CN115103918A - 自闭症谱系障碍的检测和治疗 - Google Patents

自闭症谱系障碍的检测和治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN115103918A
CN115103918A CN202080096038.7A CN202080096038A CN115103918A CN 115103918 A CN115103918 A CN 115103918A CN 202080096038 A CN202080096038 A CN 202080096038A CN 115103918 A CN115103918 A CN 115103918A
Authority
CN
China
Prior art keywords
asd
sod2
rora
expression level
err
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080096038.7A
Other languages
English (en)
Inventor
保罗·姚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Submarine Cable Consulting And Trading Co ltd
Bao LuoYao
Original Assignee
Submarine Cable Consulting And Trading Co ltd
Bao LuoYao
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Submarine Cable Consulting And Trading Co ltd, Bao LuoYao filed Critical Submarine Cable Consulting And Trading Co ltd
Publication of CN115103918A publication Critical patent/CN115103918A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明大体上涉及用于诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）的组合物和方法。所述方法是基于以下发现：与未患有ASD的个体相比，某些基因（例如RORA、SOD2、ERRα和GPER）在ASD患者的CD34+细胞或MNC中具有不同的表达水平。一旦ASD患者被识别或预测，还提供用于预防或治疗ASD的组合物和方法。

Description

自闭症谱系障碍的检测和治疗
背景技术
自闭症谱系障碍（ASD）是一组发育障碍，其包括全类型自闭症候群（fullsyndrome autism）、阿斯伯格综合症（Asperger’s syndrome）和其他广泛性发育障碍。现在，每59名儿童中就有1名以上被诊断为患有ASD，并且ASD的患病率一直在持续上升。令人难以理解地ASD以至少4：1的比例偏向男性。
早在18个月或在某些情况下甚至更小的时候ASD就可以被检测到。可靠的诊断通常在两岁时就可以做出。ASD症状的多样化表现给临床医生带来了诊断上的挑战。患有ASD的个体可能在发育的不同时期（例如幼儿、儿童或青少年）出现，而且症状表现可能在发育过程中有所不同。此外，临床医生必须区分广泛性发育障碍，并且可能也要考虑类似的情况，包括与广泛性发育障碍无关的智力障碍、特殊语言障碍、ADHD、焦虑和精神障碍。
考虑到诊断ASD的特殊挑战，美国神经病学学会、美国儿童和青少年精神病学学会以及由各专业协会代表组成的共识小组已经公布了用于评估ASD的具体实践参数。这些协会列出的实践参数包括由全科医生对儿童进行初步筛查，以及由有经验的临床医生对于未能通过初步筛查的儿童进行综合诊断评估。此外，有人建议，对疑似ASD儿童的评估应在发育框架内进行，包括来自不同背景（例如家庭和学校）的多个信息提供者（例如父母和教师），并聘请多学科的专业团队（例如临床心理学家、神经心理学家和精神病学家）。
已经报道了许多可能的解释和潜在的致病因素，例如遗传的、表观遗传的和环境的因素，但ASD的详细机制仍不清楚。风险因素包括具有年长父母、自闭症家族史和某些遗传条件。诊断是基于症状。DSM-5重新定义了自闭症谱系障碍以涵盖先前对自闭症、阿斯伯格综合症、未特定的广泛性发育障碍（PDD-NOS）和儿童瓦解性精神障碍（childhooddisintegrative disorder）的诊断。
治疗工作通常是个性化的，并且可以包括行为疗法和应对技能的教导。可以使用药物来尝试帮助改善症状。然而，支持使用药物的证据不是很充分。
发明内容
本发明发现，与不患有ASD的个体相比，患有ASD的个体的外周血或脐带血分离的CD34+细胞或单核细胞（MNC）中的某些基因持续上调或下调。实施例包括SOD2（超氧化物歧化酶2）、RORA（视黄酸相关孤儿受体α）、OXT（催产素/后叶激素运载蛋白I前体肽）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和ERRα（雌激素相关受体α），这些基因在ASD样本中表达下降。
因此，本公开提供了基于患者中的一个或多个此类基因的表达测量预测或诊断ASD的方法和组合物。进一步地，可以预期恢复这些基因中一些基因的正常表达能够有助于治疗ASD或改善ASD的一些症状，特别是在受影响的神经细胞中进行恢复时。
一个实施方案提供了用于诊断ASD（自闭症谱系障碍）的试剂盒或包装，其包含用于测量从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中SOD2（超氧化物歧化酶2）和RORA（视黄酸相关孤儿受体α）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。
在一些实施方案中，所述试剂盒或包装进一步包含用于测量ERRα（雌激素相关受体α）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。在一些实施方案中，试剂盒或包装进一步包含用于测量GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。
在另一个实施方案中，提供了一种用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法，其包含测量从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中RORA（视黄酸相关孤儿受体α）的表达水平。
在一些实施方案中，该方法进一步包含将RORA的表达水平与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的RORA的参考表达水平进行比较，其中RORA的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，该方法进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中SOD2（超氧化物歧化酶2）的表达水平，其中RORA和SOD2的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，该方法进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中的ERRα（雌激素相关受体α）的表达水平，其中RORA、SOD2和ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，该方法进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中的GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）的表达水平，其中RORA、SOD2和GPER的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，该方法进一步包含治疗或预防被识别为可能患有ASD或可能发展为ASD的人类患者中的ASD。示例性的治疗或预防方法包括行为分解训练（DTT）、关键反应训练（PRT）、早期密集行为干预（EIBI）、言语行为干预（VBI）、基于发展个体差异关系的方法（Developmental, Individual Differences, Relationship-Based Approach，DIR）、自闭症及相关沟通障碍儿童的治疗和教育（TEACCH）、图片交换沟通系统（PECS）、感觉统合疗法（Sensory Integration Therapy）、利培酮（Risperdal）、选择性血清再吸收抑制剂（SSRI）、抗焦虑药物和兴奋剂。
在另一个实施方案中，本公开提供了在有需要的人类对象中治疗ASD的方法，其包含向对象施用增加患者中RORA、SOD2、ERRα或GPER的生物活性的药剂。
在一些实施方案中，所述药剂是编码RORA、SOD2、ERRα或GPER的重组多核苷酸或RORA、SOD2、ERRα或GPER的蛋白质。在一些实施方案中，与相应的未患有ASD的人类对象相比，人类对象的RORA、SOD2、ERRα或GPER的表达降低。
还提供了一种用于与计算机系统结合使用的计算机程序产品，该计算机程序产品包含计算机可读存储介质和嵌入其中的计算机程序机制，该计算机机制包含用于执行用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法的可执行指令，其中该指令包含（i）获得从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中选自以下的一个或多个基因的表达水平的测量结果：RORA（视黄酸相关孤儿受体α）、SOD2（超氧化物歧化酶2）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和ERRα（雌激素相关受体α）；以及（ii）将表达水平的测量结果与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的参考表达水平进行比较，其中RORA、SOD2、GPER或ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
