CN114946895A - 一种草果精油的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种草果精油的应用，所述的草果精油在制备防治烟草疫霉产品中的应用。本发明为实现作物病害的绿色防控，从辛香料植物源中筛选高效的杀菌活性成分，采用菌丝生长速率法和活体植株法测定了草果精油对烟草疫霉的抑菌活性。草果精油对烟草疫霉具有显著的抑制作用：在熏蒸方式下，草果精油对烟草疫霉抑制的效率为42.3~96.7%；在活体植株方式下，草果精油对烟草疫霉的防效为60.5%；草果精油对烟草疫霉菌丝生长形态有显著的影响。本发明发现了草果精油具有环保、低细胞毒性、广谱性及避免菌株抗药性产生等诸多优点，有望成为防治烟草疫霉环境友好型的新型农药。

Description

一种草果精油的应用
技术领域
本发明属于生物应用技术领域，进一步属于生物农药技术领域，具体涉及一种草果精油的应用。
背景技术
烟草疫霉（Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker）是一种土传病原菌，具有广泛的寄主范围，在世界范围内严重危害烟草和其他茄科作物，特别在云南烟区，给烟农带来严重的经济损失。烟草疫霉可引起根、茎腐烂以及叶片枯萎，在烟草生长的各个生育期均可侵染引起发病。目前对该病的防治主要采取连续、大量使用化学农药的方法，由此导致病原菌抗性生理小种的产生、土壤微生物群落的破坏、农田生态环境的破坏以及农产品农药残留超标对人的健康带来危害。因此，研发安全、有效、环境友好型的生物源农药替代化学农药极为重要。
植物精油是来源于植物不同部位的次生代谢产物。近年来，随着对绿色安全农产品需求的增加，应用植物精油作为传统化学农药的替代品成为研究农业病害的热点。草果(Amomum tsaoko)是姜科(Zingiberaceae)豆蔻属(Amomum)多年生草本植物，在我国主要产于云南、广西、四川、贵州等省区，其中云南种植面积占全国95%以上，是中国草果的主产区和地道产区。国内不同研究机构对草果的栽培、病虫害防治、挥发油成分开展了初步的研究，以草果为主要原料开发的中药复方对乙肝病毒病取得了明显的疗效，草果的抑菌、镇痛、抗胃溃疡、促消化等功效已有报道。但尚未见关于利用辛香料植物草果精油防治烟草疫霉的报道。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种草果精油的应用；第二目的在于提供一种草果精油药剂。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的草果精油在制备防治烟草疫霉产品中的应用。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的草果精油药剂由草果精油与有机溶剂或乳化剂组成。
本发明为实现作物病害的绿色防控，从辛香料植物源中筛选高效的杀菌活性成分，采用菌丝生长速率法和活体植株法测定了草果精油药剂对烟草疫霉的抑菌活性。结果表明，当草果精油浓度达到37μg/mL时，草果精油药剂对烟草疫霉有显著的抑制作用；在活体植株方式下，草果精油药剂对烟草疫霉的防效为60.5%。剂量效应实验结果表明，在熏蒸方式下，草果精油药剂对烟草疫霉抑制的效率为42.3~96.7%。扫描电镜观察菌丝形态结果表明，草果精油药剂对烟草疫霉菌丝生长形态有显著的影响。本发明的草果精油药剂具有环保、低细胞毒性、广谱性及避免菌株抗药性产生等诸多优点，有望成为防治烟草疫霉环境友好型的新型农药。
附图说明
图1为草果精油药剂对烟草疫霉菌落大小的影响；
图2为不同浓度的草果精油药剂对烟草疫霉的抑制效率；
图3为草果精油药剂对烟草疫霉菌丝形态的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的草果精油的应用为所述的草果精油在制备防治烟草疫霉产品中的应用。
