CN114946534A - 一种棘托竹荪液体菌种繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，该方法繁育的液体菌丝球生物量大，菌球活力强，接种点萌发快，分两个阶段液体摇瓶；一级液体菌种5天结束摇瓶培养后转接二级液体菌种培养基，二级液体菌种7天结束摇瓶，其中棘托竹荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝干重能达12g/L，同时产生的棘托竹荪液体菌种适宜作为工厂化发酵的液体种子，液体摇瓶培养基配方及培养参数能为棘托竹荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于食用菌良种繁育领域，一种棘托竹荪液体菌种繁育方法。
背景技术
竹荪隶属于鬼笔科竹荪属，是珍贵的食药两用的食用菌，被誉为“真菌皇后”。竹荪不仅口感鲜美，同时也是医学上的新秀。中医理论认为竹荪性寒，味甘，无毒，具有生津止渴，清肺化痰的作用。从现代药理学角度讲，竹荪富含有氨基酸，含有多糖、维生素，还有矿物质，它具有提高人体免疫力的作用，能够增强人体的体质。同时竹荪富含纤维能够润肠通便，使体内的胆固醇不易聚集，能有效降低胆固醇，减少腹部脂肪的聚集。药理学实验研究表明竹荪具有消炎、抑制癌细胞、降低血压和胆固醇及良好的防腐作用等功效。在发展健康大产业的背景下竹荪的营养价值和药用价值越来越受到关注，在食品、保健产品等领域竹荪多元化研发持续深入，民众对竹荪的需求日益增加，竹荪产业前景广阔。
常见并可栽培食用的竹荪有4种：长裙竹荪、短裙竹荪、棘托竹荪和红托竹荪。福建省以栽培棘托竹荪为主。近年来我省竹荪产业得到了突飞猛进的发展，棘托竹荪（以下简称竹荪）产量已占全国总产量的80%。闽北是我省竹荪主产区，栽培面积占全省竹荪栽培面积90%以上，邵武则是闽北的竹荪栽培大县、栽培面积稳定在1.3万亩，平均亩产180斤，种植竹荪已成为闽北农民脱贫致富的支柱产业。
菌种是竹荪栽培成败的关键所在，菌种质量的优劣决定着菇农的收益及产业的可持续性发展。在食用菌生产领域，由于资金、成本投入与收益性价比不高，大型企业不愿投入，竹荪菌种的生产更多是以分散的小作坊式的生产方式为主，生产设备简陋、工艺落后。虽然我省是食用菌的强省，在品种的选育领域已达到国际先进水平，拥有优良的竹荪高产品种，但由于受制于竹荪栽培菌种的生产方式，每年仍有大量不合格菌种流出，造成不出菇或大幅度的减产，给许多菇农带来重大的经济损失，导致优良品种难以推广、产业发展波动较大。目前，我国竹荪制种主要使用固体菌种作为原种生产竹荪栽培种（固体原种主要以木屑为主要原料）。以固体原种生产的栽培种，由于接种点单一，菌种萌发点单一，走菌时间较长，一般走满袋（规格140mm×280mm）需要100d-120d，造成菌种上下菌龄不一致。另外由于培养时间过长，增加了污染杂菌的概率，直接影响了栽培种的成品率。同时由于培养时间过长，常因隐形染菌不易发现而增加了栽培种稳定性的安全隐患。如何使竹荪制种保持稳定性，改进菌种生产方式，提高生产效率是竹荪乃至整个食用菌制种行业亟需解决的难题和研究热点。
当前国内外食用菌制种的发展趋势是朝固体菌种（生产用栽培种及部分原种）小颗粒化及扩繁菌种（母种及原种）液体化的方向发展，提高单位重量（体积）菌种的有效萌发面积，使得在菌种扩繁过程中相同的接种量有更多的萌发点，从而缩短制种时间，提高制种成品率。液体菌种指的是用液体培养基通过深层培养技术得到的食用菌菌种，目前国内外对其研究已经从尝试到逐步深入的阶段，并在金针菇、杏鲍菇等食用菌产业化生产中取得成功。与固体菌种比，液体菌种其特点如下：①菌种制作周期短液体菌种制作一般只需3-7天。而培养一瓶（袋）固体菌种，从接种到菌丝长满瓶一般需60d-120d天，最短的麦粒菌种也需30-45d。②菌种菌龄整齐一致。③菌种的成本低采用培养器生产的液体菌种产量高、原料便宜，生产简单成本较固体菌种要低。④接种方便呈现流动状态的液体菌种便于接种工艺的机械化、自动化，有利于工作效率的提高。可将培养好的液体菌种在一定气压下，经过接种管进入全自动接种平台内。液体菌种制作除用小型培养器外，还可用大型发酵罐进行多级深层发酵培养，使食用菌菌种制作向工厂化、机械化和自动化方向发展。
福建省邵武市绿农食用菌有限公司长期致力于竹荪菌种生产和技术服务。经过多年来与福建省农业科学院食用菌研究所合作共同研发竹荪液体菌种配方及工艺，实现了竹荪液体菌种技术突破，并建立一条年产500万包的竹荪液体菌种生产线，进一步的优化完善竹荪菌种生产设施，促进竹荪菌种生产方式的更新换代，有效地防范和控制菌种生产风险，保障良种繁育的安全性。竹荪液体菌种技术成果的实施落地和推广应用不仅能为企业创造收益，推动竹荪产业的绿色健康发展。
