CN1149289C - 棉桃阿舒氏囊霉启动子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适合用作启动子的DNA序列，由以下成分组成：a)由SEQ ID NO：1的9-307位中所表示的一级结构。本发明还涉及包括上述DNA序列的表达弹夹以及一种用于重组生产宿主生物体中优质化学物质的方法。

Description

棉桃阿舒氏囊霉启动子
技术领域
本发明涉及一种新型棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)启动子及其用于基因表达的用途。
背景技术
丝状真菌是用于生物技术的重要生物体，这是因为它们具有产生所关注成分的特征的原因。由真菌形成的这些成分不仅包括低分子量的化合物诸如有机酸类、抗菌素类或维生素类；而且包括高分子量的化合物诸如酶类、非酶蛋白质或其它生物聚合物。
生物技术的一般目的是使由真菌产生的这类成分最佳化。用于这一目的的方法尤其是重组法。这些方法包括例如超表达上述丝状真菌中的各个基因或基因组。这些基因可以来源于它们在其中被表达的生物体，而且这些基因还可以来源于其它生物体。
在所有情况中，必要的是能够控制所表达基因的表达。在所有生物体中表达的所有基因具有编码序列的启动子5’区。该区可导致其自身转录的启动、且还能够产生转录调节。一般来说，这种调节通过使启动子区内的转录因子与调节序列结合而进行。通常启动子是自由移动的，即可以将一种基因中的启动子用于控制另一种基因的转录。然后这种新型基因的控制一般与所述启动子所来源的原始基因的控制相同。因此，可以将调节作用是公知的且可以得到控制的公知启动子用于控制任意基因的公知形式的表达。
丝状真菌棉桃阿舒氏囊霉是生物技术和经济领域所关注的。特别感兴趣的是因为它具有的能够产生大量核黄素的特征(参见，例如Kurth等(1996)“核黄素”：在Ullmann的《工业化学百科全书》中，VCH Weinheim)。此外，还感兴趣的是其它代谢物和成分的产生。这些成分可以是例如氨基酸类、维生素类、蛋白质、还有其它初级和次级代谢物质或其它生物聚合物。
重组法的用途使得棉桃阿舒氏囊霉和其它生物体中的这类成分的产生最佳化。
为了实施这样的方法，棉桃阿舒氏囊霉自身的遗传调节子(特别是启动子)是极为重要的。特别感兴趣的是那些(称作强)使超表达棉桃阿舒氏囊霉中基因成为可能的启动子。这类来自阿舒氏囊霉菌的强启动子到目前还被描述过。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于转录的强调节元件(启动子)，可以将它们主要用于丝状真菌，特别是阿舒氏囊霉菌属的那些真菌。
本发明的主题是一种适合用作启动子的DNA序列，它包括
a)由SEQ ID NO：1的9-307位中所表示的一级结构或
b)一种在标准条件下与含有a)的双链杂交并基本与a)具有相同启动子活性的一级结构。
当所转录的棉桃阿舒氏囊霉GAP结构基因与比较值没有25％以上的不同、优选10％时，所述的启动子活性基本上是相同的。
特别优选的启动子是由SEQ ID NO：1所表示的DNA序列，在其5’和3’端带有NotI限制切割位点，该位点在每种情况中均有8个核苷酸长并使所述的启动子更容易移动。
作为启动子的功能的重要特征如下：
·真实的(bona fide)TATA盒(nt 224-230)；
·两个符合GCR1结合元件的识别序列的序列区段(nt 43-51和77-85)和
一个其补码(komplement)部分符合RAP1结合元件识别序列的序列区段(nt 9-20)。
本发明的另外的发明主题是包括本发明的启动子的表达弹夹，其中所述的启动子序列在功能上与一个或多个结构基因功能性连接。术语功能性连接是指能使结构基因转录的DNA序列的排列。
借助于这类表达弹夹可以转化宿主生物体诸如细菌、酵母、真菌、动物和植物，特别是类似于阿舒氏囊霉菌属中那些真菌的丝状真菌。
本发明的另一个发明主题是一种用于重组产生宿主生物体中优质化学物质的方法，其中：
用上述的表达弹夹之一转化宿主生物体，且这种表达弹夹含有一个或多个可编码所需优质化学物质或催化所需优质化学物质生物合成的结构基因；
培养所述的转化的宿主生物体并
从培养基中分离所需的优质化学物质。
这种方法广泛用于优质化学物质诸如酶类、维生素类、氨基酸类、糖类、脂肪酸类和天然和合成的调味剂、香味剂和着色剂。培养这种转化的宿主生物体并通过本领域技术人员公知的方法从所述的宿主生物体或培养基中分离优质化学物质。
附图说明
附图1的描述：
带有AgADE4片段的总棉桃阿舒氏囊霉RNA的RNA印迹(上部)或作为带有AgGPD1基因的内部组成对照(下部)。
泳道，从左至右：
1.棉桃阿舒氏囊霉RNA/野生型
2.棉桃阿舒氏囊霉RNA/ade4：G418
3.棉桃阿舒氏囊霉RNA/GAP-AgADE4
4.棉桃阿舒氏囊霉RNA/GAP-AhADE4
5.棉桃阿舒氏囊霉RNA/GAP-AgADE4-A418W
6.棉桃阿舒氏囊霉RNA/GAP-AgADE4-D310V-K333A
附图2的描述：
棉桃阿舒氏囊霉GAP启动子的核酸序列
具体实施方式
在下面的实施例中进一步描述本发明的实施方案。
实施例1
从棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895制备基因组基因文库
