CN114929252B

CN114929252B - 抗微生物精油组合物、包含其的制品及制品的制备方法

Info

Publication number: CN114929252B
Application number: CN202280000139.9A
Authority: CN
Inventors: 贾振华
Original assignee: Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2022-02-07
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2042-02-07
Also published as: WO2022068977A3; CN114929252A; ZA202308381B; WO2022068977A2

Abstract

公开了一种抗微生物精油组合物，包含：香芹酚；百里香酚；选自柠檬油、甜橙油、玳玳果皮油、白柠檬油和柚皮油中的一种或多种；选自亚洲薄荷素油、亚洲薄荷油、椒样薄荷油和胡薄荷油中的一种或多种；选自月桂叶油和甘牛至油中的一种或多种；选自广藿香油、檀香油和迷迭香油中的一种或多种；选自天竺葵油、松针油和柏木油中的一种或多种；和任选地选自紫苏油、杭白菊油和牡荆叶油中的一种或多种。还公开了包含抗微生物精油组合物的制品和包含抗微生物精油组合物的制品的制备方法。

Description

抗微生物精油组合物、包含其的制品及制品的制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年04月30日提交的题为“抗微生物精油组合物、包含其的产品及其制备方法”的中国发明专利申请第202110482092.1号以及于2022年01月19日提交的题为“抗微生物精油组合物、包含其的产品及其制备方法”的中国发明专利申请第202210059971.8号的优先权，上述申请通过引用在此全文并入。

技术领域

本申请大体上涉及一种精油组合物，更具体而言，涉及具有抗微生物功能的植物精油组合物。本申请还涉及包含抗微生物精油组合物的制品和包含抗微生物精油组合物的制品的制备方法。

背景技术

很多高致病性微生物病原体引起迅速发作和蔓延的传染病。这样的传染病甚至能在短时间内跨越数省、数国乃至在全世界范围内流行，即，迅速发展为“大流行(pandemic)”。例如，2019年底开始爆发的2019冠状病毒病(COVID-19，也称“新冠病毒肺炎”)已被世卫组织认定为符合“大流行”的特征。

大流行期间，消杀是疫情防控的一项重要工作。目前，世界范围内通常使用合成化学品类消杀产品(如乙醇、过氧乙酸、含氯消毒剂、酚类消毒剂等)、紫外线、热等来灭活致病性微生物。例如，酚类消毒剂曾经是医院的主要消毒剂之一，为预防和控制传染性疾病的传播起过重要作用。在高浓度下，酚类可裂解并穿透细胞壁，使菌体蛋白凝集沉淀，快速杀灭细胞；在低浓度下，可使细菌的酶系统失去活性，导致细胞死亡。但是，此类消杀措施存在应用不便，使用受限，或对人体、环境易于造成二次危害污染的风险。

基于天然植物的精油产品传统上用于治疗传染病和疫情防控已有数千年历史。特别是酚类精油，具有优异的抗菌效果。但该类别精油也因其具有毒性，并会对皮肤与黏膜组织产生刺激，在实际应用中要求慎用。其他部分植物精油的抗微生物活性也已被许多研究证实。此类植物精油产品，在灭活致病性微生物的同时，对人体无害，对环境友好，符合绿色环保、可持续发展趋势。

因此，需要提供具有抗微生物活性的植物精油类产品。

我们意外地发现，通过使用多种单方精油的组合，配合特定的抗微生物活性成分，能够得到具有良好的抗微生物性能并且对人体无害和对环境友好的消杀产品。

发明内容

为解决以上问题，在本申请的实施方式中提供了一种抗微生物精油组合物，其中，该精油组合物的组分均来自于天然植物，这些组分的组合使得所形成的精油组合物具有良好的抗微生物性能。

本申请至少一实施方式提供了一种抗微生物精油组合物，基于组合物的总重，所述微生物精油组合物包含：(1)0.0001-80％的选自香芹酚和百里香酚中的一种或多种；(2)0.0001-99.9％的选自柠檬油、甜橙油、玳玳果皮油、白柠檬油和柚皮油中的一种或多种；(3)0.0001-99.9％的选自亚洲薄荷素油、亚洲薄荷油、椒样薄荷油和胡薄荷油中的一种或多种；(4)0.0001-20％的选自月桂叶油和甘牛至油中的一种或多种；(5)0.0001-20％的选自广藿香油、檀香油和迷迭香油中的一种或多种；(6)0.0001-20％的选自天竺葵油、松针油和柏木油中的一种或多种；和(7)任选地，0.0001-20％的选自紫苏油、杭白菊油和牡荆叶油中的一种或多种。

