CN116121363A - hsa-miR-451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及hsa‑miR‑451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用。本发明通过研究证明，早产儿视网膜病变患者hsa‑miR‑451a水平显著降低，与正常对照具有显著性差异，临床上可以作为诊断早产儿视网膜病变的生物标志物用于对早产儿视网膜病变患者诊断及鉴别诊断。并且，下调hsa‑miR‑451a水平可以构建早产儿视网膜病变的模型。

Description

hsa-miR-451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用

技术领域

本申请涉及检测技术领域，特别是涉及hsa-miR-451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用。

背景技术

早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)作为新生儿疾病的一种，已成为影响早产儿生存率的重要问题。严重的ROP病例可能导致长期视力丧失，ROP也被证明是儿童失明的主要原因之一，因此，对ROP及时进行诊断和治疗具有重要意义。

现有的ROP诊断通常通过双眼间接检眼镜或广域数字视网膜成像系统(如RetCam数字视网膜照相机)进行眼底筛查来确定。但这些筛查方法效率低、误诊率高，ROP患者是否需要治疗的判断标准存在不客观的问题。而生物标志物对ROP的诊断和预后具有高敏感性和特异性，因此，寻找新的可靠而准确的临床生物标记物对ROP的诊断具有非常重要的意义。

MicroRNA(miRNA)是一类小的、较为保守的非编码RNA(non coding RNA，ncRNA)，长度为21-25个核苷酸，不编码蛋白质但可以调节翻译过程。事实上，miRNA(microRNA)、circRNA(circular RNA)和tsRNA(transfer RNA-derived small RNA)都是与基因表达调控相关的非编码RNA分子。而在检测早产儿视网膜病变方面，miRNA和circRNA都被证明可以作为潜在的生物标志物。其中miRNA通过靶向调节mRNA的翻译或降解来影响基因表达，而circRNA则可以作为miRNA的“海绵”，结合miRNA并保护miRNA免受降解。另一方面，tsRNA是从tRNA降解产生的小RNA，也可能在早产儿视网膜病变中发挥作用，但其功能和作用机制仍需要更多的研究。

相对于其他类型的非编码RNA，miRNA在技术上具有一些优势。

miRNA非常稳定，不易受到RNase降解，并且在多种生物样本(如血浆、尿液等)中都可以检测到，因此具有很高的检测效率和广泛的应用前景。此外，miRNA检测技术成熟，具有高度的准确性和可重复性，可以通过定量PCR、芯片分析、测序等多种方法进行检测。因此，miRNA可成为检测各种临床疾病的潜在生物标志物，但目前以miRNA作为早产儿视网膜病变患者生物标志物的研究还不够充分。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供hsa-miR-451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用。

申请人研究发现，早产儿视网膜病变中hsa-miR-451a的表达水平被抑制。因此，本发明提供如下技术方案：

以hsa-miR-451a为标志物，在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

检测hsa-miR-451a的试剂在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

本申请所提供的早产儿视网膜病变诊断产品为早产儿视网膜病变的早期诊断产品。一些实施例中，所述的早产儿视网膜病变诊断产品为诊断试剂、诊断工具和/或诊断所用试剂盒，本申请对此不做限定。

本申请还提供检测hsa-miR-451a的试剂，包括如下I)～II)中的任意一种：

I)、hsa-miR-451a的检测引物；

II)、用于检测hsa-miR-451a的芯片。

本申请提供的检测hsa-miR-451a的试剂可以对hsa-miR-451a进行定性检测和/或定量检测。本申请中，所述检测主要通过PCR或恒温扩增的方法进行。所述PCR法可以使用普通PCR方法，也可以使用RT-qPCR、qRT-PCR或实时定量PCR；所述恒温扩增包括LAMP、ERA、NERA、NASBA、RCA或者HAD、RPA，所述PCR或恒温扩增的靶标可以为hsa-miR-451a，也可以为hsa-miR-451a转录获得的产物，hsa-miR-451a可为全长，也可为部分片段，本申请对此不做限定。

优选地，所述hsa-miR-451a的检测引物包括如SEQ ID NO.1～2所示的引物。SEQID NO.1所示序列为：GGGGGAAACCGTTACCATTAC，SEQ ID NO:2所示序列为：GTGCGTGTCGTGGAGTCG。