发明内容
本发明基于微生物液体深层发酵技术，提供一种棘托竹荪液体菌种繁育方法。
本发明的一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，是通过两个阶段的液体摇瓶培养，快速地繁育棘托竹荪的液体菌丝球，达到下一步液体菌种工厂化所要求的摇瓶原种的生物量和活力。
本发明是这样实现的，包含以下步骤：
1）一级液体培养基的配制：按葡萄糖10~20g/L、酵母粉1~2g/L、玉米淀粉6~12g/L、磷酸二氢钾3~5g/L、硫酸镁0.5g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，定容后按50~80ml的装液量分装于体积为250ml的三角瓶中，用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌（121°C、20min）。
2）棘托竹荪一级液体菌种的制备：在无菌条件下，用接种针（接种钯）挑取长满且吃透料的、蚕豆大小的母种5粒转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后置于摇床，在25°C、150r/min条件下暗培养5d，完成一级液体菌种的摇瓶培养。
3）二级液体培养基的配制：按照葡萄糖10~20g/L、酵母粉2~5g/L、玉米淀粉8~15g/L、磷酸二氢钾3~5g/L、硫酸镁0.5g/L、羧甲基纤维素钠5~15g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，各成分充分溶解后，按300~400ml的量定容分装于体积为1000ml的三角瓶中，用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌（121°C、20min）。
4）棘托竹荪二级液体菌种的制备：在无菌条件下，用无菌的5ml枪头吸取一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1:25~35），完成接种后置于摇床，在25°C、150r/min条件下暗培养7d，即完成二级液体菌种的制备。
本发明的优点在于：通过本发明的方法用于棘托竹荪液体摇瓶菌种的制作，经过12天的培养能获得适用于下一步液体菌种工厂化所要求的摇瓶菌种生物量和活力的液体种子。该方法与现有的繁育方法相比，具有耗时短，操作简便等优点。根据现有公开的文献资料和食用菌行业的现状，目前尚无棘托竹荪利用深层发酵技术进行大规模的菌种生产和相关的配套栽培，主要原因是棘托竹荪液体培养配方和工艺尚未摸清和稳定，菌种技术尚未建立。本发明通过二阶段培养法进行棘托竹荪液体摇瓶菌种的制作，通过配方和培养方式的优化，可在12天内获得满足进一步大型发酵罐深层培养的液体种子，为缩短棘托竹荪菌种生产周期，提升生产效率，促进竹荪菌种生产工艺升级换代奠定基础。
附图说明
图1为经过两个阶段培养后的棘托竹荪二级液体菌种；
图2为100倍显微镜下的菌丝球。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实施例1
2021年6月，在福建省农业科学院食用菌研究所进行棘托竹荪的液体摇瓶培养，具体步骤如下：
1）2021年6月中旬进行一级液体培养基制做：按葡萄糖15g/L、酵母粉2g/L、玉米淀粉8g/L、磷酸二氢钾3g/L、硫酸镁0.5g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，定容后按100ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌（121°C、20min）。冷却后备用。
2）2021年6月19日进行棘托竹荪一级液体菌种制备：75%酒精表面消毒培养好的棘托竹荪试管母种，然后置于超净工作台中；无菌条件下用接种针（接种钯）挑取蚕豆大小的母种5粒转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后上摇床暗培养（25°C、150r/min）。接种点1天后萌动，6月24日结束一级液体菌种的摇瓶培养。