在一个方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)2-80％的选自香芹酚和百里香酚中的一种或多种；(2)2-50％的选自柠檬油、甜橙油、玳玳果皮油、白柠檬油和柚皮油中的一种或多种；(3)5-40％的选自亚洲薄荷素油、亚洲薄荷油、椒样薄荷油和胡薄荷油中的一种或多种；(4)2-20％的选自月桂叶油和甘牛至油中的一种或多种；(5)0.1-5％的选自广藿香油、檀香油和迷迭香油中的一种或多种；(6)2-20％的选自天竺葵油、松针油和柏木油中的一种或多种；和(7)任选地，2-15％的选自紫苏油、杭白菊油和牡荆叶油中的一种或多种。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物还任选地包含选自下组的一种或多种：(8)0.0001-20％的金银花油；(9)0.0001-20％的川芎油；(10)0.0001-20％的苍耳子油；和(11)0.0001-20％的连翘油。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)5％的香芹酚和5％的百里香酚；(2)35％的柠檬油；(3)30％的亚洲薄荷素油；(4)10％的月桂叶油；(5)0.5％的广藿香油；(6)5％的天竺葵油；和(7)9.5％的紫苏油。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)0.005％的香芹酚和0.005％的百里香酚；(2)0.1％的柠檬油；(3)99.58％的亚洲薄荷素油；(4)0.005％的月桂叶油；(5)0.25％的广藿香油；(6)0.005％的天竺葵油；和(7)0.05％的紫苏油。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)0.005％的香芹酚和0.005％的百里香酚；(2)99.5％的柠檬油；(3)0.25％的亚洲薄荷素油；(4)0.005％的月桂叶油；(5)0.18％的广藿香油；(6)0.005％的天竺葵油；和(7)0.05％的紫苏油。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)51.25％的香芹酚；(2)26.25％的百里香酚；(3)8.75％的柠檬油；(4)7.5％的亚洲薄荷素油；(5)2.5％的月桂叶油；(6)0.125％的广藿香油；(7)1.25％的天竺葵油；和(8)2.375％的紫苏油。

在另一方面，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：(1)25％的香芹酚和25％的百里香酚；(2)2％的柠檬油；(3)10％的亚洲薄荷素油；(4)20％的月桂叶油；(5)0.5％的广藿香油；(6)2％的天竺葵油；(7)5％的金银花油；(9)4％的川芎油；(10)0.3％的苍耳子油；和(11)0.2％的连翘油。

在又一方面，所述微生物选自细菌、真菌、病毒、支原体及其组合。

在又一方面，所述微生物为新冠病毒、流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒中的一种或多种。

在又一方面，所述微生物为新冠病毒。

在又一方面，所述微生物为肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、白色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或多种。

在又一方面，所述微生物为肺炎支原体。

本申请至少一实施方式还提供了一种包含抗微生物精油组合物的制品。

在一个方面，所述制品包括能够在硬表面、纺织品、皮肤、粘膜或毛发中的一种或多种上减少或杀灭微生物的制品。

在另一方面，所述制品为选自口罩爆珠、卫生湿巾、空气清新剂、口腔喷雾、洗手液、洗发水、护发素、沐浴液、化妆品、护肤品、空气凝胶、抑菌喷雾、表面清洁剂和洗涤剂中的一种或多种。

在另一方面，所述制品为防护用品。

在另一方面，所述制品为选自民用口罩、医用口罩、防护手套、防护衣中的一种或多种。

在另一方面，所述制品为爆珠口罩。

在另一方面，所述制品为食品或保健品。

在另一方面，所述制品为选自口香糖、香口丸、爆珠、凝胶糖果、硬糖、饮料、膳食补充剂中的一种或多种。

本申请至少一实施方式还提供了一种制备包含抗微生物精油组合物的制品的方法，包括：将所述抗微生物精油组合物的所有成分均匀混合，制成精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠，将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠与所述制品的其他组分组合，得到所述制品。

在一个方面，所述制品为民用口罩或医用口罩，所述将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠与所述制品的其他组分组合包括将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠添加到所述民用口罩或所述医用口罩中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本公开的一些实施例，而非对本公开的限制。

图1示出了根据本申请至少一实施方式的各种复方精油对H1N1、H3N、FluB、hRHV、RSV的抑制率比较；

图2示出了根据本申请至少一实施方式的各种复方精油对多种革兰氏阳性细菌的最小抑菌浓度；

图3示出了根据本申请至少一实施方式的各种复方精油对多种革兰氏阴性细菌的最小抑菌浓度。

具体实施方式

为了下面的详细描述的目的，应当理解，本申请可采用各种替代的变化和步骤顺序，除非明确规定相反。此外，除了在任何操作示例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本申请所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。

尽管阐述本申请的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体示例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。

此外，应当理解，本文所述的任何数值范围旨在包括归入其中的所有子范围。例如，“1至10”的范围旨在包括介于(并包括)所述最小值1和所述最大值10之间的所有子范围，即具有等于或大于1的最小值和等于或小于10的最大值。

