CN114990014B - 一种防治炎症性肠炎的植物乳酸杆菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum L9，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022169。本发明植物乳杆菌L9安全性高，易培养，口服后易在肠道存活；具有广谱抗菌性，同时具有较高的降胆固醇能力，能减缓急性溃疡性结肠炎小鼠模型的肠道炎症，具有降血脂、预防和治疗临床急性溃疡性结肠炎的潜力，是一种在药物、食品、保健食品中有很好的应用前景的益生菌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种防治炎症性肠炎的植物乳酸杆菌及其用途。
背景技术
炎症性肠炎(IBD)是一种机制不明的肠道炎症性疾病，分为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，病变部位主要涉及结肠、直肠以及回肠。其发病机制复杂且相互交织，主要有环境因素、微生物因素、免疫应答因素和遗传因素。UC是一种局限于结肠粘膜及粘膜下层的连续性炎症，UC患者常出现腹痛，伴有腹泻或脓血便，可伴发一种或多种肠外免疫性疾病。患者肠道菌群的动态平衡被打破，其机体的肠道固有屏障和免疫屏障被破坏，容易被一些一些病原体或病原菌感染。
UC的治疗方法，主要是膳食调理和药物控制。常用药物有氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等。但抗生素的使用容易使致病菌产生耐药性，部分患者对抑制剂不敏感。此外，还有益生菌疗法、干细胞移植疗法、噬菌体疗法和CRISPR-Cas9干预等。
其中，益生菌疗法展现出其独特的优势。益生菌不仅能促进消化，改善和维持肠道菌群的稳态，其分泌的许多活性成分还能抑制病原菌的侵扰，巩固肠道上皮细胞紧密性，即可以通过调节生理功能，进而缓解肠道炎症。
得益于益生菌对生理功能的调节作用，除了用于UC等疾病的治疗外，益生菌在食品、保健食品中也有广泛的应用。不过，对于口服的益生菌产品而言，益生菌需要满足诸多要求：首先，需要保证菌株的安全性，其次，益生菌要易于在肠道存活从而在肠道定植并持续发挥作用，最重要的是，益生菌还要能够有效地发挥其特定功能。筛选研究安全、口服有效的益生菌，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种安全、口服有效且具有多种有益效果的益生菌——植物乳杆菌Lactobacillus plantarum L9，它于2022年2月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏号为CCTCC NO:M2022169。
本发明还提供上述的植物乳杆菌L9在制备抗菌药物、防治炎症性肠炎的药物和/或降血脂的药物中的用途。
进一步地，上述抗菌药物是抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的药物，优选为抗金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923，SA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa ATCC 27853，PA)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP，实验室筛选菌株)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 17978，Ab)、大肠埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922，E.coli)的药物；
上述抗防治炎症性肠炎的药物是防治溃疡性结肠炎的药物，和/或所述降血脂的药物是降胆固醇的药物。
本发明还提供了上述的植物乳杆菌在制备辅助降血脂的保健食品和/或调节肠道菌群功能的保健食品中的用途。
进一步地，上述辅助降血脂的保健食品是降低胆固醇的保健食品。
本发明还提供了一种益生菌药物、食品或保健食品，它是上述的植物乳酸杆菌L9或其代谢产物，加上药用辅料或食品辅料制备而成的药物、食品或保健食品。
进一步地，上述药物是抗菌药物、防治炎症性肠炎的药物和/或降血脂的药物。
