CN114940669B - 单组分nir-ii区比率荧光纳米探针、制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单组分NIR‑II区比率荧光纳米探针、制备方法及产品，其中纳米探针，包括递送载体以及形成于递送载体上的荧光响应单元，过氧化氢响应的荧光响应单元的结构式为：本发明的荧光探针通过优化设计仅含有一种荧光团，其制备工艺简单、结构明确、生物相容性好，可以利用NIR‑II双通道荧光检测，实现疾病的精准可靠检测。
Description
技术领域
本发明是关于生物荧光分析技术，特别是关于一种单组分NIR-II区比率荧光纳米探针、制备方法及产品。
背景技术
实时可靠的可视化活体检测技术在疾病诊断、术中导航和预后评估等领域具有重大的应用需求。与磁共振成像(MRI)、超声成像、CT成像、PET成像等成像技术相比，荧光成像具有高灵敏、低成本、实时性好、兼容性好等优点，可直观地对生物动态过程进行原位无创检测。尤其是近红外二区(NIR-II，1000-1700nm)荧光成像，可以避免光在可见及近红外一区(NIR-I，600-900nm)的吸收散射以及生物自发荧光干扰，并实现更深的成像组织穿透深度、更高的分辨率和保真度，受到了越来越多的关注。但是基于绝对荧光强度的检测会受到一些非分析因素的影响，如探针浓度的局部波动、仪器参数设定差异或组织异质性带来的光散射变化等，从而导致检测结果不准确。而比率荧光检测通过在检测体系中集成参比荧光信号以及响应荧光信号，进行荧光成像的自校正，可以在复杂生物体系中实现精准可靠的比率荧光检测。目前已有多种NIR-II比率荧光探针被开发应用于疾病的精准可视化检测。
传统的NIR-II比率荧光纳米探针通常包含两种或两种以上荧光团，如稀土掺杂纳米粒子(RENPs)和有机染料、量子点和有机探针、多种有机染料等。但是这些NIR-II比率荧光探针体系往往需要复杂的设计和合成过程，且制备过程中很难保证精确的化学计量比调控，因而有可能会导致错误的信号读出，不利于临床转化应用。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单组分NIR-II区比率荧光纳米探针、制备方法及产品，通过提供过氧化氢响应的罗丹明类荧光单元(标记为LC-1250)，相比于现有的NIR-II比率荧光探针体系，其设计简单、结构明确且生物相容性好和生物安全性，响应信号好，效率高，具备良好的临床应用潜力。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，包括递送载体以及形成于递送载体上的荧光响应单元(LC-1250)，荧光响应单元为过氧化氢响应的，荧光响应单元的结构式为：
在本发明的一个或多个实施方式中，荧光单元在递送载体上的负载质量比为：1：(1-1000)。优选的，负载质量比为1：(50-200)。
在本发明的一个或多个实施方式中，递送载体至少选自白蛋白、聚乳酸、F127、聚多肽、聚己内酯、聚乙二醇化脂质(如甲氧基磷脂聚乙二醇等)、外泌体、细胞外囊泡、脂质体、病毒载体、多孔硅。
在本发明的一个或多个实施方式中，单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：准备过氧化氢响应的荧光响应单元和递送载体；将荧光响应单元负载到递送载体。
在本发明的一个或多个实施方式中，负载为适量的荧光响应单元和递送载体共溶于溶剂中充分搅拌、溶解得到反应液，将反应液滴加到去离子水中并剧烈搅拌，至少进行一次过滤分离得到过滤液，浓缩(优选为超滤)过滤液即可。优选的，剧烈搅拌为(300-6000)r/min下，搅拌(2-6)小时。
在本发明的一个或多个实施方式中，溶剂至少选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜(DMSO)。
在本发明的一个或多个实施方式中，递送载体在反应液中的浓度为(1-100)mg/mL，去离子水的用量为所述反应液的5-50倍体积倍量。
在本发明的一个或多个实施方式中，负载为由递送载体包覆荧光响应单元。
在本发明的一个或多个实施方式中，荧光探针产品，包括如权利要求1-3任一单组分NIR-II区比率荧光纳米探针。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针、制备方法及产品，通过优化有机荧光探针结构，体内代谢过程明确且具有优异的生物相容性，有较高的临床转化和推广性，对于实现精准、可靠的生物活体检测具有重大意义。
本发明实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，对过氧化氢有着特异性响应，并且在响应后，探针在1250nm长通滤光片下获得的荧光信号保持不变，可以作为参比信号，与此同时，探针在1150nm短通通道所获得荧光信号显著增强，可作为响应信号，基于此，可用于构建单组分近红外二区比率荧光纳米探针。该单组分的近红外二区比率荧光探针可以通过静脉注射或口服的方式对小鼠肝损伤或肠炎进行精准可靠检测，其在疾病早期精准诊断以及术中荧光导航等领域具有巨大应用前景。
相比于荧光成像，本发明实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的NIR-II区比率荧光成像可以通过自校正，避免非分析物因素的影响，能够在复杂体系中实现精准可靠的荧光检测，并且能够做到高的穿透深度、分辨率和保真度。
此外还可以通过口服或静脉给药，实现对多种疾病的原位、实时、高灵敏和可靠精准检测，应用便利，安全性好，在疾病诊断及术中导航等领域具有重大应用前景。
附图说明
图1为本发明一实施方式的一种单组分NIR-II区比率荧光纳米探针稳定性测试。其中A图为荧光响应单元单独使用时，荧光随时间的变化谱图，B图为经递送载体包裹后纳米探针的荧光随时间的变化谱图。