本申请所述用于检测hsa-miR-451a芯片上可以担载本申请所述的引物，也可以担载其他可以用于检测hsa-miR-451a的物质，本申请对此不做限定。

本申请还提供一种早产儿视网膜病变诊断的诊断产品，包括上述任一项所述的试剂。

优选地，诊断产品中还包括总RNA提取试剂、逆转录试剂和qRT-PCR检测试剂。

本申请所述的总RNA提取试剂为PBMC的总RNA提取试剂，一些实施例中，所述总RNA的提取采用Trizol法。

本申请还提供了一种早产儿视网膜病变的诊断方法，其包括检测样本中的hsa-miR-451a表达量。

本申请实施例中，所述的检测采用qRT-PCR法，根据早产儿视网膜病变表达量判断样本是否来自于早产儿视网膜病变患者。所述样本为外周血PBMC(外周血单个核细胞)。

本申请提供的方法为针对需要治疗的早产儿视网膜病变患者的辅助诊断检测方法，该方法中所述判断样本是否来自于早产儿视网膜病变患者的方法包括：取检测对象外周血PBMC样本，以U6作为内参进行qRT-PCR检测，以hsa-miR-451a/U6的比值为0.459作为cut off值，该比值低于cut off值，则该检测对象为需要治疗的早产儿视网膜病变的高风险人群，建议进一步结合眼底检查等手段进行确诊。早产儿视网膜病变患者体内hsa-miR-451a表达量显著低于正常对照，因此，敲低、敲除hsa-miR-451a的表达，或抑制hsa-miR-451a的活性，可以用于早产儿视网膜病变模型的构建。

本申请还提供以hsa-miR-451a为靶点，在构建早产儿视网膜病变模型中的应用。进一步地，构建早产儿视网膜病变模型的试剂，其包括如下i)～iii)中的任意一种：

i)、敲低或敲除hsa-miR-451a的试剂；

ii)、抑制hsa-miR-451a活性的试剂；

iii)、提高hsa-miR-451a抑制物的水平或活性的物质。

本申请还提供构建早产儿视网膜病变模型的方法，以上述试剂处理，以降低hsa-miR-451a的水平或活性。

优选地，所述模型为动物模型或细胞模型。所述敲低或敲除hsa-miR-451a的试剂可以为对细胞进行转染或转化的试剂，本申请对此不做限定；本申请中所述抑制hsa-miR-451a活性的试剂能够使hsa-miR-451a的活性降低。而所述提高hsa-miR-451a抑制物的水平或活性的物质，可以是小分子化合物，也可通过基因工程的手段对hsa-miR-451a抑制物进行过表达或活化的物质。本申请对此亦不做限定。

本申请通过研究证明，早产儿视网膜病变患者hsa-miR-451a水平显著下降，与正常对照具有显著性差异，临床上可以作为诊断早产儿视网膜病变的生物标志物用于对早产儿视网膜病变患者诊断及鉴别诊断。并且，下调hsa-miR-451a水平可以构建早产儿视网膜病变的模型。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示对照组(Control)与早产儿视网膜病变组(Treatment)PBMC样本小RNA测序产生的主成分分析PCA图；两组内的样本存在聚类趋势，两组间的样本可以完全区分，组内差异小，组间差异大，两组具有可比性。

图2示早产儿视网膜病变患者PBMC中差异表达miRNA火山图；其中，图中以绿色直线划分相应的log₂(fold change)和-log₁₀(P-value)，fold change上调或下调≥1.5倍，且P<0.05；红色代表发现显著差异上调miRNA100个，绿色代表发现显著差异下调miRNA 105个。

图3示早产儿视网膜病变患者PBMC中差异表达miRNA的分层聚类分析产生的热图；色标显示不同样本中miRNA的相对表达水平，红色代表上调，蓝色代表下调。

图4示PBMC目标miRNA经qRT-PCR扩增后检测结果；图中数据以means±SD展示(Control:n1＝5，ROP:n2＝5),*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；

图5示hsa-miR-451a使用扩大验证样本集(Control:n1＝26，ROP:n2＝31)经qRT-PCR扩增后检测结果；图中数据以means±SD展示,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图6示hsa-miR-451a的ROC曲线；AUC为0.9756，P<0.0001。

具体实施方式

本发明提供了hsa-miR-451a作为早产儿视网膜病变诊断标志物的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