更进一步地，上述抗菌药物是抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的药物，优选为抗金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923，SA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853，PA)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP，实验室筛选菌株)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC 17978，Ab)、大肠埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922，E.coli)的药物；上述防治炎症性肠炎的药物是防治溃疡性结肠炎的药物，和/或所述降血脂的药物是降胆固醇的药物。
进一步地，上述保健食品是辅助降血脂的保健食品和/或调节肠道菌群功能的保健食品。
更进一步地，上述辅助降血脂的保健食品是降低胆固醇的保健食品。
本发明的有益效果：1、本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum L9，不含生物氨基因hdc、tdc和odc，不含毒力因子基因Ace、GelE和CylA，对庆大霉素、氨苄西林、卡那霉素和氯霉素敏感，对多粘菌素B和四环素表现为中介，仅对左氧氟沙星耐药，安全性高。
2、本发明植物乳酸杆菌L9具备较强的疏水性、自动聚集能力、耐酸耐碱和耐胆盐能力，易培养，口服后易在肠道存活。
3、本发明植物乳酸杆菌L9具有广谱抗菌性，同时具有较高的降胆固醇能力，并且能减缓急性UC小鼠模型的肠道炎症，具有降血脂、预防和治疗临床急性溃疡性结肠炎的潜力。
本发明所述的“抗菌药物”是指抑菌、杀菌、避免细菌感染的药物，或治疗细菌导致的疾病的药物。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为菌株的疏水性和自动聚集能力。(A)疏水率；(B)自动聚集率。t检验分析：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
图2为菌株的耐酸能力。(A)pH＝2.5时的细菌生存率；(B)pH＝3时的细菌生存率；(C)pH＝6.8处理2h的细菌生存率；(D)pH＝6.8处理4h的的细菌生存率。t检验分析：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
图3为胆固醇脱除率。(A)胆固醇标准曲线；(B)菌株的降胆固醇能力。t检验分析：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
图4为L9预防干预的预实验结果。(A)小鼠体重；(B)小鼠疾病活动指数(DAI)评分；(C)小鼠结肠长度。N：正常对照组，DSS：造模组，Z：L9提前干预组。t检验，*(P<C0.05)，**(P<0.01)，***(P<0.001)，****(P<0.0001)。
图5为小鼠结肠髓过氧化物酶(MPO)活性。默认所有组别与DSS组比较，指定两组间的比较用横线标注。t检验：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
图6为小鼠结肠相关因子表达。(A)IL1-β基因表达量；(B)IL-6基因表达量；(C)IFN-γ基因表达量；(D)Occludin基因表达量；(E)Reg3b基因表达量；(F)Reg3g基因表达量。t检验：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
图7为小鼠结肠HE染色结果。注：放大倍数200×，空白组(N)、造模组(DSS)、L9预防治疗组(Z)。
图8为小鼠结肠组织损伤评分。t检验：*(P<0.05)；**(P<0.01)；***(P<0.001)；****(P<0.0001)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明植物乳酸杆菌的筛选
本发明植物乳酸杆菌是从四川特色泡菜中分离筛选得到。具体分离筛选过程如下：
1、乳酸菌初步分离
收集四川不同传统发酵食品，采集适量标本于无菌管。密封后用冰袋运输至实验室。在实验室立即进行分离和筛选。0.9％的生理盐水将标本倍比稀释至肉眼可见的轻微浑浊状态。将0.1g溴甲酚紫指示剂溶于100mL 20％乙醇中，混匀，每200mL MRS培养基中添加2mL。充分混匀后，菌液平板划线，每个标本制备4-6个琼脂培养基。将培养基置于厌氧培养罐，37℃恒温培养48-72h，厌氧条件为0％O2，4.8％CO2,10.5％H2。初步对比菌落的大小和形态，挑取颜色变黄的单个菌落进行分离纯化并进行革兰染色镜检，筛选将紫色的革兰氏阳性细菌保留下来，最终筛选出138株疑似为乳酸菌的菌株。通过MRS液体培养基传代3次后，用50％的甘油保菌(菌液：甘油＝1:1)。分别保存于-80℃冰箱和-20℃常用冰箱，用于后续实验。
2筛选具有广谱抗菌活性的乳酸菌
