CN114946660A - 一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，属于中药材培育技术领域。本发明的培育方法包括如下步骤：将丹参叶片接入胚性愈伤组织诱导培养基，诱导胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织接入液体培养基，进行诱导培养；将所述诱导培养后的胚性愈伤组织，去除残留的液体培养基，接入分化培养基，进行分化培养，得到丹参分化苗；将所述丹参分化苗接入增殖培养基，进行增殖培养，得到丹参增殖苗；将所述丹参增殖苗接入生根培养基，进行生根培养，筛选茎粗壮、叶节间短的生根苗作为丹参幼苗；所述丹参幼苗经炼苗后用于机械种植。利用该方法培育得到的丹参组培苗，茎秆粗壮、叶节间短，便于机械化种植操作。

Description

一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法

技术领域

本发明涉及中药材培育技术领域，尤其涉及一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法。

背景技术

丹参是我国传统医药学中应用最早、最广泛的药物之一，在临床上被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、缺血性中风等疾病。目前以丹参为原料生产的中成药有100多种，其中复方丹参滴丸已进入16个国家的主流医药市场，2005年丹参多酚酸盐及其注射用丹参多酚酸盐作为国家新中成药已经投放市场。这些药品的开发不仅充分发掘了丹参的药用价值，也扩大了丹参的市场需求造成丹参供应的短缺。然而，丹参的种植一直沿用三种方式，一是用种子直接播种育苗；二是通过根育苗繁殖，三是通过组培苗繁殖，不管采用哪种方法繁殖，都是靠人工进行作业，劳动强度大，费工费时，效率也比较低，因此对传统移栽进行改革，实现机械化种植，已成为中草药规模化发展的重要手段，与其他作物相比，中药材生产机械化与农艺技术相结合显得更为重要，任务也更加艰巨，要以提高劳动生产率、提高中药材生产利益为根本出发点，要充分考虑解决中药材生产农艺与农机结合起来的问题。适应机械移栽的中药材育苗标准化技术是当前的重中之重，也是农业机械化的重要内容。提高中药材农业机械化水平是促进我国农业可持续发展的重要途径之一，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，利用本发明方法培育得到的丹参组培苗呈直立型，茎秆粗壮、叶节间短，便于机械化种植操作。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，包括如下步骤：

(1)将丹参叶片接入胚性愈伤组织诱导培养基，诱导胚性愈伤组织；

(2)将所述胚性愈伤组织接入液体培养基，进行诱导培养；

(3)将所述诱导培养后的胚性愈伤组织，去除残留的液体培养基，接入分化培养基，进行分化培养，得到丹参分化苗；

(4)将所述丹参分化苗接入增殖培养基，进行增殖培养，得到丹参增殖苗；

(5)将所述丹参增殖苗接入生根培养基，进行生根培养，筛选茎粗壮、叶节间短的生根苗作为丹参幼苗；

(6)所述丹参幼苗经炼苗后用于机械种植。

优选的，所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2.0～3.0mg/L6-BA+0.8～1.2mg/L2,4-D+0.3～0.6mg/L维生素C；所述诱导胚性愈伤组织的诱导条件为：先进行暗培养，再进行光照培养；所述暗培养的温度为22～26℃，时间为12～18天；所述光照培养的温度为22～26℃，时间为6～8天，光照强度为800～1200Lux。

优选的，所述液体培养基是将秋水仙氨磺乐灵溶液与1/2MS按照1：8～12的体积混合配制而成，所述秋水仙氨磺乐灵溶液中秋水仙的质量体积浓度为0.005～0.015％，所述秋水仙氨磺乐灵溶液中氨磺乐灵的质量体积浓度为0.005～0.015％；所述诱导培养在黑暗条件下进行，所述诱导培养的温度为15～20℃，时间为48～120h。