所述的产品为农药。
所述的产品为微乳剂、气雾剂或水乳剂。
本发明所述的草果精油药剂由草果精油与有机溶剂或乳化剂组成。
所述的草果精油与有机溶剂或乳化剂的体积配比为1：（1～10）。
所述的草果精油的浓度为37μg/mL以上。
所述的有机溶剂为丙酮或乙醇，乳化剂为吐温-20或吐温-80。
本发明所述的草果精油的应用包括草果精油药剂的制备、草果精油药剂的使用以及草果精油药剂抗病形态的观察等步骤，具体包括：
1、草果精油药剂配制：将草果精油按照1：1～10倍的比例与吐温-20或吐温-80或丙酮或乙醇混合，充分混匀后，待用；
2、精油药剂熏蒸处理
用打孔器在无菌条件下取直径为5mm的烟草疫霉菌饼接入20mL黑麦培养基的培养皿(直径90mm)中央。将平板倒置，取1片直径为5mm的无菌滤纸置于皿盖中央，分别吸取1、2、4、6、8和10μL的草果精油药剂滴于滤纸片上，以滤纸片上不添加草果精油药剂的平板为对照。封口膜密封后置于25℃温度下培养5d左右，测量菌落直径并计算抑菌率。
3、草果精油药剂对菌丝形态生长的影响
采用扫描电子显微镜观察草果精油药剂处理后的菌丝形态。将培养5d后的菌饼分别接种在含有草果精油药剂和不含草果精油药剂的黑麦培养基上，继续培养5d左右，至对照组菌丝接近培养皿边缘为止。将样品置于扫描电子显微镜下观察菌丝形态。
本发明所述的草果精油的制备：
采用水蒸气蒸馏-二氯甲烷萃取法。将新鲜草果壳与草果种仁分开，把新鲜草果种仁放入250mL烧杯中，向烧杯中加入液氮，待液氮挥发完后，使用粉碎机将冷冻过的新鲜草果种仁粉碎。取200g粉碎后的新鲜草果种仁，注入蒸馏水1~3L和二氯甲烷3~5L进行蒸馏3~6h，过滤后得到滤液I和新鲜草果种仁滤饼；将新鲜草果种仁滤饼再加入玻璃瓶中，向玻璃瓶中加入3~5L重蒸的二氯甲烷，重复上面操作，过滤后得到滤液II，合并滤液I和滤液II得到新鲜草果种仁萃取液（油水混合物）；减压浓缩法去除油水混合物中的二氯甲烷，经无水硫酸钠脱水过滤后获得纯净的草果精油，置于棕色瓶内4℃低温保存待用。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
草果精油药剂的制备：将草果精油按照1：10的比例与吐温-20混合，充分混匀后，再用蒸馏水稀释，使草果精油的终浓度为10μg/mL；
实施例2
草果精油药剂的制备：将草果精油按照1：7的比例与吐温-80混合，充分混匀后，再用蒸馏水稀释，使草果精油的终浓度为25μg/mL；
实施例3
草果精油药剂的制备：将草果精油按照1：5的比例与丙酮混合，充分混匀后，再用蒸馏水稀释，使草果精油的终浓度为50μg/mL；
实施例4
草果精油药剂的制备：将草果精油按照1：1的比例与乙醇混合，充分混匀后，再用蒸馏水稀释，使草果精油的终浓度为250μg/mL；
实施例5
熏蒸法草果精油药剂中草果精油浓度的计算：分别取1、2、4、6、8和10μL的草果精油，与适量有机溶剂或乳化剂充分混匀后滴于滤纸片上。以草果精油密度0.9243g/mL，90mm直径的培养皿中空气体积50mL计算，则熏蒸法实验草果精油药剂中草果精油的终浓度分别18.5μg/mL、37μg/mL、74μg/mL、111μg/mL、148μg/mL和185μg/mL。
实施例6
草果精油药剂熏蒸处理的烟草疫霉菌斑观察：用打孔器在无菌条件下取直径为5mm的烟草疫霉菌饼接入20mL黑麦培养基的培养皿(直径90mm)中央。将平板倒置，取1片直径为5mm的无菌滤纸置于皿盖中央，吸取10μL草果精油药剂滴于滤纸片上，此时草果精油药剂中草果精油的浓度为185μg/mL，以滤纸片上不添加草果精油药剂的平板为对照。封口膜密封后置于25℃温度下培养5d左右，观察烟草疫霉菌斑大小及形状。
结果如图1所示：185μg/mL草果精油药剂对烟草疫霉有明显的体外抑制作用，抑制了烟草疫霉菌丝的生长。与空白对照组相比，草果精油药剂处理导致烟草疫霉菌落显著变小，抑制效果显著。
实施例7
