供试品提取时间。
表7：不同提取时间对比
提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。如图10所示，主峰个数一致，图谱无明显差异。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为19.89％，大于3.0％，见表8。故选择(总峰面积/取样量)值较大的80％甲醇为提取溶剂。
表8：不同提取溶剂对比
样品取用量考察：分别取不同样品量(0.2g、0.4g、0.6g)制备供试品溶液，按5.2试验方法进行测定。如图11所示，不同取样量，峰形差别较小。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为0.77％，小于3.0％，见表9。故选择(总峰面积/取样量)值较大的取样量0.4g为供试品溶液制备的取样量。
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取白花蛇舌草标准汤剂粉末约0.4g,精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.4特征图谱分析方法验证
专属性考察：取供试品用溶剂水10μL，按5.2色谱条件进行测定，试验表明，如图12所示，空白溶剂无干扰，该方法专属性良好。
重复性试验：取白花蛇舌草标准汤剂样品约0.4g，共6份，按5.2色谱条件进行测定，进样6针测定。如图13所示，测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有9个共有峰，以车叶草苷酸峰为参照峰S，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对保留时间RSD值(见表9)、相对峰面积RSD值(见表10)，均小于3.0％，在合格范围内(见下表)。试验表明该方法重现性良好。
表9：重复性试验特征图谱相对保留时间
表10：重复性试验特征图谱相对峰面积
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(％) |
| 1 | 3.645 | 3.625 | 3.590 | 3.607 | 3.682 | 3.614 | 0.90 |
| 2 | 6.248 | 6.222 | 6.138 | 6.167 | 6.306 | 6.313 | 1.15 |
| 3(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 4 | 5.051 | 5.020 | 4.897 | 5.155 | 5.113 | 5.152 | 1.95 |
| 5 | 0.177 | 0.179 | 0.176 | 0.175 | 0.182 | 0.179 | 1.36 |
| 6 | 0.824 | 0.784 | 0.817 | 0.813 | 0.819 | 0.825 | 1.87 |
| 7 | 1.302 | 1.256 | 1.207 | 1.279 | 1.310 | 1.290 | 2.97 |
| 8 | 1.683 | 1.677 | 1.642 | 1.644 | 1.703 | 1.711 | 1.72 |
| 9 | 2.305 | 2.288 | 2.254 | 2.227 | 2.323 | 2.311 | 1.62 |
精密度试验：取白花蛇舌草标准汤剂样品约0.4g，按5.2色谱条件进行测定，连续进样6针测定。如图14所示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有9个共有峰，以车叶草苷酸峰为参照峰S，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对保留时间RSD值(见表11)、相对峰面积RSD值(见表12)，均小于3.0％，在合格范围内。试验表明仪器精密度良好。
表11：精密度试验特征图谱相对保留时间
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(％) |
| 1 | 0.840 | 0.835 | 0.838 | 0.837 | 0.836 | 0.835 | 0.23 |
| 2 | 0.909 | 0.908 | 0.910 | 0.909 | 0.908 | 0.907 | 0.12 |
| 3(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 4 | 1.365 | 1.379 | 1.376 | 1.374 | 1.371 | 1.371 | 0.35 |
| 5 | 1.484 | 1.498 | 1.496 | 1.493 | 1.489 | 1.489 | 0.35 |
| 6 | 1.519 | 1.530 | 1.527 | 1.525 | 1.521 | 1.521 | 0.28 |
| 7 | 1.590 | 1.603 | 1.599 | 1.597 | 1.593 | 1.593 | 0.30 |
| 8 | 2.443 | 2.458 | 2.444 | 2.437 | 2.430 | 2.431 | 0.42 |
| 9 | 2.673 | 2.684 | 2.668 | 2.659 | 2.652 | 2.653 | 0.47 |
表12：精密度试验特征图谱相对峰面积
稳定性试验：取白花蛇舌草标准汤剂样品约0.4g，按5.2色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定。如图15所示，特征图谱峰形、峰数基本一致。特征图谱中有9个共有峰，以车叶草苷酸峰为参照峰S，计算峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对保留时间RSD值(见表13)、相对峰面积RSD值(见表14)，均小于3.0％，在合格范围内。试验表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表13：稳定性试验特征图谱相对保留时间
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(％) |
| 1 | 0.832 | 0.832 | 0.831 | 0.833 | 0.834 | 0.831 | 0.14 |
| 2 | 0.907 | 0.907 | 0.907 | 0.907 | 0.908 | 0.907 | 0.05 |
| 3(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 4 | 1.378 | 1.380 | 1.381 | 1.378 | 1.374 | 1.379 | 0.18 |
| 5 | 1.499 | 1.500 | 1.501 | 1.498 | 1.493 | 1.500 | 0.19 |
| 6 | 1.532 | 1.533 | 1.534 | 1.530 | 1.526 | 1.533 | 0.19 |
| 7 | 1.604 | 1.605 | 1.606 | 1.602 | 1.598 | 1.605 | 0.18 |
| 8 | 2.469 | 2.471 | 2.472 | 2.466 | 2.457 | 2.474 | 0.25 |
| 9 | 2.701 | 2.703 | 2.705 | 2.697 | 2.686 | 2.706 | 0.27 |
表14：稳定性试验特征图谱相对峰面积
| 峰号 | S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | RSD(％) |
| 1 | 3.777 | 3.720 | 3.721 | 3.719 | 3.726 | 3.841 | 1.32 |
