CN114990210A - hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用。本发明通过研究证明，早产儿视网膜病变患者hsa_circRNA_103554水平降低，与正常对照具有显著性差异，临床上可以作为诊断早产儿视网膜病变的生物标志物用于对早产儿视网膜病变患者诊断及鉴别诊断。并且，下调hsa_circRNA_103554水平可以构建早产儿视网膜病变的模型。

Description

hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用。

背景技术

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)是指在孕36周以下、低出生体重、长时间吸氧的早产儿，其未血管化的视网膜发生纤维血管瘤增生、收缩，并进一步引起牵拉性视网膜脱离和失明。早产儿视网膜病变绝大多数发生于早产儿，该病一旦发生，进展很快，可有效治疗的时间窗口很窄，对早产儿严格限制用氧，是惟一的有效预防措施。及早发现，及时施行冷凝或激光光凝，有阻止病变进一步恶化的成功报导。

早产儿视网膜病变防治的关键是早期发现并及时治疗。但目前的ROP诊断仍主要是通过眼底检查来确定，诊断前要对患儿的恒温箱病史有清楚的了解，检查过程中观察眼底相关神经纤维层是否出现变态症状；同时还要及时进行多普勒超声波检查，这些方法结合起来能够帮助医生做出较为准确的诊断。但现有的方法检测的时效性较差，且诊断过程非常复杂，如果能够更早的发现异常，则有利于ROP的更有效的治疗。

circRNA是一类由特殊剪切机制形成的、具有闭合环状结构的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)，大量研究揭示了circRNA作为糖尿病视网膜病变(DR)、视网膜母细胞瘤和年龄相关性黄斑变性的诊断生物标志物的潜在价值。CircRNAs也被认为是治疗视网膜新生血管疾病的治疗靶点。但以circRNA作为早产儿视网膜病变诊断的生物标志物的研究尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用。

本发明研究发现，早产儿视网膜病变中hsa_circRNA_103554的表达水平被抑制。

因此，本发明提供了以hsa_circRNA_103554为标志物，在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

本发明还提供了检测hsa_circRNA_103554的试剂在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

本发明所述的早产儿视网膜病变诊断产品可用于早产儿视网膜病变的早期诊断。一些实施例中，所述的早产儿视网膜病变诊断产品为诊断的试剂、诊断的工具和/或诊断所用的试剂盒，本发明对此不做限定。

进一步的，本发明还提供了早产儿视网膜病变的诊断产品，其包括如下I)～IV)中的任意一种：

I)、hsa_circRNA_103554的检测引物；

II)、hsa_circRNA_103554的检测探针；

III)、hsa_circRNA_103554的适配体；

IV)、用于检测hsa_circRNA_103554的芯片。

本发明提供的检测hsa_circRNA_103554的试剂可以对hsa_circRNA_103554进行定性检测和/或定量检测。在本发明中，所述检测主要通过PCR或恒温扩增的方法进行，所述PCR法为普通PCR的方法，也可以为RT-qPCR、qRT-PCR或实时定量PCR；所述恒温扩增包括NASBA、RCA、HAD、RPA、LAMP、ERA或者NERA，所述PCR或恒温扩增检测的目标物可以为hsa_circRNA_103554，也可以为hsa_circRNA_103554的部分片段，或者为如上所述二者经转录获得的产物，本发明对此不做限定。

一些实施例中，所述hsa_circRNA_103554的检测引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物，和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。其中，SEQ ID NO.1所示序列为：CTGAACCAATACAGAGCAGACAT，SEQ ID NO:2所示序列为：GAACTGCCACACAGAAGAACTC。

本发明所述用于检测hsa_circRNA_103554芯片上可以担载本发明所述的引物，也可以担载其他可以用于检测hsa_circRNA_103554的物质，本发明对此不做限定。