活化乳酸菌：乳酸菌甘油菌接种于新鲜MRS液体培养基中，接种量为5％，37℃下厌氧培养24h-36h。
活化指示菌：金黄色葡糖球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25923，SA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853，PA)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，SP，实验室筛选菌株)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii ATCC17978，Ab)、大肠埃希菌(Escherichia coli ATCC 25922，E.coli)接种于新鲜LB液体培养基中，接种量为5％，37℃恒温培养至对数期。
将各菌液于8000rpm离心10分钟。收集乳酸菌上清液，暂时保存至4℃冰箱。收集指示菌沉淀，用灭菌后的生理盐水调菌液OD600至0.12。采用牛津杯双层平板法，即选用70mm的一次性培养皿，下层倾倒5mL 1.3％琼脂浓度的MRS半固体培养基，在超净工作台中吹干。将含0.6％琼脂的MRS半固体培养基放置微波炉中打热，并冷却至50℃，每100mL培养基对应加入300μL指示菌。混匀后每个培养皿上层倾倒4mL，均匀平稳的放置牛津杯。静置一段时间后，阳性对照加200μL的10μg/mL的庆大霉素，阴性对照加无菌MRS液体培养基，其它加益生菌上清液。将培养皿于4℃冰箱放置8小时，然后37℃恒温培养16h-18h，测量抑菌圈直径。
统计抑菌圈大小，经过综合评价，最终从不同标本来源的菌株中挑选了几株具有广谱抗菌活性且抑菌圈较大的乳酸菌。结果显示，其中植物乳酸杆菌Lactobacillusplantarum L9(以下简称L9)对5种致病菌的抑菌综合能力较强，L9的抑菌圈结果见表1，说明L9在制备抗菌药物中有潜在应用前景。
表1、广谱抗菌活性复筛结果
实施例2、本发明植物乳酸杆菌L9的鉴定
16S rRNA基因结果证实L9为植物乳杆菌属，其16S rRNA基因序列如下(SEQ IDNO.1)：
GGGGGCGCGTGCTATAGATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAAA
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明植物乳酸杆菌安全性检测
1、菌株的毒力以及生物氨基因检测
以粪肠球菌ATCC 19433和植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469为对照，对筛选菌株做毒力、生物氨基因检测，引物序列见表2。毒力因子相关基因包括CylA(溶细胞素)、GelE(明胶酶)、Ace(编码粘附胶原蛋白)。生物氨基因包括hdc(组氨酸脱羧酶)，tdc(酪氨酸脱羧酶)和odc(鸟氨酸脱羧酶)。1％的琼脂糖跑胶，凝胶成像仪分析结果。结果见表3，只有粪肠球菌ATCC 19433的gelE和ace有条带，Lactobacillus plantarum L9不含毒力基因CylA，GelE，Ace，也不含生物氨基因hdc，tdc和odc。
表2毒力和生物氨基因引物序列
表3毒力因子及生物胺基因检测结果
2、菌株MIC检测结果
所选抗生素包含左氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、氨苄西林、多粘菌素B、卡那霉素、四环素和美罗培南。参照《2019年的抗微生物药物敏感性试验的执行标准》--非苛养菌和抗生素的MIC的操作步骤。采用琼脂稀释法，具体方法如下：
稀释药物：用万分之一天平称取64mg药物溶解配制为浓度为64mg/mL的母液。其中，左氧氟沙星用冰醋酸溶解，氯霉素用无水乙醇溶解，其它药物：庆大霉素、氨苄西林、多粘菌素B、卡那霉素、四环素、美罗培南均用去离子水溶解。
倒板：配置琼脂浓度为1.5％的MH新鲜培养基，待培养基冷却至50℃左右时与不同浓度的药物母液混匀，接着往下2倍稀释，选择药物浓度为1024μg/mL一直到0.0625mg/mL的浓度进行后续实验。每个90mm培养皿的培养基倒板量为15mL。
菌液的准备：平板上挑取单克隆菌株，生理盐水将菌液OD600调整在0.1-0.13之间(即麦氏浓度0.5)。再将菌液稀释10倍，以大肠埃希菌ATCC 25922作为质控菌株，以植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469作为对照。
安装仪器及接种：为MIC打点仪安装接种针，用酒精擦拭干净，接种前将接种仪用紫外灯照射半小时。对应96孔板孔位安装接种针，每个孔加100μL稀释后的菌液，每株待测菌设置3个平行，生理盐水为阴性对照。将菌液接种到不同抗生素浓度的培养皿上，接种顺序由低浓度到高浓度。