3）2021年6月22日进行二级液体培养基制做：按照葡萄糖20g/L、酵母粉3g/L、玉米淀粉10g/L、磷酸二氢钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、羧甲基纤维素钠8g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，各成分充分溶解后，按400ml的量定容分装于三角瓶中（体积1000ml），用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌（121°C、20min）。冷却后备用。
4）2021年6月24日结束一级液体菌种的摇瓶培养后进入棘托竹荪二级液体菌种制备：用装有75%酒精的喷壶充分喷施培养好的棘托竹荪一级液体菌种、二级液体摇瓶培养基后，置于超净工作台灭菌；用无菌的5ml枪头吸取一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1:35），完成接种后上摇床暗培养（25°C、150r/min）, 培养7天即完成二级液体菌种的制作。7月1日结束二级液体菌种的摇瓶培养（如下图1所示），菌丝球细小圆满（直径约0.1mm~0.3mm），显微镜观察菌球表面含有大量菌丝突刺（如下图2所示），菌丝球静置15分钟液面不分层。二级液体菌种培养过程为7天。两级摇瓶培养周期共12天。
5）2021年7月中旬进行棘托竹荪二级液体菌种的验证，包括菌种活力、一致性鉴定和菌丝生物量等。将发酵好的棘托竹荪二级液体菌种接种到PDA培养基中25 °C培养，同时提取菌丝球的DNA进行cDNA-ITS的扩增与GenBank比对鉴定；另外抽滤二级液体菌种后，55°C 干燥、利用恒重法测定菌丝生物量。结果表明：二级液体菌种转接到PDA培养基中，1天后开始萌发、半个月后菌丝走满PDA试管，活力强劲；同时GenBank中的cDNA-ITS比对的鉴定也为棘托竹荪生物种；55°C恒重干燥法得到棘托竹荪二级液体菌种菌丝球生物量为12g/L。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，其特征在于：通过两个阶段的液体摇瓶培养，快速地繁育棘托竹荪的液体菌丝球，具体包含以下步骤：
1）一级液体培养基的配制：按葡萄糖10~20g/L、酵母粉1~2g/L、玉米淀粉6~12g/L、磷酸二氢钾3~5g/L、硫酸镁0.5g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，定容后按50~80ml的装液量分装于体积为250ml的三角瓶中，用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌；
2）棘托竹荪一级液体菌种的制备：在无菌条件下，用接种针挑取长满且吃透料的、蚕豆大小的母种5粒转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后置于摇床，在25°C、150r/min条件下暗培养5d，完成一级液体菌种的摇瓶培养；
3）二级液体培养基的配制：按照葡萄糖10~20g/L、酵母粉2~5g/L、玉米淀粉8~15g/L、磷酸二氢钾3~5g/L、硫酸镁0.5g/L、羧甲基纤维素钠5~15g/L的配制比例准确称取上述物质溶于自来水中，各成分充分溶解后，按300~400ml的量定容分装于体积为1000ml的三角瓶中，用透气硅胶塞封口并用报纸包头后进行高压灭菌；
4）棘托竹荪二级液体菌种的制备：在无菌条件下，用无菌的5ml枪头吸取一级液体菌种转入二级液体培养基中培养，完成接种后置于摇床，在25°C、150r/min条件下暗培养7d，即完成二级液体菌种的制备。
2.根据权利要求1所述的一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，其特征在于：步骤1）中高压灭菌的温度为121°C、时间为20min。
3.根据权利要求1所述的一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，其特征在于：步骤3）中高压灭菌的温度为121°C、时间为20min。
4.根据权利要求1所述的一种棘托竹荪液体菌种繁育方法，其特征在于：步骤4）中一级液体菌种转入二级液体培养基中的接种量体积比为1:25~35。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 福建省平潭县科技情报研究所资料室: "短平快致富技术200例", vol. 1, 四川科学技术出版社, pages: 415 - 416 * |
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