本发明所述的诊断产品中还包括总RNA提取试剂、逆转录试剂和RT-qPCR检测试剂。

本发明所述的总RNA提取试剂为PBMCs的总RNA提取试剂，一些实施例中，所述总RNA的提取采用Trizol法。

本发明还提供了一种早产儿视网膜病变的诊断方法，其包括检测样本中的hsa_circRNA_103554表达量。

本发明实施例中，所述的检测采用RT-qPCR法，根据早产儿视网膜病变表达量判断样本是否来自于早产儿视网膜病变患者。所述样本为外周血PBMCs。

本发明提供的方法为针对需要治疗的早产儿视网膜病变患者的辅助诊断检测方法，该方法中所述判断样本是否来自于早产儿视网膜病变患者的方法包括：取检测对象外周血PBMC样本，以β-actin作为内参进行qRT-PCR检测，以hsa_circRNA_103554/β-actin的比值为0.0005235作为cut off值，该比值低于cutoff值，则该检测对象为需要治疗的早产儿视网膜病变的高风险人群，建议进一步结合眼底检查等手段进行确诊。早产儿视网膜病变患者患者体内hsa_circRNA_103554表达量显著低于正常对照，因此，敲低、敲除hsa_circRNA_103554的表达，或抑制hsa_circRNA_103554的活性，可以用于早产儿视网膜病变模型的构建。

本发明提供了以hsa_circRNA_103554为靶点，在构建早产儿视网膜病变模型中的应用。本发明进一步提供了如下i)～iii)中的任意一种在构建早产儿视网膜病变模型中的应用：

i)、敲除或敲低hsa_circRNA_103554的试剂；

ii)、抑制hsa_circRNA_103554活性的试剂；

iii)、提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性的物质。

一些实施例中，所述早产儿视网膜病变模型为动物模型或细胞模型

本发明还提供了构建早产儿视网膜病变模型的方法，其包括：敲除或敲低hsa_circRNA_103554、降低hsa_circRNA_103554活性或者提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性。

本发明还提供了构建早产儿视网膜病变模型的试剂，其包括如下i)～iii)中的任意一种：

i)、敲除或敲低hsa_circRNA_103554的试剂；

ii)、抑制hsa_circRNA_103554活性的试剂；

iii)、提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性的物质。

在本发明中，所述模型为动物模型或细胞模型。所述敲除或敲低hsa_circRNA_103554的试剂可以为对细胞进行转染或转化的试剂，本发明对此不做限定；本发明中所述抑制hsa_circRNA_103554活性的试剂能够使hsa_circRNA_103554的活性降低。而所述提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性的物质，可以为小分子化合物也可通过基因工程的手段对hsa_circRNA_103554抑制物进行过表达或活化的物质。本发明对此亦不做限定。

本发明还提供了构建早产儿视网膜病变模型的方法，其以本发明所述的试剂处理，以提高hsa_circRNA_103554的水平或活性。所述处理包括转化或转染。

本发明通过研究证明，早产儿视网膜病变患者hsa_circRNA_103554水平显著降低，与正常对照具有显著性差异，临床上可以作为诊断早产儿视网膜病变的生物标志物用于对早产儿视网膜病变患者诊断及鉴别诊断。并且，下调hsa_circRNA_103554水平可以构建早产儿视网膜病变的模型。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍：

图1示对照组(Control)与早产儿视网膜病变组(ROP)PBMCs之间差异表达环状RNA的分层聚类分析产生的热图；色标显示不同样本中circRNA的相对表达水平，红色代表上调，绿色代表下调；

图2示早产儿视网膜病变患者PBMCs中差异表达circRNA火山图；其中，图中以绿色直线划分相应的fold change和P-values，fold change上调或下调2倍，且P<0.05；

图3示PBMCs目标circRNA经qPCR扩增后检测结果；图中数据以means±SD展示(Control:n1＝5，ROP:n2＝5),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；其中，图3中A、B分别示检测结果；样本量是Control:n1＝5，ROP:n2＝5共10个样本；

图4示RT-qPCR检测hsa_circRNA_103554在不同分组PBMCs中的表达情况；图中Control:n1＝23；ROP:n2＝24；**P<0.01,***P<0.001；