优选的，所述去除残留的液体培养基的方法为：将筛选的胚性愈伤组织接入1/2MS液体培养基，在24～25℃下暗培养20～28h。

优选的，所述分化培养基为MS+0.5～1.5mg/L 6-BA+0.3～0.6mg/L IBA+0.3～0.6mg/L维生素C；所述分化培养的温度为24～25℃，时间为10～15天，光照强度为2500～3500Lux。

优选的，所述增殖培养基为MS+0.25～0.5mg/L 6-BA+0.05～0.15mg/L IBA；所述增殖培养的温度为24～25℃，时间为12～16天，光照强度为2500～3500Lux。

优选的，所述生根培养基为MS+0.5～2mg/L IBA+0.03～0.06mg/L NAA；所述生根培养的温度为24～25℃，时间为18～22天，光照强度为2500～3500Lux。

优选的，步骤(5)中所述筛选茎粗壮、叶节间短的生根苗，是筛选的茎粗为1.36～1.60mm，叶节间距为0.4～0.6mm的生根苗。

优选的，所述炼苗的方法为：将所述丹参幼苗移栽到育苗基质中，在11～24℃下缓苗15～20天，然后移入室外炼苗8～12天；所述育苗基质由蛭石、椰糠、土按照1～2：1～3：1～3比例配制得到。

优选的，所述缓苗期间喷施叶面复合肥2～3次，每次间隔7～10天；所述叶面复合肥为15-15-15氮磷钾水溶性复合肥。

本发明提供了一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，按照本发明的方法培育得到的丹参幼苗茎秆粗壮，叶节间短，茎粗可达1.36～1.60mm，叶节间距缩短为0.4～0.6mm，呈直立型，非常利于机械化操作，使用栽苗机一个小时可移栽3500棵丹参苗，不仅又快又标准，还大大节约了成本，解决了传统人工栽种方式种植成本高的问题。

附图说明

图1为实施例1中经剪切的丹参叶片；

图2为实施例1中丹参叶片在胚性愈伤组织诱导培养基上暗培养第7d的状态图；

图3为实施例1中诱导培养得到的胚性愈伤组织；

图4为实施例1中液体培养基诱导96h组诱导培养第24h的愈伤组织状态图；

图5为实施例1中液体培养基诱导96h组胚性愈伤组织分化培养第15d的丹参分化苗状态图；

图6为实施例1中液体培养基诱导96h组丹参分化苗增殖培养第7d的丹参增殖苗；

图7为实施例1中经液体培养基不同诱导时间的丹参增殖苗，图7A为诱导48h组丹参增殖苗，图7B为诱导72h组的丹参增殖苗，图7C为诱导96h组的丹参增殖苗，图7D为诱导120h组的丹参增殖苗；

图8为实施例1中液体培养基诱导96h组的丹参增殖苗生根培养第10d的丹参生根苗；

图9为实施例1中培养20d后的丹参幼苗根系图；

图10为实施例1中液体培养基诱导96h组筛选得到的丹参幼苗与0h组的丹参幼苗对比图，图左为液体培养基诱导96h组筛选得到的丹参幼苗，图右为液体培养基诱导0h组的丹参幼苗；

图11为实施例1中液体培养基诱导96h组的丹参幼苗在育苗基质中培养第7d的状态图；

图12为实施例1中液体培养基诱导0h组的丹参幼苗在育苗基质中培养第7d的状态图；

图13为实施例1中炼苗后的液体培养基诱导96h、120h组的丹参苗与0h组的丹参苗对比图，图左为液体培养基诱导96h的丹参苗，图中为液体培养基诱导120h的丹参苗，图右为液体培养基诱导0h的丹参苗；

图14为实施例1中液体培养基诱导96h的丹参苗和液体培养基诱导0h的丹参苗根以上部分的对比图，图14A为液体培养基诱导96h的丹参苗根以上部分，图14B为液体培养基诱导0h的丹参苗根以上部分；