在本申请中，除非另有明确说明，单数的使用包括复数且复数包含单数。此外，在本申请中，除非另有明确说明，否则使用“或”表示“和/或”，即使在某些情况下可明确地使用“和/或”。此外，在本申请中，除非另有明确说明，否则使用“一(a)”或“一(an)”表示“至少一”。例如，“一种”聚合物，“一种”组合物等指这些物品中的任何的一种或多种。

在本申请的一个实施方式中，提供了一种抗微生物精油组合物。如本文中所用的，术语“抗微生物”是指所用的产品具有减少/杀灭微生物的活性。在本申请的上下文中，“微生物”可以包括细菌、真菌、病毒、支原体等，例如但不限于，冠状病毒(例如，SARS-CoV(非典病毒)、MERS-CoV(中东呼吸综合征病毒)、SARS-CoV-2(新冠病毒)等)、肝炎病毒(如甲型、乙型、丙型肝炎病毒)、流感病毒(如甲型、乙型流感病毒和禽流感病毒等)、金黄色葡萄球菌、肺炎杆菌、伤寒菌、念珠菌、霉菌、肺炎支原体等。在一个优选方面，本申请的上下文中的病毒可为新冠病毒。

如本文中所用的，术语“植物精油”是指从天然香料植物中加工提取所得到的挥发性含香物质的总称。通常，植物精油是从植物的花、叶、根、种子、果实、树皮、树脂、木心等部位通过水蒸气蒸馏法、冷压榨法、脂吸法或溶剂萃取法提炼萃取的挥发性芳香物质。植物精油往往具有特定的生物活性，尤其是，有些植物精油具有良好的抗微生物活性，如抗菌、抗真菌和/或抗病毒活性，可以作为有效的环保型抗微生物剂。植物精油可分为单方和复方精油。其中，与单方精油相比，复方精油中包含多种有效的精油成分，通过各成分的协同作用，能够实现显著更好的生物学活性，如抗微生物活性。在本申请中优选使用复方精油。

本申请至少一实施方式提供了一种抗微生物精油组合物，包含：

(1)选自香芹酚和百里香酚中的一种或多种，其量可以为0.0001-99.99％，优选2-80％，更优选2-60％，进一步优选6-16％；

(2)选自柠檬油、甜橙油、玳玳果皮油、白柠檬油和柚皮油中的一种或多种，其量可以为0.0001-99.99％，优选2-80％，更优选2-50％，更优选10-50％，进一步优选32-38％；

(3)选自亚洲薄荷素油、亚洲薄荷油、椒样薄荷油和胡薄荷油中的一种或多种，其量可以为0.0001-99.99％，优选2-80％，更优选5-40％，进一步优选28-35％；

(4)选自月桂叶油和甘牛至油中的一种或多种，其量可以为0.0001-20％，优选2-20％，更优选2-18％，更优选2-15％，进一步优选8-12％；

(5)选自广藿香油、檀香油和迷迭香油中的一种或多种，其量可以为0.0001-20％，优选0.1-18％，更优选0.1-5％，进一步优选0.3-1％；

(6)选自天竺葵油、松针油和柏木油中的一种或多种，其量可以为0.0001-20％，优选2-20％，更优选2-18％，进一步优选3-8％，

以上百分比基于组合物的总重。

在一个方面，抗病毒精油组合物还可以任选地包含(7)选自紫苏油、杭白菊油和牡荆叶油中的一种或多种，其量可以为0.0001-20％，优选2-18％，更优选2-15％，进一步优选8-12％，以上百分比基于组合物的总重。

在另一方面，抗病毒精油组合物还可以任选地包含选自(8)0.0001-20％的金银花油；(9)0.0001-20％的川芎油；(10)0.0001-20％的苍耳子油；和(11)0.0001-20％的连翘油中的一种或多种，以上百分比基于组合物的总重。

例如但不限于，本申请所述的抗微生物精油组合物的一个优选示例可以包含：(1)5％的香芹酚和5％的百里香酚；(2)35％的柠檬油；(3)30％的亚洲薄荷素油；(4)10％的月桂叶油；(5)0.5％的广藿香油；(6)5％的天竺葵油；和(7)9.5％的紫苏油，以上百分比基于组合物的总重。

例如但不限于，本申请所述的抗微生物精油组合物的另一个优选示例可以包含：(1)0.005％的香芹酚和0.005％的百里香酚；(2)0.1％的柠檬油；(3)99.58％的亚洲薄荷素油；(4)0.005％的月桂叶油；(5)0.25％的广藿香油；(6)0.005％的天竺葵油；和(7)0.05％的紫苏油，以上百分比基于组合物的总重。

例如但不限于，本申请所述的抗微生物精油组合物的又一个优选示例可以包含：(1)0.005％的香芹酚和0.005％的百里香酚；(2)99.5％的柠檬油；(3)0.25％的亚洲薄荷素油；(4)0.005％的月桂叶油；(5)0.18％的广藿香油；(6)0.005％的天竺葵油；和(7)0.05％的紫苏油，以上百分比基于组合物的总重。