图5示hsa_circRNA_103554的ROC曲线；AUC为0.8822。

具体实施方式

本发明提供了hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

circRNA(cicular RNA,环状RNA)：是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。发明提供了一种用于早产儿视网膜病变早期诊断的环状非编码RNA，对早产儿视网膜病变的发病检测有重要意义。用于早产儿视网膜病变早期诊断的分子标记物hsa_circRNA_103554。

本发明中，hsa_circRNA_103554即对应hsa_circ_0068606，前者为ArraystarHuman circRNA Array V2(8x15K,Arraystar)芯片命名，后者为circbase统一命名。

>hsa_circ_0068606|NM_003234|TFRC，序列如SEQ ID No.3所示：

GTTCTTCTGTGTGGCAGTTCAGAATGATGGATCAAGCTAGATCAGCATTCTCTAACTTGTTTGGTGGAGAACCATTGTCATATACCCGGTTCAGCCTGGCTCGGCAAGTAGATGGCGATAACAGTCATGTGGAGATGAAACTTGCTGTAGATGAAGAAGAAAATGCTGACAATAACACAAAGGCCAATGTCACAAAACCAAAAAGGTGTAGTGGAAGTATCTGCTATGGGACTATTGCTGTGATCGTCTTTTTCTTGATTGGATTTATGATTGGCTACTTGGGCTATTGTAAAGGGGTAGAACCAAAAACTGAGTGTGAGAGACTGGCAGGAACCGAGTCTCCAGTGAGGGAGGAGCCAGGAGAGGACTTCCCTGCAGCACGTCGCTTATATTGGGATGACCTGAAGAGAAAGTTGTCGGAGAAACTGGACAGCACAGACTTCACCGGCACCATCAAGCTGCTGAATGAAAATTCATATGTCCCTCGTGAGGCTGGATCTCAAAAAGATGAAAATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATTTCGTGAATTTAAACTCAGCAAAGTCTGGCGTGATCAACATTTTGTTAAGATTCAGGTCAAAGACAGCGCTCAAAACTCGGTGATCATAGTTGATAAGAACGGTAGACTTGTTTACCTGGTGGAGAATCCTGGGGGTTATGTGGCGTATAGTAAGGCTGCAACAGTTACTGGTAAACTGGTCCATGCTAATTTTGGTACTAAAAAAGATTTTGAGGATTTATACACTCCTGTGAATGGATCTATAGTGATTGTCAGAGCAGGGAAAATCACCTTTGCAGAAAAGGTTGCAAATGCTGAAAGCTTAAATGCAATTGGTGTGTTGATATACATGGACCAGACTAAATTTCCCATTGTTAACGCAGAACTTTCATTCTTTGGACATGCTCATCTGGGGACAGGTGACCCTTACACACCTGGATTCCCTTCCTTCAATCACACTCAGTTTCCACCATCTCGGTCATCAGGATTGCCTAATATACCTGTCCAGACAATCTCCAGAGCTGCTGCAGAAAAGCTGTTTGGGAATATGGAAGGAGACTGTCCCTCTGACTGGAAAACAGACTCTACATGTAGGATGGTAACCTCAGAAAGCAAGAATGTGAAGCTCACTGTGAGCAATGTGCTGAAAGAGATAAAAATTCTTAACATCTTTGGAGTTATTAAAGGCTTTGTAGAACCAGATCACTATGTTGTAGTTGGGGCCCAGAGAGATGCATGGGGCCCTGGAGCTGCAAAATCCGGTGTAGGCACAGCTCTCCTATTGAAACTTGCCCAGATGTTCTCAGATATGGTCTTAAAAGATGGGTTTCAGCCCAGCAGAAGCATTATCTTTGCCAGTTGGAGTGCTGGAGACTTTGGATCGGTTGGTGCCACTGAATGGCTAGAGGGATACCTTTCGTCCCTGCATTTAAAGGCTTTCACTTATATTAATCTGGATAAAGCGGTTCTTGGTACCAGCAACTTCAAGGTTTCTGCCAGCCCACTGTTGTATACGCTTATTGAGAAAACAATGCAAAATGTGAAGCATCCGGTTACTGGGCAATTTCTATATCAGGACAGCAACTGGGCCAGCAAAGTTGAGAAACTCACTTTAGACAATGCTGCTTTCCCTTTCCTTGCATATTCTGGAATCCCAGCAGTTTCTTTCTGTTTTTGCGAGGACACAGATTATCCTTATTTGGGTACCACCATGGACACCTATAAGGAACTGATTGAGAGGATTCCTGAGTTGAACAAAGTGGCACGAGCAGCTGCAGAGGTCGCTGGTCAGTTCGTGATTAAACTAACCCATGATGTTGAATTGAACCTGGACTATGAGAGGTACAACAGCCAACTGCTTTCATTTGTGAGGGATCTGAACCAATACAGAGCAGACATAAAGGAAATGGGCCTGAGTTTACAGTGGCTGTATTCTGCTCGTGGAGACTTCTTCCGTGCTACTTCCAGACTAACAACAGATTTCGGGAATGCTGAGAAAACAGACAGATTTGTCATGAAGAAACTCAATGATCGTGTCATGAGA