图15为实施例1中液体培养基诱导96h的丹参苗和液体培养基诱导0h的丹参苗根以上部分的对比图，图15A为液体培养基诱导96h的丹参苗根以上部分，图15B为液体培养基诱导0h的丹参苗根以上部分；

图16为实施例2中组培苗在温室中培养第20d的小苗生长状态图；

图17为实施例2中移栽后第3个月的丹参生长状态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本发明提供了一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，具体包括如下步骤：

(1)选取自山东采集的优质白花丹参，剪取叶片，放入干净的培养瓶中，加入适量蒸馏水与白猫洗洁精，在摇床上以100r/min的速度摇洗30min；然后用蒸馏水洗净洗涤液，去除多余水分；在超净台中，用75％乙醇轻轻摇晃洗涤叶片45s，用无菌水将乙醇洗净；将叶片放入0.1％氯化汞溶液中，轻轻摇晃，消毒灭菌处理8min；消毒完成后用无菌水洗涤叶片5次，放置于已灭菌干净培养皿中的滤纸上待用。在超净台内，将剪刀、镊子置于酒精灯上方充分灼烧灭菌，置于干净培养皿上冷却；用镊子夹起已消毒完毕的外植体叶片，把叶片损伤部分剪去；用剪刀轻微剪除叶缘，创造叶片伤口，再将叶片剪成0.5cm×0.5cm大小，如图1所示。

(2)按照MS+2.5mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D+0.5mg/L维生素C的配方配制胚性愈伤诱导培养基，并在121℃下灭菌20min。用镊子将剪好叶片放入装有胚性愈伤组织诱导培养基的培养瓶内摆好，一瓶放置4片，在24℃下暗培养15天，其中叶片在胚性愈伤组织诱导培养基上暗培养第7d的状态如图2所示；15天后将培养瓶转移至光照强度为1000Lux的培养室架子上，在24℃下培养7天，得到胚性愈伤组织，如图3所示。

(3)用水配制质量体积浓度为0.01％的秋水仙素溶液，并以该秋水仙素溶液为溶剂，溶解氨磺乐灵，使氨磺乐灵在秋水仙素溶液中的质量体积浓度为0.01％，从而配制得到秋水仙氨磺乐灵溶液；将秋水仙氨磺乐灵溶液与1/2MS按照1：10的体积混合，得到液体培养基。在超净台内，用灭菌的镊子将胚性愈伤组织块从胚性愈伤组织诱导培养基的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小为0.5cm×0.5cm，将分割的胚性愈伤组织块接入灭好菌的液体培养基中，在18℃下分别暗培养诱导0、48、72、96、120h，其中液体培养基诱导96h组诱导培养第24h的愈伤组织如图4所示；培养完成后将各组愈伤组织接入1/2MS液体培养基中，在24℃下暗培养24小时，去除残余的液体培养基中的秋水仙氨磺乐灵溶液。

(4)按照MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+0.5mg/L维生素C的配方配制分化培养基，并在121℃下灭菌20min。将经过液体培养基诱导的5组(0、48、72、96、120h)胚性愈伤组织接入分化培养基中，在光照3000Lux，24℃下培养15天，得到丹参分化苗。其中液体培养基诱导96h组胚性愈伤组织分化培养第15d的丹参分化苗如图5所示。

(5)按照MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA的配方配制增殖培养基，并在121℃下灭菌20min。将各组丹参分化苗接入增殖培养基中，在光照3000Lux，24℃下培养14天，其中液体培养基诱导96h组丹参分化苗增殖培养第7d的丹参增殖苗如图6所示，增殖培养结束后得到4组(48、72、96、120h)丹参增殖苗，如图7所示。

从图7可以看出，液体培养基不同诱导时间的丹参增殖苗均呈直立生长状态。但是不同诱导培养时间下的丹参苗茎粗和叶节间距具有一定差异，其中以诱导时间为96h的丹参增殖苗生长最旺盛。