MicroRNA(miRNA)是一类小的、较为保守的非编码RNA(non coding RNA，ncRNA)，也是最丰富、最稳定的小RNA，在基因调控中发挥重要作用。发明提供了一种用于早产儿视网膜病变早期诊断的miRNA，对早产儿视网膜病变的发病检测有重要意义。用于早产儿视网膜病变早期诊断的分子标记物为hsa-miR-451a。

本发明中，hsa-miR-451a，即对应MIMAT0001631，前者为mature_ID,来源于miRBase22数据库，后者为Mature_Accession，来源于miRBase数据库。可以表达hsa-miR-451a的DNA片段可以通过如下方式获取：从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)或miRBase(https://www.mirbase.org/)数据库中寻找hsa-miR-451a在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定hsa-miR-451a初始miRNA的位置。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1早产儿视网膜病变miRNA表达谱的建立

1、样本收集：

该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批，符合赫尔辛基宣言的宗旨。从参与者的监护人那里获得了知情同意，并解释了研究的性质和可能的后果。该研究共有66名早产儿入组。其中，36例诊断为ROP的婴儿需要进一步治疗(筛查5例，验证31例)，如玻璃体内注射抗VEGF药物和激光光凝，试验组纳入遵循国际早产儿视网膜病变分类(ICROP)标准(ICCROP，2021)，即当婴儿患有：1.急进性后极部ROP，2.附加病变，或3.I型ROP伴/不伴附加病变。由于伦理原因，为避免额外抽血，对照组的外周血PBMC样本在离开NICU前的最后一次抽血时收集。排除标准包括：1.艾滋病、梅毒、肝炎或巨细胞病毒感染等传染病；2.重大系统性疾病如先天性代谢疾病、血液病等；3.先天性白内障、青光眼、缺损等其他眼部异常；4.重大系统性畸形，5.处于异常凝血状态，或正在使用可能影响代谢和免疫状态的药物。

2、PBMC提取：

研究对象的1.0-1.5毫升静脉血于清晨采集于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，并在2小时内送至实验室。按1:1加入等量PBS溶液，轻柔混匀，将其加入到含有等量Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，NJ，USA)到离心管中，400g、20min、加速1、减速0(no break)进行离心，吸取白膜层PBMC，加入PBS至10-15ml，300g、10min、加速9、减速9进行离心，吸除上清后，加入1ml TRIzol试剂(Invitrogen,Carlsbad,USA)混匀，转移到1.5ml冻存管内，液氮速冻30min，-80℃保存，干冰运输，以进行miRNA生物标记物分析。

3、RNA提取：

每1ml的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约是匀浆时加入的TRIzol试剂的60％。将水相转移到新离心管中。

水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mlTRIzol试剂的此时加0.5ml的异丙醇，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

移去上清液，每1ml TRIzol试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。在进一步研究之前，通过变性琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。

4、RNA质量检测：

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。

上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

5、RNA前处理与cDNA合成：

利用rtStar^TMtRF&tiRNA Pretreatment Kit(Cat#AS-FS-005,Arraystar)，按照顺序分别进行3′末端去乙酰化、去除3′-cP与添加5′-P、去甲基化反应、连接3′接头、进行反转录引物(Reverse Transcription Primer)杂交、连接5′接头完成RNA前处理，以去除一些会干扰建立small RNA-seq文库的RNA修饰。随后使用rtStar^TMFirst-Strand cDNA SynthesisKit(3′and 5′adaptor)(Cat#AS-FS-003,Arraystar)一步法完成cDNA合成和扩增，扩增片段。

6、构建测序文库和样本测序：

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳提取～134-160bp PCR扩增片段并进行纯化，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)进行文库定量。在文库变性和稀释后，使用Illumina NextSeq 500system with NextSeq 500/550V2 kit(Illumina,San Diego,CA)进行测序。测序得到的碱基序列，通过miRDeep2与miRNA参考序列进行比对，miRNA的表达谱分析可以根据读取映射的计数来计算。

7、miRNA数据分析：

使用主成分分析发现对照组和患者组可以明显区分(图1)。使用R语言edgeR包进行miRNA差异表达分析，检测到的miRNA以倍数变化≥1.5且P<0.05为有统计学意义，并使用散点图、火山图、聚类热图等进行数据可视化。