附图说明
图1. ASD患者中ERβ和ERβ相关基因的表达降低。从对照组（CTL）或ASD儿童（2-6岁）抽取3 ml外周血，分离单核细胞（MNC）并纯化mRNA，通过实时PCR评估mRNA表达。n=61（对于CTL）和64（对于ASD）。*，P<0.05，相对于CTL组；¶，P<0.01，相对于CTL组。
图2. 基于来自CTL和ASD患者的SOD2的表达的ROC曲线。来自CTL（n=61）和ASD（n=64）患者的SOD2 mRNA表达水平被用来绘制ROC（接受者操作特性）曲线。（a）病例处理汇总，阳性（positive）表示CTL病例，阴性（negative）表示ASD病例。（b）ROC曲线。（c）曲线下的面积。
图3. 基于SOD2 mRNA表达建立用于ASD患者的诊断的临界（Cut/Off）值的。（a）曲线的坐标，a部分；（b）曲线的坐标，b部分；（c）曲线的坐标，c部分。
图4. ASD患者中来自外周血的MNC中基因表达被抑制。收集来自正常发育（TD）和ASD组儿童的外周血，分离MNC用于通过实时PCR对SOD2、ERRα、RORA和GPER等基因进行mRNA分析，ASD的n=132且TD的n=130。*, P<0.05，相对于CTL组。数据表示为平均值±SEM。
图5. 来自对正常发育（TD）和自闭症（ASD）患者两者计算的ASD指数值（IndexValue）的ROC曲线。
图6. 基于每个样本的计算的ASD指数值建立用于ASD患者的诊断的临界值。ASD临界值被设置为0.3730，敏感度（Sensitivity）为1.000且特异性（Specificity）为0.854。（a）曲线的坐标，a部分，带有临界值的标志。（b）曲线的坐标，b部分。（c）曲线的坐标，c部分。（d）曲线的坐标，d部分。（e）曲线的坐标，e部分。
具体实施方式
定义
以下描述阐述了本技术的示例性实施方案。然而，应该认识到，这样的描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施方案的描述而提供。
定义
在本说明书中使用的以下词语、短语和符号通常旨在具有以下阐述的含义，除非在使用它们的上下文中另有说明。
如本文所使用的，某些术语可以具有以下定义的含义。除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”或“一种”和“该/所述”包括单数指代和复数指代。例如，术语“细胞”包括单个细胞和多个细胞，包括其混合物。
所有数字指定（包括范围），例如pH值、温度、时间、浓度和分子量，都是近似值，其以0.1的增量（（+）或（-））变化。应该理解的是，虽然并非总是明确地说明，但是所有的数字值前面都有术语“约”。术语“约”除了包括精确值“X”之外，还包括“X”的较小增量，例如“X +0.1”或“X - 0.1”。还应该理解的是，虽然并非总是明确地说明，但是本文所述的试剂仅是示例性的，并且这些试剂的等效物在本领域是已知的。
本公开进一步提供了诊断、预测和治疗方法，其至少部分地基于本文识别的感兴趣的基因的表达水平的确定。
例如，使用本文所述的诊断测定获得的信息可用于确定对象是否可能患有疾病（例如ASD）或可能发展该疾病，或者是否适合治疗。根据诊断/预测信息，医生可以推荐治疗方案。
应该理解的是，使用本文所述的诊断测定获得的信息可以单独使用或与其他信息组合使用，例如，但不限于行为评估、其他基因的基因型或表达水平、临床化学参数、组织病理学参数或对象的年龄、性别和体重。
诊断预测方法和计算机程序产品
自闭症谱系障碍（ASD）的诊断具有挑战性，主要依赖于行为评估，而行为评估具有破坏性且不准确。同时，由于分子机制不清楚，在分子或临床化学水平上没有可靠的诊断方法。本发明人惊喜地发现，与健康对照个体相比，从ASD患者的血液分离的CD34+或MNC细胞中的某些基因持续性下调。因此，这些基因的表达水平可以被用于诊断或预测ASD。还可以预期恢复这些基因中一个或多个的表达能够有助于治疗ASD或其症状中的一种或多种。
根据本公开的一个实施方案，提供了一种用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法。在一些实施方案中，该方法需要测量选自以下基因中的一个或多个的表达水平：SOD2（超氧化物歧化酶2）、RORA（视黄酸相关孤儿受体α）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和/或ERRα（雌激素相关受体α）。优选地，所述表达水平在MNC细胞或CD34+细胞中被检测。
表A. ASD患者中测试的基因的列表
基因 全称 登录号 #
SOD2 超氧化物歧化酶2 NM_000636
ERβ 雌激素受体2 NM_001040275
OXT 催产素/后叶激素运载蛋白I 前体肽 NM_000915
GPER G蛋白偶联雌激素受体1 NM_001505
ERα 雌激素受体1 NM_000125
ERRα 雌激素相关受体α NM_004451
AR 雄激素受体 NM_000044
VDR 维生素D受体 NM_000376
PGR 孕激素受体 NM_001202474
RORA 视黄酸相关孤儿受体α NM_134261
OXTR 催产素受体 NM_000916
在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、RORA、GPER和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、RORA和GPER的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、RORA和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、GPER和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和RORA的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和GPER的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对至少SOD2进行测量。在一些实施方案中，对至少RORA进行测量。
在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、OXT、GPER和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、OXT和GPER的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、OXT和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2、GPER和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和OXT的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和GPER的基因进行测量。在一些实施方案中，对一个或多个选自SOD2和ERRα的基因进行测量。在一些实施方案中，对至少SOD2进行测量。
一旦这些基因中的一个或多个的表达水平被检测到，就可以将其与合适的参考水平进行比较以确定其是否升高或降低。本领域技术人员能够很容易地理解，表达水平或比例的升高或降低是相对术语，但可以容易地确定。
在一个方面，“内部参照”可以被用来使测量标准化以较正样本收集变化。一种这样的内部参照是“管家”基因，其指的是任何组成性或全局性表达的基因。这种基因的实施例包括但不限于β-肌动蛋白、转移受体基因、GAPDH基因或其等效物。在本公开的一个方面，内部参照基因是β-肌动蛋白。在本公开的一个方面，内部参照基因是GAPDH。
然后可以将标准化的表达水平或比例与合适的对照样本进行比较。在一个方面，对照样本是收集自未患病对象的样本或来自同一对象的未患病样本。在某些方面，合适的对照样本不一定来自特定的个体，也可以是具有一组对照样本的平均值的“虚拟对照”样本。在一些实施方案中，对照是基于测试对象的某些特征来选择的。例如，合适的对照样本将来自具有相同性别、相似年龄或体重的个体，但不限于此。
在一些实施方案中，术语“过表达”或“低表达”是指与对照样本中的基因表达水平相比，测试样本中的基因表达升高或降低，或者是差异表达。在一个方面，差异表达比对照样本中检测的表达水平高或低至少约5%，或至少约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少约2倍、3倍或5倍。替代地，该基因被称为“过度表达”或“低表达”。替代地，该基因也可以被称为“上调”或“下调”。
在另一种情况下，所述升高或降低可以与区分两种不同状态的“预定值”进行比较。如本文所使用的，选择用于基因的“预定值”使得该基因的表达水平高于（或低于，视情况而定）所述预定值的患者可能患有（或可能发展为）ASD。本领域的技术人员可以通过比较ASD患者和非ASD患者中基因的表达水平来确定基因的预定值。在一个方面，预定值是将患者最好地分成患有ASD的组和未患有ASD的组的基因表达值。这样的基因表达值可以用本领域已知的方法在数学上或统计学上确定。