(6)按照MS+1.5mg/L IBA+0.05mg/L NAA的配方配制生根培养基，并在121℃下灭菌20min。将各组丹参增殖苗接入生根培养基中，在光照3000Lux，24℃下培养20天。其中，液体培养基诱导96h组的丹参增殖苗生根培养第10d的丹参生根苗如图8所示，培养20天后的丹参幼苗根系如图9所示。选择茎粗为1.36～1.60mm，叶节间距为0.4～0.6mm的生根苗作为丹参幼苗。将液体培养基诱导96h组筛选得到的丹参幼苗与0h组的丹参幼苗进行对比，如图10所示。

从图10可以看出，液体培养基诱导96h组的丹参幼苗(图左)茎秆粗壮，呈直立型生长，液体培养基诱导0h组的丹参幼苗(图右)茎秆较细，自根部呈分散型生长。

(7)将筛选的丹参幼苗移栽到由蛭石、椰糠、土按照1：2：2比例配制的育苗基质中，在18℃缓苗17天，每隔8天喷施15-15-15氮磷钾水溶性复合肥1次，缓苗期间共喷施3次，其中液体培养基诱导96h组的丹参幼苗在育苗基质中培养第7d的状态如图11所示，液体培养基诱导0h组的丹参幼苗在育苗基质中培养第7d的状态如图12所示；17天后将丹参幼苗移入室外炼苗10天，得到适合机械种植的直立型丹参苗。将炼苗后的液体培养基诱导96h、120h组的丹参苗与0h组的丹参苗进行对比，如图13所示。

从图13可以看出，不同诱导时间的丹参幼苗移栽后的生长状态存在差异，经液体培养基诱导培养96h(图左)和120h(图中)的丹参苗呈直立生长，不经液体培养基诱导的丹参苗(图右)呈倒伏生长。

将液体培养基诱导96h的丹参苗和液体培养基诱导0h的丹参苗根以上的部分取下，如图14和图15所示，可以看出，经液体培养基诱导培养96h的丹参苗较不经液体培养基诱导的丹参苗茎秆更为粗壮，叶节间距缩短，且经液体培养基诱导培养96h的丹参苗呈直立生长，不经液体培养基诱导的丹参苗弯曲生长。

实施例2

对实施例1得到的丹参苗的遗传性能进行验证。具体包括如下步骤：

将实施例1培育得到的丹参种植于由蛭石、椰糠、土按照1：2：2比例配制的育苗基质中，30天后待长出新的幼嫩叶片备用。以该幼嫩叶片为外植体进行组织培养，叶片剪切步骤、胚性愈伤组织诱导步骤同实施例1，之后直接按照如下步骤进行分化、增殖、生根培养。

按照MS+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L IBA+0.5mg/L维生素C的配方配制分化培养基，并在121℃下灭菌20min。在超净台内，用灭菌的镊子将愈伤组织块从胚性愈伤组织诱导培养基的培养瓶中夹出，愈伤组织块较大的，用刀片将其切开，使每块组织大小为0.5cm×0.5cm，接入分化培养基上，在光照3000Lux，24℃下，按照光照16h/黑暗8h进行分化培养21天，得到丹参分化苗。

按照MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA的配方配制增殖培养基，并在121℃下灭菌20min。将丹参分化苗接入增殖培养基中，在光照3000Lux，24℃下，按照光照16h/黑暗8h进行分化培养14天，得到丹参增殖苗。

按照MS+1.5mg/L IBA+0.05mg/L NAA的配方配制生根培养基，并在121℃下灭菌20min。将增殖形成的小苗用剪刀剪成一棵棵小苗，移至生根培养基，在光照3000Lux，24℃下培养20天。

当生根培养基中的小苗，根长至2厘米长、根数5条以上时进行开盖缓苗4天，此时根正在生长旺盛时成活率较高。缓苗4天后，将组培苗从组培瓶取出，用清水洗两遍后，再用多菌灵浸泡20min移栽入装有基质(蛭石、椰糠、土按照1：2：2)的穴盘中，在光照2000Lux，温度21℃，湿度40％的温室中培养成苗，其中组培苗在温室中培养第20d的小苗生长状态如图16所示。移入室外进行炼苗一周左右，使用栽苗机进行大田移栽，移栽后第3个月的丹参生长状态如图17所示。