通过公知的方法例如如WO 97/03208中所述可以制备来自棉桃阿舒氏囊霉ATCC10895的基因组DNA。从这种DNA开始，通过公知方法(例如Sambrook，J.等(1989)《分子克隆》(Molecular cloning)：“实验室手册”，Cold Spring Hatbor Laboratory Press或Ausubel，F.M.等(1994)《最新分子生物学设计方案》(Current protocolsin molecular biology)，John Wiley和sons)在任意质粒或粘粒诸如例如SuperCosl(Stratagene，La Jolla，USA)中可以建立所述的基因组基因文库。
实施例2
棉桃阿舒氏囊霉GAP启动子
通过一般常规地筛选棉桃阿舒氏囊霉基因组粘粒基因文库可以克隆棉桃阿舒氏囊霉(AgGGAP)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(参见实施例1，使用一种形成啤酒糖酵母GAP基因的序列生成的探针)。
将所述基因的5’未翻译区(-373至-8区，与翻译起点相关)假定为启动子。将限制酶NotI的两个切割位点引入到这种序列两侧。这该区中，发现真实的TATA盒(nt 224-230)、符合称作GCR1结合元件的两个序列区段(nt 43-51和77-85)和其补码部分符合啤酒糖酵母RAP1结合元件的一个序列区段(参见，例如，Johnston，M.和Carlson，M.(1992)pp.193-281《分子生物学和酵母糖酵母属的分子生物学》：“基因表达”，Cold Spring Harbor Laboratory Press)在该区中。
可以将由此构建的启动子弹夹放入任意基因的上游作为容易移动的表达信号并在棉桃阿舒氏囊霉中产生对相应基因的显著的超表达，正如实施例3中所示。所得序列是SEQ ID NO：1的序列。
实施例3
用棉桃阿舒氏囊霉GAP启动子构建AgADE4的构建体和棉桃阿舒氏囊霉中AgADE4基因的超表达
为了引入AgADE4的GAP启动子弹夹5’编码区，通过常规方法(例如Glover，D.M.和Hames，B.D.(1995)《DNA克隆》(DNA cloning)第1卷，IRL press)引入单一Notl切割位点(GCGGCCGC)-8bp的ATG起始密码子5’。
然后通过NotI可以将GAP启动子弹夹(实施例2)插入这一位置。当克隆其它棉桃阿舒氏囊霉基因的GAP启动子弹夹的5’编码区(诸如例如，rib基因)时且当克隆异源基因(即那些来源于棉桃阿舒氏囊霉的基因，例如用于任意酶的基因)时进行类似的过程。
在棉桃阿舒氏囊霉中，携带GAP启动子弹夹5’编码区的基因的表达受到GAP启动子的控制。通过附图1中的RNA印迹的实例来证实这一点。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)姓名：BASF Aktiengesell schaft
(B)街：Carl-Bosch-Strasse 38
(C)城：Ludwigshafen
(E)国家：德意志联邦
(F)邮政编码：D-67056
(G)电话：0621/6048526
(H)传真：0621/6043123
(I)电传：1762175170
(ii)发明名称：棉桃阿舒氏囊霉GAP启动子
(iii)序列号：1
(iv)计算机可读形式：
(A)媒体：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPA)
(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：315个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(iii)假拟结构：无
(iii)反义结构：无
(vi)原始来源：
(A)生物体：棉桃阿舒氏囊霉
(ix)特征：
(A)名称/关键词：TATA_signal
(B)位置：224..230
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_signal
(B)位置：43..51
(ix)特征：
(A)名称/关键词：misc_signal
(B)位置：77..85
(ix)序列描述：SEQ ID NO：1
GCGGCCGCTG TCTGGGTGCA CGACACCTGA CCTCCGCCCC GCGGCTTCCT GTTTTCGCCG
GGCGCGGCAA TGGTGCGGCT TCCTCCGACA GGAACTACGA CGAACGGTCA GCACCCCTGG
GGCCCCCACG CCGCACCACA GCCGCTGCGC GTGGGCGTGA AAAATTTTAC CTGCGGGCTC
TCCTTACGAT CTCTATTTTA TTTCCTGGGG GGCAGTCGAA ATCTATATAA GAGGGCCCCG
GGACGCACAA CGGGAGACTC TGGTGGAGAG ACCAGGAGTT TGAATTAATT CAGTCCACAC
ATACACAGCG GCCGC

Claims (3)

1.一种适合用作启动子的DNA序列，由以下成分组成：a)由SEQID NO：1的9-307位中所表示的一级结构。
2.一种包括如权利要求1中所述DNA序列的表达弹夹，它与结构基因功能性连接。
3.一种用于重组生产宿主生物体中优质化学物质的方法，其中
用一种如权利要求2中所述的表达弹夹转化宿主生物体，且这种表达弹夹含有一个或多个可编码所需优质化学物质或催化所需优质化学物质生物合成的结构基因；
培养所述的转化的宿主生物体并
从培养基中分离所需的优质化学物质。
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