例如但不限于，本申请所述的抗微生物精油组合物的又另一个优选示例可以包含：(1)51.25％的香芹酚；(2)26.25％的百里香酚；(3)8.75％的柠檬油；(4)7.5％的亚洲薄荷素油；(5)2.5％的月桂叶油；(6)0.125％的广藿香油；(7)1.25％的天竺葵油；和(8)2.375％的紫苏油，以上百分比基于组合物的总重。

例如但不限于，本申请所述的抗微生物精油组合物的仍然又另一个优选示例可以包含：(1)25％的香芹酚和25％的百里香酚；(2)2％的柠檬油；(3)10％的亚洲薄荷素油；(4)20％的月桂叶油；(5)0.5％的广藿香油；(6)2％的天竺葵油；(7)5％的金银花油；(9)4％的川芎油；(10)0.3％的苍耳子油；和(11)0.2％的连翘油。

本申请所述的抗微生物精油组合物中的多种成分结合在一起，通过协同作用，共同实现了优异的抗微生物性质。例如，本申请所述的抗微生物精油组合物可以对选自细菌、真菌、病毒、支原体或其组合的微生物显示良好的杀灭或抑制作用。在一个方面，本申请所述细菌的示例可以包括肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、白色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或多种。在另一方面，本申请所述病毒的示例可以包括新冠病毒、流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒中的一种或多种，例如，新冠病毒。在又一方面，本申请所述的支原体可以为肺炎支原体。

例如，当使用本申请的精油组合物针对新冠病毒进行体外消杀时，处理3分钟和30分钟的杀灭效率可高于75％，例如，高于80％、85％、90％、95％、98％乃至于接近100％。不希望受限于任何理论，申请人相信，精油组合物杀灭新冠病毒的机理可至少部分基于以下事实：新冠病毒具有包膜结构，属于亲脂(亲油)病毒，理论上易于被天然植物精油吸附富集，进而被灭活。申请人研究发现，本申请的抗病毒植物精油与新冠病毒原液接触混合后，可将新冠病毒从原液中“萃取”而出，进而快速、高效灭活新冠病毒。本申请中所选择的多种精油成分之间存在活性的互补和加成，相比于单方精油，实现了预料不到的协同工作，获得了显著更好的抗微生物性质。除此之外，本申请的精油组合物还可实现其他有益效果，包括但不限于，组合物中的部分成分能够阻断新冠病毒结合呼吸道上皮细胞ACE2受体(即，实现阻断/防护作用)；部分成分能够通畅呼吸、改善早期病毒性上呼吸道感染或感冒引起的鼻塞不适的成分(即，舒缓作用)。而且，本申请的精油组合物基于天然植物材料制成，气味芬芳，具有低刺激性、低腐蚀性、对人体无毒无害并且对环境友好等诸多优点。

本申请至少一实施方式还提供了包含抗微生物精油组合物的制品。制品可以包括能够对环境或人体进行微生物消杀的制品。在一个方面，本申请所述的能够对环境或人体进行微生物消杀的制品是指对人体无毒性、无刺激性、无腐蚀性、对环境友好并且能够减少或杀灭环境中或人体上的有害微生物的制品。其可以包括，例如，能够在硬表面、纺织品、皮肤、粘膜或毛发中的一种或多种上减少或杀灭微生物的制品。在本申请的上下文中，术语“硬表面”是指除了纺织品表面和人体表面之外的环境物体表面，包括但不限于天花板、墙壁、地板/地砖、电梯、楼梯、扶手、家具、餐具、车辆等生活中容易接触到的常用表面；术语“纺织品”包括但不限于衣物、帽子、毛巾、桌布、床上用品等；术语“皮肤”是指人或动物的皮肤；术语“粘膜”是指人或动物的口腔、眼部或直肠粘膜；术语“毛发”是指人的头发或体毛，或者动物的毛发或羽毛。在一些示例中，能够在硬表面、纺织品、皮肤、粘膜或毛发中的一种或多种上减少或杀灭微生物的制品可以包括选自口罩爆珠、卫生湿巾、空气清新剂(如空气凝胶或空气喷雾等)、口腔喷雾、个人盥洗用品(如洗手液、洗发水、护发素、沐浴液等)、化妆品、护肤品、空气凝胶、抑菌喷雾、表面清洁剂(如家具清洁剂、地板清洁剂、厨房清洁剂、厕所清洁剂等)和洗涤剂(如衣物洗涤剂、餐具洗涤剂等)中的一种或多种。

另外地或可选地，本申请所述的制品还可以包括防护用品。例如，防护用品可以包括选自日常服装(如内衣、外衣或袜子等)、口罩(如民用口罩、医用口罩等)、防护手套、防护衣中的一种或多种，例如，爆珠口罩。