在一些实施方案中，SOD2、RORA、GPER或ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，SOD2的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，RORA的表达水平降低将人类患者识别为患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，GPER的表达水平降低将人类患者识别为患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，ERRα的表达水平降低将人类识别为患者可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，SOD2、OXT、GPER或ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，SOD2的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，OXT的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，GPER的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，建立用于评估差异表达水平的阈值。例如，在一些实施方案中，SOD2的表达水平降低超过1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，SOD2的表达水平降低超过95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，GPER的表达水平降低超过1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展成ASD。在一些实施方案中，GPER的表达水平降低超过95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，RORA的表达水平降低超过1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，RORA的表达水平降低超过95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，OXT的表达水平降低超过1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展成ASD。在一些实施方案中，OXT的表达水平降低超过95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，ERRα的表达水平降低超过1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10倍，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，ERRα的表达水平降低超过95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%，将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，使用两个或更多个基因的表达水平的变化的组合。在一些实施方案中，使用三个或更多个基因的表达水平的变化的组合。在一些实施方案中，使用四个或更多个基因的表达水平的变化的组合。
在一些实施方案中，SOD2和ERRα两者的表达水平的降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，组合是SOD2和RORA、或者SOD2和GPER、或者ERRα和RORA、ERRα和GPER、或者RORA和GPER的表达的降低。
在一些实施方案中，组合是SOD2和ERRα或RORA、SOD2和ERRα或GPER、SOD2和RORA或GPER、SOD2、以及ERRα、RORA或GPER中的一个或两个的降低。
在一些实施方案中，SOD2和ERRα两者的表达水平的降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。在一些实施方案中，组合是SOD2和OXT、或者SOD2和GPER、或者ERRα和OXT、ERRα和GPER、或者OXT和GPER的表达的降低。
在一些实施方案中，组合是SOD2和ERRα或OXT、SOD2和ERRα或GPER、SOD2和OXT或GPER、SOD2和ERRα、OXT或GPER中的一个或两个的降低。
本文中提及的基因表达可以在蛋白质水平或mRNA水平上被测量，但不限于此。测量细胞中基因的蛋白质和mRNA水平的方法是本领域众所周知的。仅出于说明的目的，此类方法可以包括使用例如原位杂交、PCR、实时PCR或微阵列来确定从基因转录的mRNA的量。确定蛋白质表达水平的方法也是本领域已知的，例如，但不限于蛋白质印迹法、免疫组织化学法、ELISA或蛋白质微阵列。
在一些实施方案中，在从血液样本或富含CD34+细胞的样本中分离的CD34+细胞中测量基因表达。因此，该方法进一步需要在基因表达测量之前从患者分离MNC或CD34+细胞。MNC或CD34+细胞可以从外周血或脐带血分离。
分离MNC和CD34+细胞的方法在所附的实验实施例中举例说明。在一些实施方案中，样本是新鲜制备的。例如，在从人类患者分离细胞后8、7、6、5、4、3或2小时内开始测量。
优选地用于基因表达测量的样本富含MNC细胞。在一些实施方案中，样本包括包含至少50%，或者优选的至少75%、85%、90%或95%的CD34+细胞的细胞群。在一些实施方案中，样本包括包含至少50%，或者优选的至少75%、85%、90%或95%的MNC细胞的细胞群。
在另一个实施方案中，本发明是一种用于与计算机系统结合使用的计算机程序产品，该计算机程序产品包含计算机可读存储介质和嵌入其中的计算机程序机制，该计算机机制包含用于执行用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法的可执行指令，其中该指令包含：（i）获得从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中选自以下的一个或多个基因的表达水平的测量的测量结果：SOD2（超氧化物歧化酶2）、RORA（视黄酸相关孤儿受体α）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和ERRα（雌激素相关受体α）；以及（ii）将表达水平的测量结果与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的参考表达水平进行比较，其中SOD2、RORA、GPER或ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在另一个实施方案中，本发明是一种用于与计算机系统结合使用的计算机程序产品，该计算机程序产品包含计算机可读存储介质和嵌入其中的计算机程序机制，该计算机机制包含用于执行用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法的可执行指令，其中该指令包含：（i）获得从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中选自以下的一个或多个基因的表达水平的测量的测量结果：SOD2（超氧化物歧化酶2）、OXT（催产素/后叶激素运载蛋白I前体肽）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和ERRα（雌激素相关受体α）；以及（ii）将表达水平的测量结果与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的参考表达水平进行比较，其中SOD2、OXT、GPER或ERRα的表达水平降低将人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，其中表达降低超过50%，将人类患者识别为患有ASD或可能发展为ASD。
在一些实施方案中，其中参考人类对象是真实的参考人类对象，或者是用来自一个或多个未患有ASD的人类对象的集合数据（pool data）创建的虚拟的参考人类对象。
治疗方法和组合物
还提供了预防和治疗ASD的组合物和方法，一旦患者被识别为可能患有ASD或可能发展为ASD，就可以使用这些组合物和方法。
“治疗”是用于获得有益的或预期的结果（包括临床结果）的方法。有益的或预期的临床结果可以包括以下一项或多项：a）抑制疾病或病症（例如，减少由疾病或病症引起的一种或多种症状，和/或减轻疾病或病症的程度）；b）减慢或阻止与疾病或病症相关的一种或多种临床症状的发展（例如，稳定疾病或病症，防止或延迟疾病或病症的恶化或进展，和/或预防或延迟疾病或病症的扩散）；和/或c）缓解疾病，即导致临床症状的消退。
“预防”或“防止”是指导致疾病或病症的临床症状不发展的任何疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，可以将组合物施用给处于有风险患有该疾病或病症或具有家族史的对象（包括人类）。
“对象”是指已经或将会成为治疗、观察或实验对象的动物，例如哺乳动物（包括人类）。本文所述的方法可用于人类治疗和/或兽医应用。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在一个实施方案中，对象是人类。
本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、同分异构体、立体异构体、立体异构体的混合物、前药或氘代类似物的术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用于对象时，足以使其发挥治疗作用以提供治疗益处（例如改善症状或延缓疾病进展）的量。例如，治疗有效量可以是足以减轻ASD疾病或病症的症状的量。治疗有效量可以根据对象、所治疗的疾病或病症、对象的体重和年龄、疾病或病症的严重程度以及施用方式而变化，其可以由本领域的一名或普通技术人员容易地确定。