图2为本发明一实施方式的一种单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对过氧化氢的检测机理。其中包括在检测过程中，荧光纳米探针所包含染料的分子转变过程及荧光光谱变化等；
图3为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对不同浓度过氧化氢响应时的光谱变化；
图4为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对不同分析物的荧光响应光谱变化情况；
图5为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针在细胞层面的比率荧光检测性能，细胞内源性过氧化氢是通过加入阳性刺激物诱导细胞产生；
图6为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对小鼠肝损伤过程中过氧化氢的变化过程的检测。其中A图为正常小鼠双通道荧光和比率荧光成像，B图为肝损伤小鼠双通道荧光和比率荧光成像，C图为损伤的肝组织的双通道荧光和比率荧光成像；
图7为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对肠炎小鼠的NIR-II比率荧光检测。其中A图为正常小鼠的双通道荧光和比率荧光成像，B图为肠炎小鼠双通道荧光和比率荧光成像，C图为离体肠道的双通道荧光和比率荧光成像，D图为C图肠道荧光和比率荧光强度的定量曲线
图8为本发明一实施方式的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针在1150nm短通通道和1250nm长通通道的荧光强度随时间变化谱图。A图为1150nm短通荧光强度随时间变化的谱图，B图1250nm长通荧光强度随时间变化的谱图，C图为荧光比率强度随时间变化的谱图；
图9为本发明对比例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针荧光谱变化情况。A图为新制备的纳米探针的荧光光谱，B图为放置12小时后，该纳米探针的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施方式，对本发明技术方案进行示例性的详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的组成选择，而并未排除为未穷尽罗列部分。
本发明单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备可以为：将荧光响应单元LC-1250和递送载体溶于溶剂中，并继续搅拌0.5-1小时，充分溶解。之后将上述反应液滴加入5-50倍体积的去离子水中，并继续剧烈搅拌2-6小时后过滤、浓缩(过滤优选为超滤，可以选择30KD或100KD的超滤管等，下同)。浓缩后的溶液继续加入去离子水，充分分散后继续过滤、浓缩，反复3-5次，得到单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，记为LC-1250NPs：其中分子探针LC-1250和递送载体的质量比为1：(1-1000)。应用时，以荧光纳米探针制剂为例，荧光纳米探针的浓度可以为：以LC-1250计，0.01-0.1μM。
本发明制备的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs相较于单独应用的荧光响应单元(LC-1250)，稳定性显著提高，如图1所示。
本发明制备的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs在未加入过氧化氢时，其最大发射峰在1250nm左右；加入过氧化氢后，其在1050nm左右出现新的强烈的荧光发射峰，且在1250nm长通滤光片(1250LP)下获得的荧光信号保持不变；通过在1150短通滤光片(1150SP)的响应荧光信号与1250LP参比信号比较，可以实现在NIR-II区对过氧化氢进行比率荧光检测，其过程如图2所示。
实施例1
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和250.0mg甲氧基磷脂聚乙二醇溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌1小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入100mL的去离子水中，并继续搅拌2小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为3000r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例2
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和5.0mg甲氧基磷脂聚乙二醇溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌0.5小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入50mL的去离子水中，并继续搅拌4小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为4500r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例3
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和1000.0mg甲氧基磷脂聚乙二醇溶入10mL丙酮溶液，之后继续搅拌0.75小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入80mL的去离子水中，并继续搅拌6小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为6000r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例4