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1早产儿视网膜病变circRNA表达谱的建立

1、样本收集：

该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批，符合赫尔辛基宣言的宗旨。从参与者的监护人那里获得了知情同意，并解释了研究的性质和可能的后果。2020年12月至2022年1月，中南大学湘雅二医院共有57名早产儿入组。其中，29例诊断为ROP的婴儿需要进一步治疗(筛查5例，验证24例)，如玻璃体内注射抗VEGF药物和激光光凝，试验组纳入遵循国际早产儿视网膜病变分类(ICROP)协议(ICCROP，2005)，即当婴儿患有：1.急进性后极部ROP，2.附加病变，或3.I型ROP伴/不伴附加病变。由于伦理原因，为避免额外抽血，对照组的外周血PBMCs样本在离开NICU前的最后一次抽血时收集。排除标准包括：1.艾滋病、梅毒、肝炎或巨细胞病毒感染等传染病；2.先天性代谢等重大全身性疾病疾病、血液病等；3.先天性白内障、青光眼、缺损等其他眼部异常；4.专业全身畸形，5.在异常凝血状态的持续时间内，或可能影响代谢状态的药物。

2、PBMCs提取：

研究对象的1.0-1.5毫升静脉血于清晨采集于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，并在2小时内送至实验室。按1:1加入等量PBS溶液，轻柔混匀，将其加入到含有等量Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，NJ，USA)到离心管中，400g、20min、加速1、减速1(no break)进行离心，吸取白膜层PBMCs，加入PBS至10-15ml，300g、10min、加速9、减速9进行离心，吸取上清，加入1ml TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)混匀，转移到1.5ml冻存管内，液氮速冻30min，-80℃保存，干冰运输，以进行circRNA生物标记物分析。

3、RNA提取：

每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。在进一步研究之前，通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。

4、RNA质量检测：

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

5、cRNA合成及标记：

利用Rnase R去除线性RNA并富集circRNA。使用随机引物法，根据试剂盒说明书扩增circRNA并逆转录(Arraystar Super RNA Labeling kit)成为带荧光标记的cRNA。标记的cRNA通过RNeasy MiniKit(Qiagen)纯化。利用NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度及活性。

6、芯片杂交和数据分析：

在标准条件下将标记好的cRNA探针和芯片(Arraystar Human CircularRNAArray 2.0)进行杂交。使用Agilent Scanner G2505C扫描芯片的荧光强度，并将实验结果数据转换保存。检测到的circRNA以倍数变化≥2.0且P<0.05为异有统计学意义。

7、结果：

在10份PBMCs样本中(5份对照组，5份患者组)，芯片检测目标包括13617个，对于荧光强度过低的circRNAs进行过滤后如图1，其中表达有显著差异的目标circRNA(FoldChange≥2且Pvalue<0.05)包括54个上调目标，143个下调目标(图2)。