从图17可以看出，移栽的丹参苗呈直立型，茎秆粗壮、叶节间短，生长旺盛，表明采用液体培养基诱导处理的普通白花丹参材料，可以筛选到适合机械化栽培的直立型材料，并通过组培快繁可以获得稳定的性状。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种适合机械种植的丹参组培苗的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将丹参叶片接入胚性愈伤组织诱导培养基，诱导胚性愈伤组织；

(2)将所述胚性愈伤组织接入液体培养基，进行诱导培养；

(3)将所述诱导培养后的胚性愈伤组织，去除残留的液体培养基，接入分化培养基，进行分化培养，得到丹参分化苗；

(4)将所述丹参分化苗接入增殖培养基，进行增殖培养，得到丹参增殖苗；

(5)将所述丹参增殖苗接入生根培养基，进行生根培养，筛选茎粗壮、叶节间短的生根苗作为丹参幼苗；

(6)所述丹参幼苗经炼苗后用于机械种植。

2.如权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基为MS+2.0～3.0mg/L 6-BA+0.8～1.2mg/L 2,4-D+0.3～0.6mg/L维生素C；所述诱导胚性愈伤组织的诱导条件为：先进行暗培养，再进行光照培养；所述暗培养的温度为22～26℃，时间为12～18天；所述光照培养的温度为22～26℃，时间为6～8天，光照强度为800～1200Lux。

3.如权利要求2所述的培育方法，其特征在于，所述液体培养基是将秋水仙氨磺乐灵溶液与1/2MS按照1：8～12的体积混合配制而成，所述秋水仙氨磺乐灵溶液中秋水仙的质量体积浓度为0.005～0.015％，所述秋水仙氨磺乐灵溶液中氨磺乐灵的质量体积浓度为0.005～0.015％；所述诱导培养在黑暗条件下进行，所述诱导培养的温度为15～20℃，时间为48～120h。

4.如权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述去除残留的液体培养基的方法为：将筛选的胚性愈伤组织接入1/2MS液体培养基，在24～25℃下暗培养20～28h。

5.如权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述分化培养基为MS+0.5～1.5mg/L 6-BA+0.3～0.6mg/L IBA+0.3～0.6mg/L维生素C；所述分化培养的温度为24～25℃，时间为10～15天，光照强度为2500～3500Lux。

6.如权利要求5所述的培育方法，其特征在于，所述增殖培养基为MS+0.25～0.5mg/L6-BA+0.05～0.15mg/L IBA；所述增殖培养的温度为24～25℃，时间为12～16天，光照强度为2500～3500Lux。

7.如权利要求6所述的培育方法，其特征在于，所述生根培养基为MS+0.5～2mg/LIBA+0.03～0.06mg/LNAA；所述生根培养的温度为24～25℃，时间为18～22天，光照强度为2500～3500Lux。

8.如权利要求7所述的培育方法，其特征在于，步骤(5)中所述筛选茎粗壮、叶节间短的生根苗，是筛选的茎粗为1.36～1.60mm，叶节间距为0.4～0.6mm的生根苗。

9.如权利要求8所述的培育方法，其特征在于，所述炼苗的方法为：将所述丹参幼苗移栽到育苗基质中，在11～24℃下缓苗15～20天，然后移入室外炼苗8～12天；所述育苗基质由蛭石、椰糠、土按照1～2：1～3：1～3比例配制得到。

10.如权利要求1～9任一项所述的培育方法，其特征在于，所述缓苗期间喷施叶面复合肥2～3次，每次间隔7～10天；所述叶面复合肥为15-15-15氮磷钾水溶性复合肥。

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