培养及结果的观察：接种结束后，将培养皿吹干，于37℃孵箱厌氧培养48h后观察结果。判断质控菌株是否在参考值范围内，若不在，则整组数据不能使用。Lactobacillusplantarum L9的MIC结果见表4。
表4MIC测定结果
注：S代表敏感，I代表中介，R代表耐药。
以上结果说明，本发明植物乳杆菌L9不含生物氨基因hdc、tdc和odc，以及不含毒力因子基因Ace、GelE和CylA。MIC检测结果，该菌对庆大霉素、氨苄西林、卡那霉素和氯霉素敏感，对多粘菌素B和四环素表现为中介，对左氧氟沙星耐药，安全性较高。
实验例2、本发明植物乳酸杆菌的特性
1、菌株疏水性及自动聚集能力检测
将益生菌液体培养12-16h，以2％的接种量转接在新的MRS液体培养基中，培养24h。8000rpm离心8min，保留菌体沉淀。用灭菌后的PBS洗涤菌体2次，将菌体OD600调至0.6，并将其吸光度值作为A0。用涡旋仪将菌液混匀。吸取3mL菌液和1mL二甲苯混合，混匀后于室温放置10min。再涡旋震荡3min，通风橱静置30min使之分层。分层后，用胶头滴管将上层的有机相吸掉，然后小心吸取水相。实验以无菌PBS作为对照测定OD600(A1)。每份标本做3个平行。计算公式：疏水率(％)＝(1-A1/A0)×100％。自动聚集实验则将调好OD后的菌液在室温下孵育一定时间，分别在0h、2h、4h、6h和8h吸取菌液上清，记录OD600的数值为AX，自动聚集百分比的公式为：自动聚集(％)＝[1-(AX/A0)×100]％。实验以植物乳杆菌标准菌株CGMCC1.2469作为对照菌株，结果如图1，Lactobacillus plantarum L9的疏水性和自动聚集能力均要强于植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469。
2、菌株耐酸实验结果
甘油菌厌氧培养12-16h，再以2％的接种量培养24h，使细菌生长至对数期。8000rpm离心15min获得菌体，用灭菌的PBS溶液洗涤2次，使用酶标仪将OD600调至0.6。吸取2ml调好OD值的菌液离心获得菌体，将菌体重悬于模拟胃液(pH＝2.5和pH＝3)中厌氧培养0h和3h，以及将菌体重悬于模拟肠液中(pH 6.8)分别厌氧培养0h、2h和4h。将不同时间点的菌液拿出，倍比稀释后涂平板。37℃恒温培养48h后计算菌株的存活能力。结果如图2,Lactobacillus plantarum L9在pH＝2.5时的模拟胃液中处理3h其存活率要大于植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469。
3、菌株耐胆盐实验结果
菌株在37℃培养箱中厌氧培养12-16h后，以2％的接菌量转接到新的培养基中培养24h。8000rpm离心15min获得菌体，无菌PBS溶液洗涤，使用酶标仪将OD600调至0.6。吸取2mL调好OD值的菌液离心获得菌体，将菌体重悬于胆盐浓度为0.0％(m/v)、0.3％(m/v)和0.5％(m/v)的MRS液体培养基中，分别培养0h、2h和4h。不同时间点的菌液用PBS溶液进行倍比稀释，然后涂布平板。37℃厌氧培养48h，计算存活率，结果显示，不同胆盐浓度下，无论是Lactobacillus plantarum L9还是植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469，其存活率均大于90％，二者差异无统计学意义。
实验例3、本发明植物乳酸杆菌降胆固醇结果
绘制标准曲线：用无水乙醇配置浓度为100ug/mL的胆固醇标准工作液。使用胆固醇溶液前需要加温使其结晶融化。量取胆固醇标准工作液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4ml、0.5mL、0.6mL置于1.5mL的EP管中，于60℃金属浴蒸干(金属浴至于通风橱内)。往蒸干溶液的EP管中加入200μL冰乙酸，混匀振荡1min，再于80℃的金属浴中加热10min，使胆固醇溶解。贴壁缓慢加入100ul硫酸铁铵显色液，振荡混匀后冷却至室温。560nm处检测吸光度。以胆固醇的浓度为横坐标，以OD560为纵坐标绘制胆固醇标准曲线。