另外地或者可选地，本申请所述的制品还可以包括食品或保健品。例如，食品或保健品可以包括口香糖、香口丸、爆珠、凝胶糖果、硬糖、软糖、饮料、膳食补充剂中的一种或多种。

本申请至少一实施方式还提供了制备如上所述的抗微生物精油组合物的方法，包括将所述抗微生物精油组合物的所有成分均匀混合。在一个方面中，混合在常温常压下进行。

本申请至少一实施方式还提供了制备包含抗微生物精油组合物的制品的方法，包括将抗微生物精油组合物的所有成分均匀混合，制成精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠，并且将该精油母粒或精油微胶囊与制品的其他组分组合，得到所述制品。例如，该制备方法可以包括将抗微生物精油组合物的所有成分均匀混合，制成精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠；并且将制成的精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠添加到口罩(如民用口罩或医用口罩)中。在使用过程中，由此制成的口罩中的精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠(在按压破碎后)将缓慢地持续释放抗病毒精油组合物，从而对通过该口罩吸入或排出的气体(如空气)中可能存在的致病性微生物产生消杀作用。

以下将参考实施例对本申请进行进一步的详细解释。然而，本领域技术人员应理解，这些实施例仅为了说明的目的提供，而不是意图限制本申请。

实施例

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。除非另外指明，所列出的所有量均基于总重以重量份数描述。本申请不应解释为受限于所述的具体实施例。

制备实施例1-13

根据下表1-2中的配方，将各组分在常温常压下混合以制备实施例1-13的精油组合物，其中实施例1-7是本申请的精油组合物，实施例8-13是对比精油组合物。

表1.

[注]：1.上表中的数字代表基于组合物总重的百分比；

2.“-”表示不包含相应组分。

表2.

[注]：1.上表中的数字代表基于组合物总重的百分比；

2.“-”表示不包含相应组分。

测试例1

分别制备实施例1的精油组合物(标记为食品级精油(FEO))和实施例3的精油组合物(标记为化妆品级精油(CEO))。

根据下面的测试方法，对FEO和CEO的细胞毒性和灭活新冠病毒(SARS-Cov-2)的效果进行测试。

由以上结果可见，本申请的精油组合物FEO和CEO具有可接受的细胞毒性和极好的新冠病毒杀灭效果。

测试例2

根据以下方式，在细胞水平上评价实施例及对比例的精油组合物抗新冠病毒(SARS-CoV-2)效果。

材料

细胞：VeroE6细胞。

病毒：SARS-CoV-2(南非变异株)，滴度为TCID₅₀＝10^-5/100μL，使用病毒滴度为100TCID₅₀。

精油：采用倍比稀释法用细胞培养基将复方精油稀释成6个浓度。

方法

(一)受试药物抗病毒实验

(1)受试药物：

表2：复方精油细胞毒性药物名称、实验浓度和分组

表3：复方精油细胞毒性实验药物名称、实验浓度和分组

(2)无菌96孔培养板,每孔加入100μL浓度为1×10⁵cells/mL VeroE6细胞，37℃5％CO₂培养24小时；

(3)培养板实验组和病毒对照组加入100TCID₅₀病毒液100μL/孔，37℃

5％CO₂培养箱吸附2h；

(4)2h后，弃去96孔培养板中细胞培养液；受试药物稀释成表1中的各个浓度，每个浓度3个复孔，100μL/孔加入上述药液；

(5)同时设立细胞对照、空白对照(溶剂对照)、病毒对照(阴性对照)和对比药物对照；

(6)细胞37℃,5％CO₂孵箱孵育3天；

(7)光学显微镜下观察细胞病变(CPE),细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”无病变出现；“±”为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变约25％；“++”为细胞病变约50％；“+++”为约75％的细胞出现病变：“++++”为75％以上病变。采用Reed-Muench法或GraphPad Prism5.0计算半数有效浓度(IC₅₀)。判断药效标准：具有50％的抑制病毒CPE的浓度视为有效浓度。

(8)实验条件：以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

结果

1、MTS检测复方精油细胞毒性：

待VeroE6细胞生长状态最好时，用0.02％EDTA和0.5％胰酶消化细胞，用生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液加入96孔细胞培养板中，100μL/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养至致密细胞单层。用培养基将复方精油稀释为不同浓度，分别为600μL/L、300μL/L、150μL/L、75μL/L、37.5μL/L、18.75μL/L；加入细胞培养板中，100μL/孔。每个稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37℃5％CO2培养箱中培养，MTS法检测细胞活性，具体结果见附表1。各组复方精油在300μL/L对VeroE6细胞均无毒性，故后续实验选择300μL/L为最高实验浓度。