实施例2qRT-PCR验证

在实施例1建立的表达谱中挑选出12个有显著差异表达的目标circRNAs,利用qRT-PCR在10例样本中再次进行验证。12种circRNAs在两组PBMCs中的差异表达量具有统计学差异，且改变趋势与芯片一致，分别为hsa_circRNA_003986,hsa_circRNA_061346,hsa_circRNA_082319,hsa_circRNA_103399,and hsa_circRNA_003140相对于对照组上调；hsa_circRNA_007366,hsa_circRNA_020959,hsa_circRNA_092369,hsa_circRNA_103554,hsa_circRNA_103555,hsa_circRNA_103556,and hsa_circRNA_103557相对于对照组下调(图3)。然后选取具有统计学差异的4个circRNA:hsa_circRNA_061346,hsa_circRNA_092369,hsa_circRNA_103554and hsa_circRNA_003140进行进一步验证(图3)。

实施例3

利用qRT-PCR的方法进一步扩大样本量验证hsa_circ_0000095在PBMCs中的表达水平，检验其诊断价值。

1、样品采集及总RNA提取同前。

2、cDNA合成及qRT-PCR：

通过SuperScript III逆转录酶试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将总RNA转录为cDNA。cDNA可置冰浴待用或-20℃保存。通过circbase数据库或者UCSC genomebrowser下载circRNA序列，利用引物设计软件Primer 5.0对目标序列及内参序列设计引物(表1)。使用2×PCRMaster Mix(Arraystar)进行qPCR检测。将384孔板置于QuantStudio5实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)上进行反应。条件为95℃，10分钟；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)，扩增反应结束后建立PCR产物的熔解曲线。

表1circRNA引物序列

数据利用双标准曲线法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示，利用Mann-whitney进行U检验。P值<0.05为有统计学差异(表2)。

3、结果：

检测了47个PBMCs样本(24个早产儿视网膜患者样本，23个对照组样本，年龄性别相匹配)中hsa_circRNA_103554的表达水平。结果显示，在两组外周血PBMCs样本中，hsa_circRNA_103554的表达量有统计学差异(图4)。

表2hsa_circRNA_103554的P值水平

circRNA	诊断值(circRNA/β-actin)	P值
			hsa_circRNA_103554	<0.0005235	<0.0001

为进一步检验hsa_circRNA_103554在外周血PBMCs中诊断早产儿视网膜病变的有效性，我们绘制了受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线(图5)。发现hsa_circRNA_103554在PBMCs样本中诊断早产儿视网膜病变的ROC曲线下面积为0.8822。当hsa_circRNA_103554在PBMCs中的诊断值设为<0.0005235时，其诊断的敏感性和特异性为91.67/73.91(％)(图5)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> hsa_circRNA_103554在早产儿视网膜病变诊断中的应用

<130> MP22016894

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgaaccaat acagagcaga cat 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaactgccac acagaagaac tc 22

<210> 3

<211> 2063

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttcttctgt gtggcagttc agaatgatgg atcaagctag atcagcattc tctaacttgt 60