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和5000.0mg F127溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌0.6小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入60mL的去离子水中，并继续搅拌3小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用100KD超滤管超滤浓缩，其中转速为4000r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例5
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和500.0mg聚乳酸溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌0.7小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入70mL的去离子水中，并继续搅拌5小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用100KD超滤管超滤浓缩，其中转速为5000r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例6
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和750.0mg白蛋白溶入10mL乙腈溶液，之后继续搅拌0.8小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入90mL的去离子水中，并继续搅拌4小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用100KD超滤管超滤浓缩，其中转速为5500r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例7
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和150.0mg质量比1:1的F127和甲氧基磷脂聚乙二醇共同溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌0.9小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入55mL的去离子水中，并继续搅拌4.5小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为4500r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
实施例8
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和150.0mg白蛋白载体溶于10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌(0.5-1)小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入50mL的去离子水中，并继续搅拌5.5小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为4500r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs，用水稀释，配置成浓度为20μM的储备液。之后加入适量过氧化氢，配制过氧化氢最终浓度为0，25，50，100μM，且LC-1250NPs最终浓度为10μM的测试溶液。在加入过氧化氢过程中，同时实时对探针进行双通道的NIR-II区荧光成像，根据成像结果获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs的荧光强度在加入过氧化氢后随时间的变化谱图，如图8所示。
实施例9
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250和200.0mg质量比1:2:3的聚乳酸、F127、聚多肽三种递送载体混合物溶入10mL二甲亚砜(DMSO)溶液，之后继续搅拌(0.5-1)小时，以保证荧光单元和递送载体充分混合；
将上述溶液缓慢滴入85mL的去离子水中，并继续搅拌5.5小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能负载到递送载体上，形成均一纳米粒子；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为4000r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
包括而不限于上述实施例中，以实施例1为例，荧光纳米探针的性能均满足：
(1)对过氧化氢的特异性检测：
取实施例1制备的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs，用水稀释，配置成浓度为20μM的储备液。之后加入适量过氧化氢，配制过氧化氢最终浓度为0，1，2，5，10，15，20，30，40，50，75，100μM，且LC-1250NPs最终浓度为10μM的测试溶液。孵育(0.5-6)小时后，测试溶液的光谱，如图3所示。