2、CPE观察：病毒感染72h后，正常细胞对照组无CPE，病毒对照组，CPE明显，不同精油浓度组表现出对CPE不同的抑制效果，通过观察细胞病变(CPE)并记录实验结果，采用Reed-Muench法或GraphPad Prism5.0计算半数有效浓度(IC₅₀)，具体结果见附表2。各组复方精油均具有抗病毒作用，与对比例比较，实施例均显著优于对比例。

测试例3

根据以下方式，在细胞水平上评价实施例及对比例的精油组合物针对流感病毒、鼻病毒和呼吸道合胞体病毒的体外抗病毒效果。

实验材料：

1、受试组合物：根据下表4中列出的配方组成，制备复方精油1-10，其中，复方精油8为实施例2的精油组合物，复方精油9为实施例1的精油组合物，复方精油10为实施例3的精油组合物。

表4.

2、细胞：Vero-E6细胞。

3、病毒：

毒株名称	来源
		A/PR/8/34(H1N1)	ATCC
A/Aichi/2/68(H3N2)	ATCC
		B/Lee/1940(FluB)	ATCC
人鼻病毒(hRHV)	ATCC
		呼吸道合胞体病毒(RSV)	ATCC

实验方法

1、细胞培养和准备：

1.1Vero-E6细胞复苏：

冻存细胞置于37℃水浴中快速融化，800rpm/min离心5分钟后，去除冻存液，加入5mL新鲜培养基(DMEM，10％FBS)并转移至T25细胞培养瓶中，在37℃二氧化碳培养箱中继续培养。24小时后，观察细胞生长情况，确认是否恢复正常生长。

1.2细胞传代：

用5mL PBS清洗Vero-E6细胞表面2次，用lmL 0.25％胰酶-EDTA消化细胞，放置到培养箱中，待观察到细胞有变圆、脱落现象，立即加入4mL新鲜培养基终止消化。将消化下的细胞800pm/min离心5分钟，以1:1的比例接种到新的T75培养瓶中。

1.3接种细胞：

取对数生长期的Vero-E6细胞，用3mL 0.25％胰酶-EDTA消化细胞，离心、重悬细胞后，铺细胞至96孔板，放入37℃二氧化碳培养箱中持续培养。

2、Vero-E6细胞毒性试验

2.1精油的稀释：

取60μL受试精油加入60μL维持培养液，混合均匀，取100μL依次用维持培养液进行10倍系列稀释。

2.2细胞毒性测定：

约20小时后，Vero-E6密度达90％，弃去96孔板中的Vero-E6细胞上层培养基，PBS洗2次，取精油稀释液加入96孔板中，设置细胞对照组(N，不加精油，用维持培养液代替)。72小时肉眼观测细胞状态。

3、病毒的处理与细胞感染

3.1病毒和精油的混合处理：

取EP管加入200μL病毒溶液，每个病毒株各2个EP管，将上述2个装有病毒溶液的EP管分别加入200μL精油或DMEM溶液，每个EP管共400μL混合液。混合后室温放置60分钟，分别标为FEO(精油加病毒溶液混合处理60分钟)、Ctrl(DMEM加病毒溶液混合处理60分钟)。

3.2病毒精油混合液的稀释：

室温放置60分钟，每管分别取100μL，用病毒稀释液依次10倍稀释病毒精油混合液，每组做3次重复。

3.3细胞感染：

在已铺满层Vero-E6细胞的96孔板中，每孔分别加入100μL精油-病毒或DMEM-病毒的稀释液，每份稀释度样品设置6个重复孔。设置病毒阳性对照孔和正常细胞孔，放入37℃二氧化碳培养箱中持续培养。

3.4细胞病变观察：

72小时后在显微镜下观察细胞病变情况，按Reed-Muench公式计算每组的TCID₅₀值，并对比精油对病毒的抑制率。

距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)；

lgTCID50＝距离比例×稀释倍数的对数+高于50％病变率的稀释度的对数

抑制率＝(对照孔病毒滴度-实验孔病毒滴度)/对照孔病毒滴度×100％

3.5实验条件：

以上实验操作均在BSL-3实验室内完成。

实验结果

1、复方精油细胞毒性结果：在72小时，肉眼观察精油作10^-1-10^-4稀释后，实验孔细胞出现死亡；精油作10^-5稀释后作用的细胞与对照组细胞相比，形态正常，无明显差异。因此，精油肉眼观对Vero-E6细胞的最大无毒浓度为精油原液作10^-5稀释。

2、精油抑制病毒作用结果：病毒感染72小时后，正常细胞对照组无CPE，病毒对照组CPE明显，不同精油浓度组表现出对CPE不同的抑制效果，由各组病毒滴度计算各组精油的病毒抑制率，具体结果见表5-9，复方精油病毒抑制率的汇总结果见表10和图1，结果表明各组复方精油均具有一定的抗病毒作用，复方精油9、10、1作用相当，优于7、8；优于3、6；显著优于2、4、5。