8、结果：

在10份PBMC样本中(5份对照组，5份患者组)，芯片共检测到1846个miRNA，其中表达有显著差异的目标miRNA(Fold Change≥1.5且P值<0.05)包括100个上调目标，105个下调目标(图2、图3)。

实施例2qRT-PCR验证

在实施例1建立的miRNA表达谱中，我们选取了11个miRNA，其中9个属于有显著差异表达的目标miRNA，利用qRT-PCR在10例样本(5份对照组，5份患者组)中再次进行验证。9种miRNA在两组PBMC中的差异表达量具有统计学差异，且改变趋势与芯片一致，分别为hsa-miR-27a-3p，hsa-miR-574-3p，hsa-miR-378g，hsa-miR-24-3p和hsa-miR-24-2-5p相对于对照组上调；hsa-miR-144-5p，hsa-miR-486-5p，hsa-miR-451a和hsa-miR-144-3p相对于对照组下调(图4)，对以上显著差异表达miRNA进行进一步验证。

实施例3

利用qRT-PCR的方法进一步扩大样本量验证hsa-miR-451a在PBMC中的表达水平，检验其诊断价值。

1、样品采集及总RNA提取同前。

2、cDNA合成及qRT-PCR：使用Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems)进行cDNA合成。利用引物设计软件Primer 5对目标序列设计引物(表1SEQ ID NO.1～2)反应结束后，将其放在冰上待用或-20℃保存。将384孔板置于ViiA 7Real-time PCR System(Applied Biosystems)完成Realtime PCR反应，条件为95℃，10分钟；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)，扩增反应结束后按照95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒建立PCR产物的熔解曲线。各样品的目的miRNA和内参(U6)分别进行Realtime PCR反应。数据采用2-△△CT法进行分析

表1：hsa-miR-451a引物序列

数据利用双标准曲线法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示，利用Mann-whitney进行U检验。P值<0.05为有统计学差异(表2)。

表2：hsa-miR-451a的P值水平

基因名	诊断值(miRNA/U6)	P值
			hsa-miR-451a	<0.459	<0.0001

3、结果：

检测了56个PBMC样本(26个对照组样本，30个早产儿视网膜患者样本，年龄性别相匹配)中hsa-miR-451a的表达水平。结果显示，在两组外周血PBMC样本中，hsa-miR-451a的表达量有统计学差异(图5)。

为进一步检验hsa-miR-451a在外周血PBMC中诊断早产儿视网膜病变的有效性，我们绘制了受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线(图6)。发现hsa-miR-451a在PBMC样本中诊断早产儿视网膜病变的ROC曲线下面积为0.9756。当hsa-miR-451a在PBMC中的诊断值设为<0.459时，其诊断的敏感性和特异性为86.67/100.00(％)(表3)。

表3：hsa-miR-451a的临床诊断价值

基因名	敏感性(％)	特异性(％)	AUC	P值
					hsa-miR-451a	86.67	100.00	0.9756	<0.0001

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.以hsa-miR-451a为标志物，在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

2.检测hsa-miR-451a的试剂在制备早产儿视网膜病变诊断产品中的应用。

3.检测hsa-miR-451a的试剂，其特征在于，包括如下I)～II)中的任意一种：

I)、hsa-miR-451a的检测引物；

II)、用于检测hsa-miR-451a的芯片。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述hsa-miR-451a的检测引物包括如SEQID NO.1～2所示的引物对。

5.一种早产儿视网膜病变诊断的诊断产品，其特征在于，包括权利要求3或4中任一项所述的试剂。

6.根据权利要求5所述的诊断产品，其特征在于，其中还包括总RNA提取试剂、逆转录试剂和qRT-PCR检测试剂。

7.以hsa-miR-451a为靶点，在构建早产儿视网膜病变模型中的应用。

8.构建早产儿视网膜病变模型的试剂，其包括如下i)～iii)中的任意一种：

i)、敲低或敲除hsa-miR-451a的试剂；

ii)、抑制hsa-miR-451a活性的试剂；

iii)、提高hsa-miR-451a抑制物的水平或活性的物质。

9.构建早产儿视网膜病变模型的方法，其特征在于，以权利要求8所述的试剂处理，以降低hsa-miR-451a的水平或活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述模型为动物模型或细胞模型。

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