甘油菌厌氧培养24h，以2％的接菌量，将第一次培养的菌液接种到MRSS-Na/bile/chol培养基中，再厌氧培养24h，进行降胆固醇实验。取1mL第二次培养的菌液，8000rpm离心3min。取500μL上清于50mL试管，加入6mL无水乙醇震荡90s(胆固醇的含量为50μg)，加入2mL50％KOH，震荡1min，65℃水浴锅加热1h。试管中加入5mL正己烷，震荡3min，中间静置5min，再震荡3min。加入3mL蒸馏水，震荡4min，静置10min。最后沿试管壁缓慢加入蒸馏水来抬高液面，方便获取位于有机相的正己烷。每个标本吸取4mL有机相，在60℃金属浴下烘干。EP管中加200μL乙酸充分震荡，80℃下加热10min重溶。再加入100μL硫酸铁铵显色液，在OD560 nm下检测吸光度，结果值记作A1。实验以无菌的MRSS-Na/bile/chol培养基代替菌液作为空白对照，记作A0。胆固醇的脱除率：胆固醇的脱除率(％)＝(A0-A1)/A0×100％。结果见图3，可见，本发明L9的降胆固醇能力显著强于植物乳杆菌标准菌株CGMCC 1.2469。
实验例4、本发明植物乳酸杆菌对UC的防治作用
24只雄性SPF级C57BL/6J小鼠在成都医学院科研中心SPF级屏障环境适应性喂养1周。小鼠被随机分为3组(n＝8只)，分别为空白组(N)、造模组(DSS)、L9预防治疗组(Z)。动物实验流程图见图2.1。造模期前7d开始一直到造模结束，N组和DSS组每天灌胃200μL去离子水，Z组每天灌胃200μL L9菌液(1×109CFU/mL)。造模期间，小鼠自由饮食饮水，除N组，其余组将去离子水换成3％DSS水。实验所用的灌胃菌液由L9甘油菌离心后用去离子水重悬所得，每次灌胃需制备新鲜的灌胃菌液。
1、小鼠体重变化、DAI评分及结肠长度变化
每天在相同时间段灌胃并观察小鼠的状态，记录小鼠体重和水重，依照疾病活动指数(DAI)评分标准(见表5)记录腹泻和便血程度，公式：DAI＝(腹泻分数+便血分数+体重分数)/3。剖取结肠后，立即测量长度并拍照，肉眼观察结肠状态，结果见图4。说明L9干预能有效缓解结肠缩短，降低DAI评分。
表5疾病活动指数(DAI)评分标准
2、小鼠结肠髓过氧化物酶活力
按照南京建成公司的髓过氧化物酶(MPO)测试盒检测小鼠结肠的MPO活性。每克组织湿片在37℃反应体系中H2O2被分解1μmoL为一个酶活力单位。取适量小鼠中段结肠，称重记录。以该结肠的19倍混入匀浆介质，进行组织匀浆处理，尽量不要有组织块。按照9:1的比例混合将组织匀浆和三号试剂，37℃水浴15min。测定管中加入200μL样本、200μL试剂四和3mL显色剂，混匀后37℃水浴30min。3mL去离子水代替显色剂作为对照管。各试管加入50μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，立即在460nm处检测吸光度(去离子水调零)。酶活力计算公式：MPO活力(U/克组织湿重)＝(测定OD值-对照OD值)/(11.3×0.05g/mL×0.2mL)。
如图5所示，DSS模型组的MPO活性显著高于N组，说明DSS损伤了小鼠肠粘膜，导致大量炎症细胞浸润。和DSS组相比，Z组降低了小鼠结肠MPO活性(P<0.01)。
3、qPCR检测小鼠结肠组织相关基因表达水平
取部分小鼠中段结肠(靠近结肠近端)于1mL Trizol中，进行组织匀浆。每个EP管加入200μL氯仿，震荡混匀30s，室温静置5min。4℃，12000rpm离心15min。组织混合液分为三层，上层和中层分别为RNA和DNA，下层为蛋白质、酚类-氯仿混合物。吸取400μL上层RNA于洁净EP管，添加400μL异丙醇，震荡混匀30s，室温静置10min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，勿回流。1mL经预冷的75％乙醇洗涤沉淀30s，室温下7500rpm离心5min，弃上清，重复该步骤。滤纸吸去多余乙醇，40μL DEPC水溶解RNA沉淀。分装RNA模板，-80℃保存。ND2000检测吸光度和浓度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA纯度。
用RNase-free ddH2O将各样本RNA溶液稀释到同一浓度。使用HiScriptR III RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)将RNA逆转录为cDNA。吸取4μL 4×gDNA wiper Mix，混合1μg的RNA模板，用RNase-free ddH2O补足总体积至16mL。轻轻吹打混匀，42℃加热2min。在上述反应管中直接加入4μL 5×HiScript III qRT SuperMix，轻轻吹打混匀。37℃加热15min，85℃加热5s。ND2000检测cDNA浓度。参照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix说明书，稀释cDNA至同一浓度，分装数管，-80℃保存。