ttggtggaga accattgtca tatacccggt tcagcctggc tcggcaagta gatggcgata 120

acagtcatgt ggagatgaaa cttgctgtag atgaagaaga aaatgctgac aataacacaa 180

aggccaatgt cacaaaacca aaaaggtgta gtggaagtat ctgctatggg actattgctg 240

tgatcgtctt tttcttgatt ggatttatga ttggctactt gggctattgt aaaggggtag 300

aaccaaaaac tgagtgtgag agactggcag gaaccgagtc tccagtgagg gaggagccag 360

gagaggactt ccctgcagca cgtcgcttat attgggatga cctgaagaga aagttgtcgg 420

agaaactgga cagcacagac ttcaccggca ccatcaagct gctgaatgaa aattcatatg 480

tccctcgtga ggctggatct caaaaagatg aaaatcttgc gttgtatgtt gaaaatcaat 540

ttcgtgaatt taaactcagc aaagtctggc gtgatcaaca ttttgttaag attcaggtca 600

aagacagcgc tcaaaactcg gtgatcatag ttgataagaa cggtagactt gtttacctgg 660

tggagaatcc tgggggttat gtggcgtata gtaaggctgc aacagttact ggtaaactgg 720

tccatgctaa ttttggtact aaaaaagatt ttgaggattt atacactcct gtgaatggat 780

ctatagtgat tgtcagagca gggaaaatca cctttgcaga aaaggttgca aatgctgaaa 840

gcttaaatgc aattggtgtg ttgatataca tggaccagac taaatttccc attgttaacg 900

cagaactttc attctttgga catgctcatc tggggacagg tgacccttac acacctggat 960

tcccttcctt caatcacact cagtttccac catctcggtc atcaggattg cctaatatac 1020

ctgtccagac aatctccaga gctgctgcag aaaagctgtt tgggaatatg gaaggagact 1080

gtccctctga ctggaaaaca gactctacat gtaggatggt aacctcagaa agcaagaatg 1140

tgaagctcac tgtgagcaat gtgctgaaag agataaaaat tcttaacatc tttggagtta 1200

ttaaaggctt tgtagaacca gatcactatg ttgtagttgg ggcccagaga gatgcatggg 1260

gccctggagc tgcaaaatcc ggtgtaggca cagctctcct attgaaactt gcccagatgt 1320

tctcagatat ggtcttaaaa gatgggtttc agcccagcag aagcattatc tttgccagtt 1380

ggagtgctgg agactttgga tcggttggtg ccactgaatg gctagaggga tacctttcgt 1440

ccctgcattt aaaggctttc acttatatta atctggataa agcggttctt ggtaccagca 1500

acttcaaggt ttctgccagc ccactgttgt atacgcttat tgagaaaaca atgcaaaatg 1560

tgaagcatcc ggttactggg caatttctat atcaggacag caactgggcc agcaaagttg 1620

agaaactcac tttagacaat gctgctttcc ctttccttgc atattctgga atcccagcag 1680

tttctttctg tttttgcgag gacacagatt atccttattt gggtaccacc atggacacct 1740

ataaggaact gattgagagg attcctgagt tgaacaaagt ggcacgagca gctgcagagg 1800

tcgctggtca gttcgtgatt aaactaaccc atgatgttga attgaacctg gactatgaga 1860

ggtacaacag ccaactgctt tcatttgtga gggatctgaa ccaatacaga gcagacataa 1920

aggaaatggg cctgagttta cagtggctgt attctgctcg tggagacttc ttccgtgcta 1980

cttccagact aacaacagat ttcgggaatg ctgagaaaac agacagattt gtcatgaaga 2040

aactcaatga tcgtgtcatg aga 2063

Claims (9)

1.hsa_circRNA_103554的检测试剂在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

2.早产儿视网膜病变的诊断产品，其特征在于，包括检测hsa_circRNA_103554的试剂。

3.根据权利要求2所述的诊断产品，其特征在于，所述检测hsa_circRNA_103554的试剂包括如下I)～IV)中的任意一种：

I)、hsa_circRNA_103554的检测引物；

II)、hsa_circRNA_103554的检测探针；

III)、hsa_circRNA_103554的适配体；

IV)、用于检测hsa_circRNA_103554的芯片。

4.根据权利要求3所述的诊断产品，其特征在于，所述hsa_circRNA_103554的检测引物包括如SEQ ID NO.1～2所示的引物对。

5.根据权利要求2～4任一项所述的诊断产品，其特征在于，其中还包括总RNA提取试剂、逆转录试剂和qRT-PCR检测试剂。

6.如下i)～iii)中的任意一种在构建早产儿视网膜病变模型中的应用：

i)、敲除或敲低hsa_circRNA_103554的试剂；

ii)、抑制hsa_circRNA_103554活性的试剂；

iii)、提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性的物质。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述早产儿视网膜病变模型为动物模型或细胞模型。

8.构建早产儿视网膜病变模型的方法，其特征在于，包括：敲除或敲低hsa_circRNA_103554、降低hsa_circRNA_103554活性或者提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性。

9.构建早产儿视网膜病变模型的试剂，其特征在于，如下i)～iii)中的任意一种：

i)、敲除或敲低hsa_circRNA_103554的试剂；

ii)、抑制hsa_circRNA_103554活性的试剂；

iii)、提高hsa_circRNA_103554抑制物的水平或活性的物质。

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