有一些已知的治疗ASD的方法，包括行为治疗、药物治疗和营养治疗。例如，应用行为分析（ABA）通常被用于学校和诊所以帮助你的孩子学习积极行为并减少消极行为。这种方法可以被用于改善技能的广泛范围，并且对于不同的情况有不同的类型，包括使用简单的课程和正向强化的行为分解训练（DTT）。关键反应训练（PRT）有助于培养学习和交流的动机。早期密集行为干预（EIBI）最适合5岁以下的儿童。言语行为干预（VBI）侧重于语言技能。
基于发展个体差异关系的方法（DIR）是以地板时光（Floortime）更为人所知的治疗方法。DIR通过帮助他学习有关沟通和情感的技能来支持情感和智力的成长。
自闭症及相关沟通障碍儿童的治疗和教育（TEACCH）使用视觉提示（例如图片卡片）来帮助您的孩子学习日常技能（例如穿衣）。信息被分解成小步骤以使他可以更容易地学习。
图片交换沟通系统（PECS）是基于视觉的治疗方法，但它使用符号而不是图片卡片。孩子学习通过特殊的符号提问和交流。
作业疗法（Occupational Therapy）也可以帮助孩子学习生活技能，例如自己吃饭和穿衣、洗澡以及了解如何与其他人相处。他所学习的技能旨在帮助他尽可能独立地生活。感觉统合疗法可以帮助孩子学习处理这种感觉信息。
自闭症谱系障碍无法治愈，并且目前也没有治疗它的药物。但有些药物可以帮助缓解相关症状，例如抑郁、癫痫发作、失眠和注意力不集中。利培酮（Risperdal）是唯一被FDA批准用于自闭症谱系障碍儿童的药物。它可以被用作5至16岁的儿童的处方药以帮助解决易怒。一些医生会在某些情况下开出其他药物，包括选择性血清再吸收抑制剂（SSRI）、抗焦虑药物或兴奋剂，但它们没有被FDA批准用于自闭症谱系障碍。
在本公开中预期了新的治疗方法。在一些实施方案中，治疗需要向患者施用增加患者中SOD2、OXT、GPER或ERRα的生物活性的药剂。该增加可以发生在患者的任何细胞（例如血细胞）中，但优选地，所述增加或降低发生在神经元中。
制备能够增加或降低基因的生物活性的药剂的方法是已知的。降低基因生物活性的药剂可以是antagomir、抗体、siRNA、核酶，但不限于此。Antagomir是一类化学工程的寡核苷酸，可用于沉默内源性微小核糖核酸（microRNA）。
用于增加细胞中蛋白质或多肽或肽（如SOD2、OXT、GPER或ERRα）的水平的方法是本领域已知的。在一个方面，基因水平通过增加编码基因（如上文提供的）的多核苷酸的量增加，其中该多核苷酸被表达以使得新基因产生。在另一个方面，增加基因水平是通过增加编码基因的多核苷酸的转录，或者基因的翻译，或者基因的翻译后修饰、激活或适当折叠而增加的。在另一个方面，增加基因水平是通过增加蛋白质与适当的辅助因子、受体、激活剂、配体或参与蛋白质生物功能的任何分子的结合而增加的。在一些实施方案中，增加基因与适当分子的结合是增加分子的量。在实施方案的一个方面，分子是基因蛋白。在实施方案的另一个方面，分子是小分子。在实施方案的另一个方面，分子是多核苷酸。
增加细胞中多核苷酸的量的方法是本领域已知的，并且可以被修改用于增加编码基因的多核苷酸的量。在一个方面，多核苷酸可以被引入细胞并通过基因递送载体表达，该基因递送载体可以包括合适的表达载体。DNA甲基化或乙酰化的改变也可被用于调节靶基因的表达。在一些实施方案中，本公开的基因的表达可以通过抑制其启动子或调节区的甲基化来增加。
合适的表达载体是本领域众所周知的，并且包括能够表达与调控元件（例如能够调控该DNA表达的启动子区和/或增强子）可操作地连接的多核苷酸的载体。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，其在引入适当的宿主细胞后导致插入的DNA表达。适当的表达载体包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的那些，以及保持游离的那些或整合到宿主细胞基因组中的那些。
如本文所使用的，术语“载体”是指非染色体核酸，其包含完整的复制子使得该载体当置于细胞内（例如通过转化过程）时可被复制。载体可以是病毒的或非病毒的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、乳头瘤病毒或其他经修饰的自然存在的病毒。用于传递核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；与单独的阳离子脂质复合的或与阳离子聚合物组合的DNA；阴离子和阳离子脂质体；DNA-蛋白质复合物和颗粒，其包含与阳离子聚合物（例如异质聚赖氨酸、确定长度的寡肽和聚乙烯亚胺）缩合的DNA，在某些情况下被包含在脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物。
非病毒载体可以包括质粒，所述质粒包含能够在体外、体内或离体被递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可以包括感兴趣的序列，并且可以被可操作地连接至一个或多个调控元件，并且可以控制感兴趣的核酸序列的转录。如本文所使用的，载体不需要能够在最终的靶细胞或对象中复制。术语载体可以包括表达载体和克隆载体。
基因递送载体还包括DNA/脂质体复合物、胶束和靶向病毒蛋白-DNA复合物。还包含靶向抗体或其片段的脂质体可被用于本发明的方法。为了加强向细胞的递送，本发明的核酸或蛋白质可以被连接至结合细胞表面抗原（例如，在干细胞或心肌细胞上发现的细胞表面标志物）的抗体或其结合片段。除了向细胞或细胞群递送多核苷酸外，还可以通过非限制性的蛋白质转染技术将本文所述的蛋白质直接引入细胞或细胞群，替代地，能够增强本发明蛋白质的表达和/或促进活性的培养条件是其他非限制性技术。
药剂可以通过任何合适的制剂施用。因此，本文进一步提供了包含必要疗法的制剂。该制剂可进一步包含一种或多种防腐剂或稳定剂。可以使用本领域已知的任何合适的浓度或混合物，例如0.001-5%或其中的任何范围或数值，例如，但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任何范围或数值。非限制性的实施例包括，无防腐剂、0.1-2%间甲酚（例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%）、0.1-3%苯甲醇（例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%）、0.001-0.5%硫柳汞（例如，0.005、0.01）、0.001-2.0%苯酚（例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%）、0.0005-1.0%烷基芳烃（例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9和1.0%）。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”涵盖任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水和乳剂（例如油/水或水/油乳剂）、以及各种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂以及任何上述载体，附加条件是它们可以在体内使用。载体、稳定剂和佐剂的实施例，参见Martin REMINGTON'S PHARM.SCI., 15th Ed.（Mack Publ.Co.,Easton (1975) and Williams & Williams, (1995)，以及“PHYSICIAN’S DESKREFERENCE”, 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)。
各种递送系统是已知的并且能够被用于施用本公开的化学治疗剂，例如，封装在脂质体、微粒子、微胶囊中，由重组细胞、受体介导的内吞作用表达。例如，参见Wu and Wu(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432，用于构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的治疗性核酸等。递送方法包括但不限于动脉内、肌肉内、静脉内、鼻内和口服途径。在具体的实施方案中，可能需要将本公开的药物组合物局部施用至需要治疗的部位；这可以通过，例如但不限于，手术期间通过注射或通过导管局部输注。
本文识别的对其预期目的有效的药剂可以被施用于通过本文方法识别的适合治疗的对象或个人。治疗量可根据经验确定，并且会随着被治疗的病理、被治疗的对象以及药剂的疗效和毒性而变化。
施用药物组合物的方法是本领域普通技术人员所熟知的，包括但不限于口服、微量注射、静脉注射或肠胃外施用。组合物旨在用于外用、口服、局部施用，以及静脉内、皮下或肌肉注射。在整个治疗过程中，施用可以是连续的或间歇的。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域的技术人员所熟知的，并且会随着被治疗的ASD和患者以及被治疗对象而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医生选择。
试剂盒及包装
本文所述的方法可以例如通过利用预包装的诊断试剂盒（例如下文所述的试剂盒）来进行，其包括至少一种本文所述的探针或引物核酸，其可以方便地使用，例如确定对象是否患有或有风险发展疾病，例如，ASD等。
诊断程序可以用从细胞中分离的mRNA来进行，或者直接在原生组织的组织切片（固定和/或冷冻）上原位进行，例如从活检或切除获得的活检，这样就不需要核酸纯化。核酸试剂可用作这种原位程序的探针和/或引物，例如，参见Nuovo, G. J. (1992) PCR INSITU HYBRIDIZATION: PROTOCOLS AND APPLICATIONS, Raven Press, NY。