以β-actin作为内参基因，检测小鼠结肠IL-6、IL-1β、Occludin、Reg3b、Reg3g、IFN-γ的基因表达量，相关引物见表6。使用南京诺唯赞公司的ChamQ Universal SYBRqPCR Master Mix进行qPCR实验。结果见图6，Lactobacillus plantarum L9能有效降低结肠IL1-β、IL-6和IFN-γ表达量，增强Occludin表达量，促进抗菌肽Reg3g和Reg3b的转录水平。
qPCR反应体系：
qPCR反应条件：
表6、结肠基因引物序列
4、结肠组织病理学分析
采集末端结肠浸泡在组织固定液中暂存。进行石蜡包埋、切片、摊片和烘片。在玻片上滴加几滴苏木素染液，室温孵育8min后自来水缓流冲洗。滴加0.1％的盐酸-乙醇，停留10-30s，自来水冲洗。PBS中脱色反蓝30-60s，自来水冲洗5min，95％乙醇洗5-10s。用伊红染色液复染标本30s-2min。95％乙醇脱水两次，每次5min。将标本浸在二甲苯槽中，浸泡2次，每次5min，晾干。镜下观察并拍照，做结肠组织损伤评分，评分方法见表7。小鼠结肠HE染色图(图7)及组织损伤评分(图8)所示，N组结肠形态良好，黏膜完整，杯状细胞有序排列，肠腺丰富，几乎没有发现炎细胞。DSS组大面积肠隐窝受损，粘膜层和粘膜下层可见大量炎细胞浸润，杯状细胞明显减少，其结肠组织学评分明显高于N组。Lactobacillus plantarum L9效缓解了炎症细胞的浸润，降低了结肠组织学评分，并且保留了部分肠道隐窝。
表7结肠组织损伤评分
以上结果说明，本发明植物乳杆菌L9能有效降低UC小鼠结肠IL1-β、IL-6和IFN-γ表达量和MPO(髓过氧化物酶酶活性)表达量，促进抗菌肽Reg3g和Reg3b的转录水平，减少炎细胞浸润，有效缓解结肠缩短，降低DAI评分。能减缓急性UC小鼠模型的肠道炎症，具有应用于预防和治疗临床急性溃疡性结肠炎的药物的潜力。
综上，本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)L9，安全性高，易培养，口服后易在肠道存活；具有广谱抗菌性，同时具有较高的降胆固醇能力，能减缓急性溃疡性结肠炎小鼠模型的肠道炎症，具有降血脂、预防和治疗临床急性溃疡性结肠炎的潜力，是一种在药物、食品、保健食品中有很好的应用前景的益生菌。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 一种防治炎症性肠炎的植物乳酸杆菌及其用途
<130> GY044-2022P0115263CC
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (10)
1.一种植物乳杆菌Lactobacillus plantarum L9，其特征在于，它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2022169。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备抗菌药物、防治炎症性肠炎的药物和/或降血脂的药物中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗菌药物是抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的药物；
和/或所述防治炎症性肠炎的药物是防治溃疡性结肠炎的药物；
和/或所述降血脂的药物是降胆固醇的药物。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备辅助降血脂的保健食品和/或调节肠道菌群功能的保健食品中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述辅助降血脂的保健食品是降低胆固醇的保健食品。
6.一种益生菌药物、食品或保健食品，其特征在于，它是权利要求1所述的植物乳酸杆菌或其代谢产物，加上药用辅料或食品辅料制备而成的药物、食品或保健食品。
7.如权利要求6所述的药物、食品或保健食品，其特征在于，所述药物是抗菌药物、防治炎症性肠炎的药物和/或降血脂的药物。
8.如权利要求7所述的药物、食品或保健食品，其特征在于，所述抗菌药物是抗革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的药物；
和/或所述防治炎症性肠炎的药物是防治溃疡性结肠炎的药物；
和/或所述降血脂的药物是降胆固醇的药物。
9.如权利要求6所述的药物、食品或保健食品，其特征在于，所述保健食品是辅助降血脂的保健食品和/或调节肠道菌群功能的保健食品。
10.如权利要求9所述的药物、食品或保健食品，其特征在于，所述辅助降血脂的保健食品是降低胆固醇的保健食品。
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