表5.复方精油对H1N2的抑制作用

表6.复方精油对H3N2的抑制作用

表7.复方精油对FluB的抑制作用

表8.复方精油对hRHV的抑制作用

表9.复方精油对RSV的抑制作用

表10.复方精油对H1N1、H3N、FluB、hRHV、RSV的抑制率比较

精油组方	H1N1	H3N2	FluB	hRHV	RSV
						1	98.68±12.58	95.68±12.58	99.12±3.80	95.28±3.39	98.07±3.65
2	58.72±7.41	58.72±7.41	59.66±6.64	54.30±5.93	53.15±6.64
						3	83.12±5.48	73.12±5.48	88.84±12.19	71.09±10.87	76.11±11.9
4	46.00±6.45	56.00±6.45	61.55±11.48	52.51±5.96	46.50±6.52
						5	64.84±6.08	64.84±6.08	63.66±6.68	55.99±10.24	50.31±11.2
6	84.68±5.43	84.68±5.43	84.80±7.21	76.72±6.43	78.24±9.97
						7	85.65±10.42	85.65±10.42	86.05±3.90	74.27±3.48	83.58±9.61
8	79.12±3.32	79.12±3.32	92.72±5.62	78.25±5.01	83.88±8.19
						9	99.83±1.35	98.83±1.35	98.67±4.16	98.49±4.28	97.98±6.67
10	98.72±5.79	96.72±5.79	97.97±2.11	96.13±2.04	97.45±5.49

测试例4

根据以下方式，在细胞水平上评价实施例及对比例的精油组合物针对多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的体外抑菌作用。

实验材料：

1、受试组合物：本测试例中所用的受试组合物与测试例3中所用的复方精油1-10相同，其中，复方精油8为实施例2的精油组合物，复方精油9为实施例1的精油组合物，复方精油10为实施例3的精油组合物。

2、标准菌株：

标准菌株	来源
		肺炎双球菌(菌号31001)	中国药品生物制品检定所
金黄色葡萄球菌(菌号26112)	中国药品生物制品检定所
		表皮葡萄球菌(菌号26487)	中国药品生物制品检定所
卡他球菌(菌号29103)	中国药品生物制品检定所
		大肠杆菌(菌号44155)	中国药品生物制品检定所
痢疾杆菌(菌号51592)	中国药品生物制品检定所

3、培养基：普通肉汤培养基、普通琼脂培养基和血清琼脂培养基，均按常规方法制备。

实验方法

选用标准三株革兰氏阳性菌(肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和三株革兰氏阴性菌(卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌)，采用试管法观察复方精油体外对标准菌株的抑制作用。

(1)精油稀释：将精油原液1ml稀释5倍即精油浓度为200μL/ml，再按倍比稀释法稀释，使精油药液终浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μL/ml共9个浓度。

(2)菌液的制备：取培养18h的肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌培养物，分别用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至10^-7-10^-5点所加菌落数。

(3)试验方法：将晾干的含有1000CFU菌液的上述药敏纸片，置8种不同浓度的复方精油中浸泡1h，分别置于10ml TSB 37℃培养48h，观察TSB是否浑浊，同时接种于各菌株分离琼脂平板，与37℃培养24h，观察是否有菌落生长。同时设置不加精油药液的阳性对照和加精油不加菌株的阴性对照，每个重复3次。以无菌生长的最低精油浓度作为对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)。

实验结果

在本试验条件下，复方精油对常见的革兰氏阳性菌(肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌)均见不同程度的抑制作用。由表11、图2、图3中最小抑菌浓度结果可见，实施例9、10、1作用相当，优于3、6、7、8，显著优于2、4、5。

表11.复方精油体外对标准菌株的最小抑菌浓度(MIC，μL/ml)

测试例5

根据《消毒技术规范》2002年版-2.1.3.4空气消毒效果模拟现场试验的方法，测试了实施例1的精油组合物(标记为食品级精油(FEO))针对白色葡萄球菌的空气消毒效果。

量取200mL FEO，加入雾化器中，开启最大档雾化1小时后，使用BY-300空气微生物采样器以28.3升/分钟的抽风量采样。处理对照组采样时间为30s，处理实验组采样时间为5min，实验舱大小为20m³。对杀灭率实验结果进行处理以消除微生物在空气中自然消亡因素的影响。结果如下表12所示。

表12.