除了主要集中于检测一种核酸序列的方法外，图谱也可以在这种检测方案中被评估。例如，可以通过利用差异显示程序、Northern分析和/或RT-PCR来生成指纹图谱。
在一个实施方案中，提供了一种用于诊断ASD的试剂盒或包装，其包含用于测量选自SOD2、RORA、GPER和ERRα中的一个或多个基因的mRNA表达水平的核苷酸引物或探针。在一些实施方案中，引物或探针可用于测量至少两个基因，例如SOD2、RORA、GPER和ERRα，SOD2、RORA和GPER，SOD2、RORA和ERRα，SOD2、GPER和ERRα，SOD2和RORA，SOD2和GPER，或者SOD2和ERRα。
在一些实施方案中，引物或探针可用于测量SOD2、RORA、GPER和ERRα中的至少一个、两个或三个基因。在一些实施方案中，引物或探针可用于测量SOD2、RORA、GPER和ERRα中的至少一个、两个或三个基因。
试剂盒或包装也可用于测量蛋白质表达。例如，一个实施方案提供了一种用于诊断ASD的试剂盒或包装，其包含用于测量选自SOD2、RORA、GPER和ERRα中的一个或多个基因的蛋白质表达水平的抗体。在一些实施方案中，抗体可用于测量基因中的至少两个，例如SOD2、RORA、GPER和ERRα，SOD2、RORA和GPER，SOD2、RORA和ERRα，SOD2、GPER和ERRα，SOD2和RORA，SOD2和GPER，或者SOD2和ERRα。
在一个实施方案中，提供了一种用于诊断ASD的试剂盒或包装，其包含用于测量选自SOD2、OXT、GPER和ERRα中的一个或多个基因的mRNA表达水平的核苷酸引物或探针。在一些实施方案中，引物或探针可用于测量至少两个基因，例如SOD2、OXT、GPER和ERRα，SOD2、OXT和GPER，SOD2、OXT和ERRα，SOD2、GPER和ERRα，SOD2和OXT，SOD2和GPER，或者SOD2和ERRα。
在一些实施方案中，引物或探针可用于测量SOD2、OXT、GPER和ERRα中的至少一个、两个或三个基因。在一些实施方案中，引物或探针可用于测量SOD2、OXT、GPER和ERRα中的至少一个、两个或三个基因。
试剂盒或包装也可用于测量蛋白质表达。例如，一个实施方案提供了一种用于诊断ASD的试剂盒或包装，其包含用于测量选自SOD2、OXT、GPER和ERRα中的一个或多个基因的蛋白表达水平的抗体。在一些实施方案中，抗体可用于测量基因中的至少两个，例如SOD2、OXT、GPER和ERRα，SOD2、OXT和GPER，SOD2、OXT和ERRα，SOD2、GPER和ERRα，SOD2和OXT，SOD2和GPER，或者SOD2和ERRα。
在一些实施方案中，试剂盒或包装还可以包括用于识别MNC或CD34+细胞的标志物。标志物的实施例是抗CD34抗体。在一些实施方案中，还包括用于收集血液样本的含有抗凝血剂的容器。在一些实施方案中，还包括用于培养CD34+或MNC细胞的干细胞培养基。在试剂盒或包装中，还提供了用于纯化mRNA、蛋白质、细胞的试剂，但不限于此。
在一个实施方案中，试剂盒进一步包括使用说明。在一个方面，试剂盒包括包含参考基因表达水平的使用指南（manual）。
实施例
包括以下实施例以说明本文中用来展示本公开的具体实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了在本公开的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为构成其实施的特定模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施例中进行许多改变，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下仍可获得相似或类似的结果。
实施例1： CD34+细胞中下调或上调的基因的识别
进行了初步的大规模筛选实验，表明与未患有ASD的个体相比，从患有自闭症谱系障碍（ASD）的患者的外周血或脐带血分离的CD34+细胞中的某些基因明显过表达或低表达。这个实施例证实了RT-PCR的发现。关注的基因包括SOD2（超氧化物歧化酶2）、ERβ（雌激素受体β）、OXT（催产素/后叶激素运载蛋白I前体肽）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）、ERα（雌激素受体α）。ERRα（雌激素相关受体α）、AR（雄激素受体）、VDR（维生素D受体）、PGR（孕酮受体）、RORA（RAR相关孤儿受体α）和OXTR（催产素受体）。
外周血或脐带血的收集。使用EDTA（优选的）、肝素、柠檬酸盐、酸性柠檬酸盐葡萄糖（ACD）或柠檬酸盐磷酸盐葡萄糖（CPD配方：柠檬酸3.27 g、柠檬酸三钠26.3 g、磷酸钠2.51 g、葡萄糖25.5 g，qs至1000 mL）溶液作为抗凝剂收集<4岁儿童的外周血样本（3-5毫升）或新生儿的脐带血（3-200毫升）。相关机构审查委员会批准了用于实施的伦理批准和同意（Ethical Approval and Consent）的方案，并获得了所有捐赠者和新生儿父母的知情同意。收集的血液样本在收集后立即在4℃下冷藏。它们也可以在4°C的冷藏包装中运输。血液样本在最多6小时内尽快用于分离单核细胞或CD34阳性干细胞。
单核细胞（MNC）的分离。所有与样本接触的玻璃器皿在使用前都经过硅化处理。将玻璃器皿浸泡在1%的硅树脂溶液（Sigmacote，#SL2，来自Sigma Chemicals）中10秒钟，用蒸馏水彻底清洗，并在烘箱中干燥。使用LymphoprepTM试剂（#07861，来自STEMCELLTechnologies）从新鲜血液中分离单核细胞（MNC）。LymphoprepTM是用于分离MNC的密度梯度培养基。血液量在3-15毫升之间。血液样本在15-25℃的温度下处理。分离的MNC被用于分离CD34阳性干细胞，或者冷冻保存以供将来使用。
CD34阳性干细胞的分离。使用EasySep™人类CD34阳性选择试剂盒（#18056，来自STEMCELL Technologies）从新鲜制备的或先前冷冻的MNC分离CD34阳性干细胞。当使用先前冷冻的MNC时，在标记和分离前，将细胞与浓度为100 μg/mL的DNase I溶液（#07900，来自STEMCELL Technologies）在室温（15-25℃）下孵育至少15分钟。聚集的悬浮液通过40 μm细胞过滤器（#27305，来自STEMCELL Technologies）过滤以获得最佳结果。当从新鲜脐带血分离CD34+细胞时，使用EasySepTM人类脐带血CD34选择试剂盒II（#17896，STEMCELLTechnologies）。当从新鲜全血分离CD34+细胞时，使用EasySepTM全血CD34选择试剂盒（#18086，STEMCELL Technologies）。制备后，将细胞重新悬浮在推荐的培养基中用于进一步扩增，或直接使用RNeasy Plus Mini 试剂盒（Qiagen）分离mRNA。
评估CD34阳性细胞的纯度。分离的CD34阳性细胞用于通过流式细胞仪评估纯度。使用抗人CD34抗体（克隆581（#60013，STEMCELL Technologies））标记细胞，然后使用山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体（多克隆，FITC（#60138FI，STEMCELL Technologies））和抗人CD45抗体（克隆HI30，APC（产品目录#60018AZ））。
CD34阳性细胞的体外扩增。当每个样品中上述分离的CD34阳性细胞太少（<200个细胞），无法直接RNA纯化用于后续的mRNA表达测量时，使用StemSpan™ CD34+扩增补充剂（10X）与StemSpan™ SFEM（#09650）培养基组合，通过体外细胞培养进一步扩增上述制备的CD34阳性细胞。使用上述荧光染料缀合的抗体克隆，通过流式细胞术对培养前后的CD34+细胞进行评估。在第2代后收获细胞用于mRNA纯化或其他潜在的应用，例如用于通过蛋白质印记进行蛋白质表达。
从MNC或CD34阳性干细胞制备mRNA。从外周血中分离的MNC的平均产量约为1×106 MNC/ml血液，而脐带血的产量约为2×106 MNC/ml血液。在MNC中，外周血有大约0.02%的CD34阳性细胞，而脐带血有大约0.5%的CD34阳性细胞。如果用3毫升的血液样本来分离CD34阳性细胞，从外周血中可以获得大约600个（3×1×106×0.02%）CD34阳性细胞，从脐带血中可以获得30,000个（3×2×106×0.5%）CD34阳性细胞。分离的CD34阳性细胞可直接用于使用RNeasy Plus Mini试剂盒或RNeasy Micro试剂盒（用于从<1000个细胞中分离RNA，参见附加说明）纯化总RNA，并且最后洗脱液为30 μl，可使用无RNase水或10 mM Tris-Cl，pH 7.5。纯化的RNA可以在-20℃或-70℃的水中保存，RNA的浓度应通过在分光光度计中测量260 nm（A260）处的吸光度来确定。为确保显著性，读数应大于0.15。在260 nm处1个单位的吸光度相当于每毫升40微克的RNA。这种关系仅对在中性pH值下的测量有效。在260和280 nm处的吸光度值之间的比值给出了RNA纯度的估计值。纯的RNA在10 mM Tris-Cl，pH7.5中的A260/A280比值为1.9-2.1。