取实施例1制备的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs，用水稀释，配置成浓度为20μM的储备液。之后分别加入各种分析物，保证LC-1250NPs最终浓度为10μM。孵育(0.5-6)小时后，测试溶液的光谱，如图4所示。
本发明中，单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对过氧化氢表现出特异响应性，可以实现对过氧化氢的定量超敏检测。
(2)在细胞水平上对过氧化氢的NIR-II区比率荧光检测：
细胞在六孔板中孵育24小时，以便细胞充分贴壁。之后去除培养基，并更换含有LC-1250NPs的新鲜培养基，继续孵育3小时。利用PBS洗去培养基中残留的纳米探针后，分别加入PBS以及含有活性氧诱导试剂的PBS，继续培养30min后进行NIR-II荧光成像观察。
利用NIR-II区荧光显微镜进行观察成像，其中使用1150nm短通滤光片收集响应通道荧光信号(1150SP)，利用1250nm长通滤光片收集参比通道荧光信号(1250LP)。并通过对两通道荧光信号进行处理，获得NIR-II区比率荧光图像，如图5所示。
(3)对小鼠肝损伤检测：
将麻醉的肝损伤小鼠尾静脉注射探针(2.5mg/kg)，之后利用808nm激光器照射小鼠，实时观测小鼠的荧光变化。分别搜集1150SP通道和1250LP通道的荧光图像。
注射探针2小时后，处死小鼠，并取离体肝组织，分别搜集1150SP通道和1250LP通道的荧光图像，如图6所示。
(4)对小鼠肠炎检测：
小鼠禁食24小时后，灌胃纳米探针，之后进行麻醉，并进行小鼠荧光成像。其中激发光为808nm激光器，分别收集1150SP通道和1250LP通道的荧光图像。
6小时后，处死小鼠，并取其离体的肠道，进行双通道荧光成像，分别为1150SP通道和1250LP通道的荧光图像，如图7所示。
本发明中，单组分NIR-II区比率荧光纳米探针对过氧化氢表现出快速响应性，可以实现对过氧化氢的快速实时检测。
其他递送载体，如吐温80等，尽管也可以形成均一纳米粒子，但其荧光稳定性显著降低。
对比例
本对比例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其制备步骤如下：
取5.0mg NIR-II区罗丹明类荧光单元LC-1250溶于10mL丙酮溶液，并超声使之完全溶解；
将上述溶液缓慢滴入50mL的含有150mg吐温80的去离子水中，并继续搅拌2小时，以使荧光单元LC-1250被尽可能分散于递送载体上，形成均一溶液；
取上述溶液，使用30KD超滤管超滤浓缩，其中转速为3500r/min；之后往浓缩体系中继续加入去离子水充分混匀，再次超滤浓缩，此过程执行3-5次，以除去体系中的有机溶剂，进而获得单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs。
本实施例的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针LC-1250NPs，荧光稳定性较差：新制备的纳米探针，在放置12小时后，探针原有的在1250nm处的荧光发射峰全部转变为1050nm左右，表明该探针发生变质(图9)。较短的保质期不利于产品的临床应用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，包括递送载体以及形成于递送载体上的荧光响应单元，所述递送载体为甲氧基磷脂聚乙二醇，过氧化氢响应的所述荧光响应单元的结构式为：
；
所述单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
准备荧光响应单元和递送载体；
将所述荧光响应单元负载到所述递送载体，所述负载为由所述递送载体包覆所述荧光响应单元。
2.如权利要求1所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针，其特征在于，所述荧光响应单元在所述递送载体上的负载质量比为1：1-1000。
3.如权利要求1或2所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
准备荧光响应单元和递送载体；
将所述荧光响应单元负载到所述递送载体。
4.如权利要求3所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述负载为适量的所述荧光响应单元和所述递送载体共溶于溶剂中充分搅拌、溶解得到反应液，将所述反应液滴加到去离子水中并剧烈搅拌，至少进行一次过滤分离得到过滤液，浓缩所述过滤液即可。
5. 如权利要求4所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂至少选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、N, N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜。
6.如权利要求4所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述递送载体在反应液中的浓度为1-100mg/mL，去离子水的用量为所述反应液的5-50倍体积倍量。
7.如权利要求4所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述剧烈搅拌为300-6000r/min下，搅拌2-6小时。
8.如权利要求3所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，所述负载为由所述递送载体包覆所述荧光响应单元。
9.荧光探针产品，包括如权利要求1-2任一所述的单组分NIR-II区比率荧光纳米探针。
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