| 2 | 6.732 | 6.618 | 6.637 | 6.659 | 6.432 | 6.603 | 1.51 |
| 3(S) | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.00 |
| 4 | 5.977 | 5.855 | 5.873 | 5.879 | 5.668 | 5.605 | 2.44 |
| 5 | 0.194 | 0.202 | 0.198 | 0.203 | 0.202 | 0.206 | 2.16 |
| 6 | 0.896 | 0.898 | 0.890 | 0.895 | 0.867 | 0.884 | 1.32 |
| 7 | 1.427 | 1.417 | 1.421 | 1.402 | 1.339 | 1.399 | 2.30 |
| 8 | 1.828 | 1.800 | 1.801 | 1.806 | 1.747 | 1.793 | 1.50 |
| 9 | 2.502 | 2.448 | 2.449 | 2.457 | 2.407 | 2.440 | 1.25 |
5.5标准汤剂特征图谱表征分析
标准汤剂特征图谱测定
按照5.4拟定的特征图谱分析方法，测定28批白花蛇舌草标准汤剂及其制备使用的28批次中药饮片特征图谱，通过车叶草苷酸定位，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有9个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的9个特征峰保留时间相对应，其中与车叶草苷酸对照品参照物相对应的峰为峰3，共有峰特征图谱详见图16至图22。
特征色谱图相对保留时间测定
按照5.4拟定的特征图谱分析方法，测定28批白花蛇舌草标准汤剂特征图谱。结果显示，特征图谱中有9个共有峰，以车叶草苷酸参照物峰相对应的峰(3)为参照峰S，计算特征峰峰1、峰2、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见表15。
表15：28批标准汤剂共有峰相对保留时间
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性及稳定性验证考察，且符合要求。按上述拟定的特征图谱分析方法，对28批标准汤剂的特征图谱进行测定，结果分析，标定了9个共有特征峰，其中峰3为车叶草苷酸。以车叶草苷酸参照物相对应的峰(3)为S峰，计算另8个特征峰相对保留时间，以28批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.84(峰1)、0.91(峰2)、1.36(峰4)、1.47(峰5)、1.50(峰6)、1.58(峰7)、2.36(峰8)、2.56(峰9)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
6.1试验方法
白花蛇舌草中含有车叶草苷酸、车叶草苷、去乙酸基车叶草苷酸等成分。其中车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯是主要活性成分，且在白花蛇舌草三萜类化合物中占较大比例，根据现代药理研究表明，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸变等方面应用广泛。因此，本研究建立车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯的含量方法对于控制白花蛇舌草标准汤剂的质量有重要的参考价值。
对车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯对照品经行全波长扫描，确定其对佳吸收波长，结果结果表明：在236nm波长下检测，基线平稳，分离度好，无杂质峰干扰，故选择236nm波长作为白花蛇舌草标准汤剂含量测定的检测波长。
采用液相色谱法测定车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯含量，以车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯对照品制成的溶液作为对照品溶液，以白花蛇舌草标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1mm×150mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表16的规定进行梯度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：236nm。
表16：梯度洗脱程序
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～8 | 1→8 | 99→92 |
| 8～15 | 8 | 92 |
| 15～20 | 8→1 | 92→99 |
制备对照品溶液：取车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量，精密称定，加30％甲醇制成每1mL各含100μg的溶液。
制备供试品溶液：取白花蛇舌草标准汤剂粉末约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.3标准汤剂及中药材含量测定
照上述拟定的含量分析方法，测定30批白花蛇舌草标准汤剂及其制备使用的30批次白花蛇舌草饮片车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量，结果见表17、表18。
表17：30批白花蛇舌草中药饮片测定结果
本品饮片中车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均为0.816mg/g，实测含量范围为0.178mg/g～1.975mg/g，SD为0.534；按均值的70％～130％计算，岩车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为0.571mg/g～1.061mg/g。按照均值-SD～均值+3SD来算，含量允许范围为0.282mg/g～2.418mg/g。
表18：30批白花蛇舌草标准汤剂测定结果
本品标准汤剂中车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均为5.044mg/g，实测含量范围为1.237mg/g～12.289mg/g，SD为3.154；按均值的70％～130％计算，岩车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为3.531mg/g～6.557mg/g。按照均值-SD～均值+3SD来算，含量允许范围为1.890mg/g～14.506mg/g。虽然30批标准汤剂有两批含量低于1.890％，但为了保证提高白花蛇舌草配方颗粒的质量，有必要适当提高白花蛇舌草配方颗粒的标准，鉴于此，本标准汤剂拟按照均值-SD～均值+3SD来计算，允许范围为1.890mg/g～14.506mg/g。保留1位小数，拟定本标准汤剂的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为：1.9mg/g～14.5mg/g。
含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对30批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算白花蛇舌草酸含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。白花蛇舌草饮片标准汤剂由白花蛇舌草饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其白花蛇舌草含量转移率见表19。