通过RT反应和实时定量PCR测量mRNA基因表达。使用Sensicript RT试剂盒（Qiagen，参见附加说明）对上述纯化的RNA进行逆转录。每种cDNA的1微升被用来测量靶基因。所有引物都是用Primer 3 Plus软件设计的，Tm为60℃，引物大小为21 bp，产物长度在140-160 bp之间（参见表1）。扩增产物用琼脂糖凝胶确认。使用Quantitect SYBR greenPCR试剂盒（Qiagen）在LightCycler® 480 Instrument II（Roche，产品编号：05015243001，384孔）上进行实时定量PCR。PCR通过以下条件进行：95℃变性15分钟；然后分别在94℃变性15秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行40个循环。β-肌动蛋白或GAPDH被用作管家基因用于转录标准化，并且平均值被用于根据Qiagen的说明使用ΔΔCT方法计算相对转录本水平。简而言之，使用β-肌动蛋白或GAPDH作为标准化因子，通过比较阈值循环法对扩增的转录本进行定量。基因mRNA表达的倍数变化计算为2−ΔΔCT，其中CT =阈值循环，ΔCT=CT（靶基因）-CT（β-肌动蛋白），以及ΔΔCT = ΔCT（实验）-ΔCT（参考）。结果显示在下表1中。
表1.用于实时定量PCR（qPCR）的人类引物的序列
Figure 995465DEST_PATH_IMAGE001
实施例2：基因表达变化的临界值
本实施例将实施例1的测试扩大到从超过120个个体收集的样本。此外，对于被证实为在ASD患者中显著下调的基因之一SOD2，确定了临界值。
本实验评估了从对照组（CTL）或ASD患者外周血分离出的MNC中ERα、ERβ、SOD2、ERRα、OXT、OXTR、GPER、AR、PGR、RORA和VDR的mRNA表达。最显著的数据显示在图1中。结果显示，与对照组（CTL）相比，ASD组的ERβ mRNA降低至71.3%，而与CTL组相比，ASD组的ERRα、GPER、SOD2和OXT的mRNA分别降低至33.3%、39.1%、12.4%和26.1%。在ASD组中SOD2 mRNA水平具有最显著的降低。
本实施例接下来使用原始SOD2 mRNA表达水平通过SPSS 22建立ROC曲线（参见图2）。结果显示，共有CTL病例61例和ASD病例64例（参见图2a），并且ROC曲线如图2b所示，曲线下面积为0.914（参见图2c），这总体上显示出非常好的预测敏感度和特异性。
本实施例接下来使用曲线坐标确定用于ASD患者的诊断的临界值（参见图3）。如图3所示，SOD2 mRNA水平的临界值被设置为0.0306，敏感度为85%，特异性为83%。SOD2 mRNA<0.0306被认为是潜在的ASD患者。
本实施例表明，本技术对基于患者血液的MNC中的SOD2、ERRα、GPER或OXT的mRNA表达水平的ASD患者的诊断具有高敏感度。
实施例3：4基因组（4-Gene Panel）的确认
本实施例从<4岁儿童或新生儿脐带血（3-200 ml）分离的单核细胞（MNC）进一步评估了4基因组，其包括SOD2、ERRα、RORA和GPER。
人类参与者和伦理批准。所有涉及人类参与者的程序和方案都获得到了相关机构审查委员会的伦理批准和参与同意，以及参与者或儿童父母的同意。参与者包括以下两组。
第1组：广东地区所有ASD儿童及相关对照组儿童均捐献不少于3 ml外周血，用于ERβ相关基因的mRNA表达的测定。询问所有父母的产前接触史，无论是组合口服避孕药污染的食物（如海鲜、鱼和虾等）还是黄体酮/孕激素和广泛用于治疗先兆流产的类似药物。
第2组：参与者选自妇产科的孕妇。婴儿出生后，收集脐带血（不少于5毫升）用于测量ERβ相关基因的mRNA表达，并收集和记录口服避孕药的产前接触史或产妇糖尿病史。
ASD诊断。ASD由公认的临床专家诊断。诊断是基于语言病理学家、心理学家和儿科医生的共识获得的。
统计学分析。数据以平均值±SEM表示，除非另有说明，所有实验至少一式四次进行。采用学生t检验来确定不同组的统计学意义，并通过SPSS 22软件建立ROC曲线。P值<0.05时被认为是显著的。
建立自闭症儿童的通过/失败（Pass/Fail）临界值。在去除所有异常值后，对每组TD和ASD儿童（132个ASD和130个TD）的262例评估包括SOD2、ERRα、RORA和GPER的四个ERβ相关基因的mRNA水平（参见图4）。计算每个基因的基因权重（Gene Weight），并计算每个样本的ASD指数值，如下所示。最后，通过SPSS 22软件建立TD和ASD两者样本的122例的基于ASD指数值的ROC（接受者操作特性）曲线，并定义了的ASD预筛查的通过/失败临界值，如图5和6所示。最后，基于ASD指数值的ASD临界值被设置为0.3730，敏感度为1.000，特异性为0.854。
以下方案显示了用于计算每个样本的基因权重和ASD指数值的方法。
1. 通过qPCR计算TD和ASD两者样本的SOD2、ERRα、RORA和GPER的相对mRNA表达。
2. 基于TD和ASD两者样本的每个基因的基因表达，用Excel或SPSS 22软件去除异常值。
3. 基因SOD2、ERRα、RORA和GPER的基因指数的计算。例如，RORA指数可以用以下公式计算：
Figure 365135DEST_PATH_IMAGE002
4. 基因SOD2、ERRα、RORA和GPER的基因权重的计算。例如，RORA权重可以用以下公式计算：
Figure 613714DEST_PATH_IMAGE003
5. 计算每个样品的ASD指数值。每个样品的ASD指数值可以用以下公式计算：
ASD指数值=（RORA权重）×（RORA mRNA）+（SOD2权重）×（SOD2 mRNA）+（ERRα权重）×（ERRα mRNA）+（GPER权重）×（GPER mRNA）。
本实施例证实了与健康儿童相比，SOD2、ERRα、RORA和GPER的4基因组中的每一个在从ASD患者分离的单核细胞中具有显著减少的表达，提供对儿童的ASD状况有效且准确的评估。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
本文说明性地描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛地且不受限制地阅读。此外，本文采用的术语和表达方式已被用作描述的术语而非限制，并且不旨在使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。
因此，应该理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明实施方式进行修改、改进和变化，并且这样的修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。这里提供的材料、方法和实施例代表优选实施方案，是示例性的，并且不意在限制本发明的范围。
在此已经广泛地和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个狭窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其附带条件或否定限制从该属中去除了任何主题，无论所删除的材料是否在本文中进行了具体叙述。
此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述本发明。
在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都明确地通过引用整体并入本文，其程度与每个文献通过引用单独并入相同。在有冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。
应当理解，虽然已经结合上述实施方案描述了本公开，但是前述描述和实施例旨在说明而不是限制本公开的范围。对于本发明所述领域的技术人员而言，本发明范围内的其他方面、优点和修改将是显而易见的。
序列表
<110> 保罗·姚
海缆咨询和贸易有限公司
<120> 自闭症谱系障碍的检测和治疗
<130> 194162-22F-CNP
<150> PCT/CN2019/125335
<151> 2019-12-13
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
gatgcagaag gagatcactg c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
atactcctgc ttgctgatcc a 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
caaaagggtc atcatctctg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
agttgtcatg gatgaccttg g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
atgatgatgt ccctgaccaa g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
acatcagccc catcattaac a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
gatgatgggc ttactgacca a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
agacgagacc aatcatcagg a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
ctccctgcaa gcagtctttc 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
tctgctcaat gtacagcctc a 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