不同浓度草果精油药剂熏蒸处理对烟草疫霉的抑制效果：用打孔器在无菌条件下取直径为5mm的烟草疫霉菌饼接入20mL黑麦培养基的培养皿(直径90mm)中央。将平板倒置，取1片直径为5mm的无菌滤纸置于皿盖中央，分别吸取1、2、4、6、8和10μL的草果精油药剂滴于滤纸片上，使草果精油的终浓度分别为18.5μg/mL、37μg/mL、74μg/mL、111μg/mL、148μg/mL和185μg/mL，以滤纸片上不添加草果精油药剂的平板为对照。封口膜密封后置于25℃温度下培养5d左右，测量菌落直径并计算抑菌率，每处理3次重复。按如下公式计算抑菌率：抑菌率(%)=(dC-dT)/(dC-5)×100。式中：dC为对照菌落直径；dT为不同处理条件下的菌落直径。
结果如图2所示，通过计算菌丝生长抑制率发现，草果精油药剂对烟草疫霉有显著的抑制效果，且具有浓度依赖性，随着浓度的增加，其抑制效果有所提高，在较高浓度（185μg/mL）时，草果精油药剂的抑制效率达到了96.7%。在较低浓度（37μg/mL）时，其对烟草疫霉的抑制率为76.9%，抑制效果优于市售农药精甲霜·锰锌，但在浓度为18.5μg/mL时，其抑制效率低于精甲霜·锰锌。
实施例8
草果精油药剂对烟草疫霉菌丝形态的影响：采用扫描电子显微镜观察草果精油药剂处理后的菌丝形态。将培养5d后的菌饼分别接种在含有185μg/mL草果精油药剂和不含草果精油药剂的黑麦培养基上，继续培养5d左右，至对照组菌丝接近培养皿边缘为止。将样品置于扫描电子显微镜下观察菌丝形态。
结果如图3显示，185μg/mL草果精油药剂对烟草疫霉菌丝生长状态有较大的影响。未经草果精油药剂处理的菌丝形态成均匀的丝状，内部物质分布均匀，菌丝长度较长，而且分叉较少，无明显的异常膨大；经过185μg/mL草果精油药剂处理的烟草疫霉菌丝表面不再平滑，菌丝弯曲增多，而且菌丝上发芽增多，菌丝分支明显增多。部分菌丝结节出现膨胀，内部出现空泡，是草果精油药剂处理后菌丝细胞内部结构遭到破坏，细胞膜受损，内溶物释放到细胞外所致。
实施例9
草果精油药剂在活体植株上对烟草疫霉的抑制效果：试验采用菌饼茎秆接种法。取苗龄60～70ｄ烟苗，使用灭菌牙签轻轻划伤茎基部表皮，立即进行基部185μg/mL草果精油药剂喷施处理，覆棉花保湿，24ｈ后将直径5mm的菌丝块置于基部划伤处并用保鲜膜包裹。每处理10株烟苗，设置３个重复，于7ｄ后以株为单位进行记录病情。
病害分级标准、调查方法及病情指数、相对防效计算按照中华人民共和国国家标准（GB/T 23222-2008）的规定进行。
结果如表1所示，草果精油药剂在活体植株上对烟草疫霉有显著的抑制效果，其在草果精油较高浓度（185μg/mL）时对烟草疫霉的预防抑制效率达到了60.5%，抑制效果与市售农药精甲霜·锰锌相当。
表1 草果精油药剂在活体植株上对烟草疫霉的抑制效果
Figure 962673DEST_PATH_IMAGE001

Claims (7)

1.一种草果精油的应用，其特征在于，所述的草果精油在制备防治烟草疫霉产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的草果精油的应用，其特征在于，所述的产品为农药。
3.根据权利要求1或2所述的草果精油的应用，其特征在于，所述的产品为微乳剂、气雾剂或水乳剂。
4.一种草果精油药剂，其特征在于，所述的草果精油药剂由草果精油与有机溶剂或乳化剂组成。
5.根据权利要求4所述的草果精油药剂，其特征在于，所述的草果精油与有机溶剂或乳化剂的体积配比为1：（1~10）。
6.根据权利要求4或5所述的草果精油药剂，其特征在于，所述的草果精油的浓度为37μg/mL以上。
7.根据权利要求4或5所述的草果精油药剂，其特征在于，所述的有机溶剂为丙酮或乙醇，乳化剂为吐温-20或吐温-80。
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