表19：30批白花蛇舌草标准汤剂含量转移率
由以上数据可知，白花蛇舌草饮片依方案煎煮制得白花蛇舌草饮片标准汤剂，本品车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均转移率为83.77％，测得转移率范围为64.56％～111.84％，SD为11.54。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为58.64％～108.90％；按照均值-SD～均值+3SD来算，为72.23％～118.39％。比较三组范围数据，以转移率均值的70％～130％计算更为合理，考虑到转移率最高限为100.00％，故拟定范围为58.64％～108.90％。保留一位小数，本标准汤剂的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量转移率范围为58.6％～100.0％。
本申请提供的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定白花蛇舌草标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立白花蛇舌草汤剂可行的质量标准，实现白花蛇舌草标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。白花蛇舌草饮片依方案煎煮制得白花蛇舌草饮片标准汤剂，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均为5.044mg/g，实测含量范围为1.237mg/g～12.289mg/g，SD为3.154。按均值的70％～130％计算，车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为3.531mg/g～6.557mg/g。按照均值-SD～均值+3SD来算，含量允许范围为1.890mg/g～14.506mg/g，故拟定白花蛇舌草标准汤剂标准的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量允许范围为1.9mg/g～14.5mg/g。车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯总含量平均转移率为83.77％，测得转移率范围为64.56％～111.84％，SD为11.54。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，含量转移率允许范围为58.64％-108.90％，按照均值-SD～均值+3SD来算，含量转移率允许范围为72.23％～118.39％。考虑到转移率上限为100.00％，故拟定白花蛇舌草标准汤剂的车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯总含量转移率范围为58.6％～100.0％。本申请多个批次标准汤剂中车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量及其转移率均在允许范围之内，因此本申请可为白花蛇舌草配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法：
通过对白花蛇舌草标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含车叶草苷酸和去乙酰车叶草酸甲酯的总含量为1.9～14.5mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以白花蛇舌草对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以车叶草苷酸对照品制成的溶液作为对照品溶液，以白花蛇舌草标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
2.如权利要求1所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取白花蛇舌草饮片加水浸泡30～40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30～40min，第二次煎煮时长为25～30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得白花蛇舌草标准汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取白花蛇舌草标准汤剂样品0.5g，加乙醇20mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取白花蛇舌草对照药材5.0g，加水100mL，煎煮并保持微沸30min，滤过，蒸干，残渣加乙醇10mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1mL溶解，作为对照药材溶液a；
(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各2μL；展开剂：体积比为20:40:14:1的石油醚-甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
4.如权利要求3所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法中，所述石油醚的沸程规格为30～60℃。
5.如权利要求1所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
6.如权利要求1所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取1g白花蛇舌草对照药材，加80％甲醇25mL，称定重量，回流20分钟，放冷，称重，补足失重，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取车叶草苷酸对照品适量，精密称定，加30％甲醇溶解，制得浓度为100μg/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取白花蛇舌草标准汤剂样品粉末0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液b。
7.如权利要求1所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量包括：
进行液相色谱仪分析，以车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以白花蛇舌草标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(2.1mm×150mm，1.7μm)；流动相：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：236nm。
8.如权利要求7所述的白花蛇舌草标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯对照品适量，精密称定，加30％甲醇溶解，制成每1mL含车叶草苷酸、去乙酰车叶草酸甲酯各100μg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取白花蛇舌草标准汤剂样品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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