tcttgtcgtc ttcggaaatg t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
cactgtcagc ttctgggttg t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
gctgccagga ggagaactac 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
ctgggagaag gtggcttcc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
caacccctgg atctacatgc t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
caggacaaag gaggacgagt t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
gcctacgtga acaacctgaa c 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 18
tgaggtttgt ccagaaaatg c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
gaagacagcc ccagtgaatg 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
gaccacaatc tctcggtcaa a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
agccctaagc cagagattca c 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
cagcaaagaa ctggaggtgt c 21
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
atcattgcca tactgctgga c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
gagaagctgg gagtgtgtct g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
ggagaagtca gcaaagcaat g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
gacattcggc caaattttac a 21

Claims (28)

1.一种用于诊断ASD（自闭症谱系障碍）的试剂盒或包装，其包含用于测量从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中SOD2（超氧化物歧化酶2）和RORA（视黄酸相关孤儿受体α）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒或包装，其进一步包含用于测量ERRα（雌激素相关受体α）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒或包装，其进一步包含用于测量GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）的表达水平的多核苷酸引物或探针或抗体。
4.根据权利要求1所述的试剂盒或包装，其进一步包含用于识别CD34+细胞的标志物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒或包装，其中所述标志物是抗CD34抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒或包装，其进一步包含含有抗凝血剂的容器。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒或包装，其进一步包含干细胞培养基。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒或包装，其进一步包含mRNA纯化试剂。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒或包装，其进一步包含含有参考基因表达水平的使用指南。
10.一种用于识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法，其包含测量从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中RORA（视黄酸相关孤儿受体α）的表达水平。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包含将RORA的表达水平与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的RORA的参考表达水平进行比较，其中RORA的表达水平降低将所述人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中SOD2（超氧化物歧化酶2）的表达水平，并且其中RORA和SOD2的表达水平降低将所述人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中ERRα（雌激素相关受体α）的表达水平，并且其中RORA、SOD2和ERRα的表达水平降低将所述人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其进一步包含测量单核细胞（MNC）或CD34+细胞中GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）的表达水平，并且其中RORA、SOD2和GPER的表达水平降低将所述人类患者识别为可能患有ASD或可能发展为ASD。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中参考人类对象是真实的参考人类对象，或者是用来自一个或多个未患有ASD的人类对象的集合数据创建的虚拟的参考人类对象。
16.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述表达水平是mRNA表达水平。
17.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其进一步包含从所述人类患者分离所述MNC或CD34+细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述MNC或CD34+细胞从外周血或脐带血分离。
19.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中在从所述人类患者分离细胞后的8小时内开始测量。
20.根据权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述测量是从包括至少50%，或优选地至少75%、85%、90%或95%CD34+细胞的细胞群进行的。
21.根据权利要求10至14中任一项的所述方法，其进一步包含治疗或预防被识别为可能患有或可能发展为ASD的人类患者中的ASD。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗或预防选自行为分解训练（DTT）、关键反应训练（PRT）、早期密集行为干预（EIBI）、言语行为干预（VBI）、基于发展个体差异关系的方法（DIR）、自闭症及相关沟通障碍儿童的治疗和教育（TEACCH）、图片交换沟通系统（PECS）、感觉统合疗法、利培酮（Risperdal）、选择性血清再吸收抑制剂（SSRI）、抗焦虑药物和兴奋剂。
23.一种在有需要的人类对象中治疗ASD的方法，其包含向对象施用增加患者中RORA、SOD2、ERRα或GPER的生物活性的药剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述药剂是编码RORA、SOD2、ERRα或GPER的重组多核苷酸或RORA、SOD2、ERRα或GPER的蛋白质。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述人类对象与未患有ASD的相应人类对象相比具有降低的RORA、SOD2、ERRα或GPER表达。
26.一种用于与计算机系统结合使用的计算机程序产品，所述计算机程序产品包含计算机可读存储介质和嵌入其中的计算机程序机制，计算机机制包含用于执行识别对诊断或预测自闭症谱系障碍（ASD）有用的基因表达信息的方法的可执行指令，其中所述指令包含：
（i）获得从人类患者分离的单核细胞（MNC）或CD34+细胞中选自RORA（视黄酸相关的孤儿受体α）、SOD2（超氧化物歧化酶2）、GPER（G蛋白偶联雌激素受体1）和ERRα（雌激素相关受体α）中的一个或多个基因的表达水平的测量结果；以及
（ii）将所述表达水平的所述测量结果与来自未患有ASD的参考人类对象的相应细胞的参考表达水平进行比较，其中RORA、SOD2、GPER或ERRα的表达水平降低将所述人类患者识别为可能患有ASD或可能发展成ASD。
27.根据权利要求26所述的方法，其中表达量降低超过50%，将所述人类患者识别为患有ASD或可能发展为ASD。
28.根据权利要求26所述的计算机程序产品，其中所述参考人类对象是真实的参考人类对象，或者是用来自一个或多个未患有ASD的人类对象的集合数据创建的虚拟的参考人类对象。
CN202080096038.7A 2019-12-13 2020-12-13 自闭症谱系障碍的检测和治疗 Pending CN115103918A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2019/125335 2019-12-13