由以上结果可见，本申请的精油组合物针对空气中的白葡萄球菌具有良好的消毒作用。

测试例6

参照《消毒技术规范》2002年版-2.1.1.10.7的病毒灭活试验方法，测试了实施例1的精油组合物(标记为食品级精油(FEO))针对肠道病毒71、腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、甲型流感病毒H1N1、脊髓灰质炎病毒的病毒灭活作用。结果显示：

-以FEO原液处理肠道病毒71型(ATCC VR-1432，宿主名称：Vero细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)为1.36，病毒灭活率为95.69％；

-以FEO原液处理人疱疹病毒A5C株(ATCC VR-2019，宿主名称：Vero细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)>4.37，病毒灭活率>99.99％；

-以FEO原液处理腺病毒3型(ATCC VR-3，宿主名称：A454细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)为1.61，病毒灭活率为97.56％；

-以FEO原液处理柯萨奇病毒A21(ATCC VR-850，宿主名称：Vero细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)为1.41，病毒灭活率为95.97％；

-以FEO原液处理甲型流感病毒H1N1：A/PR/8/34(ATCC VR-1469，宿主名称：MDCK细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)>4.37，病毒灭活率>99.99％；

-以FEO原液处理脊髓灰质炎病毒-I型疫苗株(宿主名称：Vero细胞)30min后，平均灭活对数值(KL)为1.24，病毒灭活率位94.23％；

-阴性对照组细胞生长良好，实验结果符合评价规定的全部条件。

由以上结果可见，本申请的精油组合物针对肠道病毒71、腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、甲型流感病毒H1N1、脊髓灰质炎病毒有良好的病毒灭活作用。

测试例7

参照《消毒技术规范》2002年版-2.1.11.3的抑菌率检测方法，测试了实施例1的精油组合物(标记为食品级精油(FEO))针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌率。结果显示，以FEO原液处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌2min后，抑菌率均>99.9％，符合《消毒技术规范》2002年版-2.1.11.3的要求。

由以上结果可见，本申请的精油组合物针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌有良好的抑菌作用。

测试例8

依据支原体培养法和《消毒技术规范》2002年版2.1.1.7和2.1.1.9的检测方法，测试了实施例1的精油组合物(标记为食品级精油(FEO))针对肺炎支原体进行了支原体生长抑制实验。结果显示，在规定实验条件下，在25℃以FEO原液处理肺炎支原体(ATCC15531)30min后，活菌浓度对数值下降>3，杀灭率>99％，对肺炎支原体有杀灭效果。

由以上结果可见，本申请的精油组合物针对肺炎支原体有良好的杀灭作用。

Claims

1.抗微生物精油组合物，基于组合物的总重，所述微生物精油组合物包含：

(1)2-80％的香芹酚和百里香酚；

(2)2-50％的柠檬油；

(3)5-40％的亚洲薄荷素油；

(4)2-20％的月桂叶油；

(5)0.1-5％的广藿香油；

(6)2-20％的天竺葵油；和

(7)任选地，2-15％的紫苏油。

2.权利要求1的抗微生物精油组合物，基于组合物的总重，所述抗微生物精油组合物包含：

(1)5％的香芹酚和5％的百里香酚；

(2)35％的柠檬油；

(3)30％的亚洲薄荷素油；

(4)10％的月桂叶油；

(5)0.5％的广藿香油；

(6)5％的天竺葵油；和

(7)9.5％的紫苏油。

3.权利要求1或2的抗微生物精油组合物，其中，所述微生物选自细菌、真菌、病毒、支原体及其组合。

4.权利要求3的抗微生物精油组合物，其中，所述微生物为新冠病毒、流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒中的一种或多种。

5.权利要求4的抗微生物精油组合物，其中，所述微生物为新冠病毒。

6.权利要求3的抗微生物精油组合物，其中，所述微生物为肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、白色葡萄球菌和白色念珠菌中的一种或多种。

7.权利要求3的抗微生物精油组合物，其中，所述微生物为肺炎支原体。

8.包含权利要求1-7中任一项的抗微生物精油组合物的制品。

9.权利要求8的制品，其中，所述制品包括能够在硬表面、纺织品、皮肤、粘膜或毛发中的一种或多种上减少或杀灭微生物的制品。

10.权利要求8或9的制品，其中，所述制品为选自化妆品、护肤品和洗涤剂中的一种或多种。

11.权利要求8或9的制品，其中，所述制品为选自口罩爆珠、卫生湿巾、空气清新剂、口腔喷雾、洗手液、洗发水、护发素、沐浴液、空气凝胶、皮肤抑菌喷雾中的一种或多种。

12.权利要求8或9的制品，其中，所述制品为防护用品。

13.权利要求8或9的制品，其中，所述制品为选自民用口罩、医用口罩、防护手套、防护衣中的一种或多种。

14.权利要求13的制品，其中，所述制品为爆珠口罩。

15.制备权利要求8-14中任一项的制品的方法，包括：

将所述抗微生物精油组合物的所有成分均匀混合，制成精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠，

将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠与所述制品的其他组分组合，得到所述制品。

16.权利要求15的方法，其中，所述制品为民用口罩或医用口罩，

所述将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠与所述制品的其他组分组合包括将所述精油母粒或精油微胶囊或精油爆珠添加到所述民用口罩或所述医用口罩中。