CN2019125335 2019-12-13
PCT/CN2020/135991 WO2021115467A1 (en) 2019-12-13 2020-12-13 Detection and treatment of autism spectrum disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115103918A true CN115103918A (zh) 2022-09-23

Family

ID=76317655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080096038.7A Pending CN115103918A (zh) 2019-12-13 2020-12-13 自闭症谱系障碍的检测和治疗

Country Status (3)

Country Link
US (2) US20210180130A1 (zh)
CN (1) CN115103918A (zh)
WO (1) WO2021115467A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2558622A4 (en) * 2010-04-06 2013-07-24 Univ George Washington COMPOSITIONS AND METHODS FOR IDENTIFYING INTERFERENCE FROM THE AUTISM SPECTRUM
EP2773212A4 (en) * 2011-10-31 2015-07-01 Univ Johns Hopkins METHODS AND COMPOSITIONS USED FOR THE TREATMENT OF AUTISM
CA3023014C (en) * 2017-11-06 2023-09-26 Stalicla Sa Pharmaceutical composition for treatment of autism
CN107674913A (zh) * 2017-11-17 2018-02-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种自闭症检测的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
US20210180130A1 (en) 2021-06-17
WO2021115467A1 (en) 2021-06-17
US20230323460A1 (en) 2023-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9279158B2 (en) Compositions and methods useful for the treatment and diagnosis of inflammatory bowel disease
Guedes et al. MicroRNA deregulation and chemotaxis and phagocytosis impairment in Alzheimer's disease
US20100119474A1 (en) Chronic obstructive pulmonary disease susceptibility and related compositions and methods
McKay et al. The low EOMES/TBX21 molecular phenotype in multiple sclerosis reflects CD56+ cell dysregulation and is affected by immunomodulatory therapies
Martínez-Colón et al. SARS-CoV-2 infects human adipose tissue and elicits an inflammatory response consistent with severe COVID-19
Garchow et al. HIF-1α and miR-210 differential and lineage-specific expression in systemic lupus erythematosus
He et al. ETS-1 facilitates Th1 cell-mediated mucosal inflammation in inflammatory bowel diseases through upregulating CIRBP
ES2850281T3 (es) Método para diagnosticar el rechazo agudo subclínico y clínico mediante el análisis de conjuntos de genes predictivos, un agente terapéutico para usar en el tratamiento y kits para determinar la expresión
ES2893482T3 (es) Métodos y composiciones para predecir la disfunción crónica del aloinjerto pulmonar
Aharoni et al. Glatiramer acetate increases T-and B-regulatory cells and decreases granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in an animal model of multiple sclerosis
Chen et al. HDAC1 potentiates CD4+ T cell activation by inhibiting miR-124 and promoting IRF1 in systemic lupus erythematosus
Kennel et al. Longitudinal profiling of circulating miRNA during cardiac allograft rejection: a proof‐of‐concept study
Shin et al. Intranasal inoculation of IFN-λ resolves SARS-CoV-2 lung infection via the rapid reduction of viral burden and improvement of tissue damage
Lan et al. Fate mapping of Spp1 expression reveals age-dependent plasticity of disease-associated microglia-like cells after brain injury
Miles et al. Alpha-defensin 5 expression is regulated by microRNAs in the Caco-2 intestinal epithelial cell line
Mishra et al. Changes in gene expression of pial vessels of the blood brain barrier during murine neurocysticercosis
Hui et al. Other body fluids as non-invasive sources of cell-free DNA/RNA
CN115103918A (zh) 自闭症谱系障碍的检测和治疗
WO2023288130A1 (en) Methods of detecting sjögren&#39;s syndrome using salivary exosomes
WO2018150179A1 (en) Methods for cancer diagnosis using a gene expression signature
US20170072071A1 (en) Inflammation-enabling polypeptides and uses thereof
WO2022049572A1 (en) Immune system restoration by cell therapy
Laliberté An examination of the role of MicroRNA-21 in the pathobiology of degenerative cervical myelopathy using human and animal data
Zhang et al. TET2-mediated upregulation of 5-hydroxymethylcytosine in LRRC39 promoter promotes Th1 response in association with downregulated Treg response in Vogt-Koyanagi-Harada disease
Golimbet et al. Analysis of the association of interleukin 4 and interleukin 10 gene variants with basic personality traits

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination