CN114923994A - 一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,具体属于医药检测技术领域,该方法包括如下步骤:S01、在待检测的血浆样本中加入内标试剂,涡旋混匀后得到混合样本液。S02、在混合样本液中加入蛋白沉淀剂,经涡旋混匀、离心后得到上清液。S03、上清液经超高效液相色谱串联质谱检测,得到硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值。S04、利用内标定量法,将血浆样品中硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值代入已经建立的标准曲线中,即可计算出待测血浆中硫酸阿米卡星的浓度,其中,标准曲线以硫酸阿米卡星和内标的色谱峰面积比为纵坐标,以血浆中硫酸阿米卡星浓度为横坐标而制作。本发明提供的方法具有准确度高、灵敏性好、样品处理简单的优点。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域,具体涉及一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法。
背景技术
抗菌药物的耐药已成为当今全球面临的最紧迫的公共卫生问题之一,其中作为引起人类感染性疾病的主要病原之一,革兰氏阴性菌对临床常用抗菌药有很强的耐药性,是当前最受关注的耐药菌之一。
硫酸阿米卡星作为氨基糖苷类抗生素,适用于革兰氏阴性菌以及耐药菌引起的感染。其作用机制是作用于细菌体内的核糖体,抑制细菌蛋白质合成,并破坏细菌细胞壁的完整性,致使细菌细胞膜破坏,细胞死亡。根据2015年中国细菌耐药性网站监测(CHINET)的数据显示,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中产超广谱β内酰胺酶菌(ESBL)的检出率分别达52.6%、31.7%。2021年临床分离出的3591株肠杆菌科细菌以及10686株铜绿假单胞菌中对阿米卡星的敏感率分别达95%和98%以上。此外,CHINET数据显示碳青霉烯耐药肠杆菌科的检出率呈逐年上升的趋势。另外,有研究者分析发现对氟喹诺酮类、β内酰胺类以及碳青霉烯类等抗菌药均耐药的肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯大肠埃希菌株中,对阿米卡星敏感的大约有50%。不论是CHINET的数据还是文献报道的数据,均提示由耐药革兰氏阴性菌引起的感染临床可以根据药敏结果选用阿米卡星进行多药联合治疗。
硫酸阿米卡星的杀菌作用具有浓度依赖性,目前相关临床指南多推荐每日一次的给药方法,其抗菌疗效与药物浓度呈正相关,药物的峰浓度越高,杀灭致病菌的效率越高。但硫酸阿米卡星具有明显的肾毒性,临床为了追求安全性会降低用量,导致药物在患者体内的峰浓度过低而影响治疗效果。目前越来越多的研究者表示对接受硫酸阿米卡星治疗的患者开展治疗药物浓度监测(therapeutic drug monitoring,TDM)很有必要,根据药物浓度调整硫酸阿米卡星剂量,为临床合理用药提供指导。目前,人血浆中测定硫酸阿米卡星的方法主要有1.HPLC法;2.HPLC-MS/MS法;3.微生物法;然而,这些方法存在着灵敏度不够、检测时间过长、样品处理繁琐、同位素内标物难以获得等限制。
因此,开发一种准确度高、灵敏性好、样品处理简单、高效的UPLC-MS/MS法,以用于测定小样本量的血样,从而满足临床血药浓度监测的需要是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,该方法具有准确度高、灵敏性好、样品处理简单的优点。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,该方法包括如下步骤:
S01、在待检测的血浆样本中加入内标试剂,涡旋混匀后得到混合样本液;
S02、在混合样本液中加入蛋白沉淀剂,经涡旋混匀、离心后得到上清液;
S03、上清液经超高效液相色谱串联质谱检测,得到硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值;
S04、利用内标定量法,将血浆样品中硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值代入已经建立的标准曲线中,即可计算出待测血浆中硫酸阿米卡星的浓度,其中,标准曲线以硫酸阿米卡星和内标的色谱峰面积比为纵坐标,以血浆中硫酸阿米卡星浓度为横坐标而制作。
其中,标准曲线的制备步骤为:
(1)在血浆空白样本中依次加入内标物标准试剂及不同浓度的硫酸阿米卡星标准试剂,涡旋混匀后分别得到相对应的标准曲线工作液;
(2)以硫酸阿米卡星和内标的色谱峰面积比为纵坐标,以空白血浆中硫酸阿米卡星浓度为横坐标,绘制得到标准曲线。
作为优选,在步骤(2)中,涡旋时间为20s-60s。
作为优选,在步骤S01中,内标试剂选用卡那霉素或依替米星或链霉素标准溶液。
作为优选,在步骤S03中,蛋白沉淀剂是甲酸或三氟乙酸-甲醇-乙腈的混合物,其中甲酸或三氟乙酸:甲醇:乙腈的体积比为1~90:600~660:310~339。
作为优选,在步骤S03中,涡旋时间为:1-3min,温度条件为4℃-15℃,8000-15000r/min,离心时间为5-10min。
作为优选,在步骤S03中,测定的色谱条件为:
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm);
流动相:含0.05%-0.3%甲酸的水(A)-100%乙腈(B);
流速:0.3mL/min-0.5mL/min;
柱温:10℃-30℃;
进样量:0.5μL-2μL;
作为优选,在步骤S03中,测定的质谱条件为:
Waters Xevo TQ-S cronos/H-Class Plus三重四级杆-超高效液色谱仪质谱联用仪,采用电喷雾离子化模式,检测方法采用正离子反应监测模式,硫酸阿米卡星方法的锥孔电压为10-40V,碰撞电压为10-40V,m/z为586.3000→163.0000(ESI+),卡那霉素的锥孔电压为10-40V,碰撞电压为10-40V,m/z为485.2000→163.0000(ESI+)。扫描时间为8min。
作为优选,在步骤(1)中,所述标准曲线所采用的的标准品浓度如下:硫酸阿米卡星的七个浓度点依次为:25.00μg/mL、10.00μg/mL、5.00μg/mL、2.50μg/mL、1.00μg/mL、0.50μg/mL、0.25μg/mL。
作为优选,血浆样本采集自因治疗需要接受硫酸阿米卡星的患者。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1.本发明采用超高效液相色谱串联质谱法进行定量和定性,相比于HPLC及HPLC-MS/MS法,最低检测限达到微克级,分析时间段,所需样品量少。
2.本发明血浆样品处理方法相较于传统抗生素微生物法处理方便,操作更简单,引起的误差小,检测效率高。
3.质谱法检测时常用待测药物的同位素作为内标物,但同位素内标获取困难,价格昂贵,为方法开发带来困难。本发明采用待测物的结构类似物作为内标物,大大方便了方法的推广。
4.本发明的检测方法的选择性、稳定性、精密度、回收率高达90%以上,既能满足回收率高的要求,又可以提高检测效率,为临床上硫酸阿米卡星的浓度监测提供简单快捷的方法。
附图说明
图1为硫酸阿米卡星的离子流色谱图;
图2为卡那霉素的离子流色谱图;
图3为硫酸阿米卡星的质谱图;
图4为卡那霉素的质谱图。
图5为定量下限样品(硫酸阿米卡星)色谱图;
图6为空白血浆(硫酸阿米卡星)色谱图;
图7为硫酸阿米卡星标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
标准系列样品的制备:取100μL空白血浆加入1.5mL的EP管中,加入硫酸阿米卡星标准试剂和卡那霉素标准溶液各10μL,涡旋30s。加入280μL的含甲酸-甲醇-乙腈(666:333:1V/V/V)沉淀剂,涡旋1分钟,在4℃下,14000r/min,离心10min,取100μL上清至进样瓶中,吸取2μL进行超高效液相色谱串联质谱检测。硫酸阿米卡星标准曲线的浓度点分别为25.00μg/mL、10.00μg/mL、5.00μg/mL、2.50μg/mL、1.00μg/mL、0.50μg/mL、0.25μg/mL。内标物卡那霉素浓度为2.5μg/mL。
其中,硫酸阿米卡星标准试剂的制备方法为:精密称取硫酸阿米卡星,蒸馏水稀释,配制成1000.00μg/mL的硫酸阿米卡星标准贮备液,用纯水稀释标准贮备液配成一系列标准曲线工作液。
其中,卡那霉素标准溶液的制备方法为:精密称取卡那霉素,蒸馏水稀释,配制成100.00μg/mL的卡那霉素标准溶液。
患者血浆样品:收集2021年6月份长兴县人民医院接受硫酸阿米卡星治疗24小时内的血浆样本。取100μL患者血浆加入1.5mL的EP管中,加入卡那霉素标准溶液10μL,涡旋30s。加入290μL的含甲酸-甲醇-乙腈(666:333:1V/V/V)沉淀剂,涡旋1分钟,在4℃下,14000r/min,离心10min,取100μL上清至进样瓶中,吸取2μL进行超高效液相色谱串联质谱检测。
质谱条件为:Waters Xevo TQ-S cronos/H-Class Plus三重四级杆-超高效液色谱仪质谱联用仪,采用电喷雾离子化模式,检测方法采用正离子反应监测模式,硫酸阿米卡星方法的锥孔电压为30V,碰撞电压为30V,m/z为586.3000→163.0000(ESI+),卡那霉素的锥孔电压为30V,碰撞电压为30V,m/z为485.2000→163.0000(ESI+)。扫描时间为8min。
色谱条件为:色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm);流动相:含0.1%甲酸的水(A)-100%乙腈(B);流速:0.3mL/min;柱温:25℃;进样量:2μL,梯度洗脱条件见表1。
表1梯度洗脱条件
测试例
1、方法学验证:按照中国药典对本方法学进行了方法学验证,内容包括选择性、稳定性、线性、准确性、精密度、基质效应。
2、选择性:分别取6份不同来源的人空白血浆加一份含定量下限的血浆,除不加内标物外,其余按“血浆样品处理”操作处理。进样分析,得到空白血浆样品色谱图与定量下限色谱图对比以考察选择性。其检测色谱图结果见图5和图6。
3、精密度和准确度:按“血浆样品处理”操作的低、中、高及定量下限血样进样分析。每一浓度重复5样本分析,考察批内精密度和准确度;连续三天按此操作测定3个批次,考察批间精密度和准确度。
测试结果显示硫酸阿米卡星高中低浓度及定量下限的样品准确度在15%之内,其批内和批间的精密度在15%之内,符合相关要求,统计结果见表2。
4、标准曲线和定量下限:按照“血浆样品预处理”的方法操作处理标准曲线和定量下限样品后进样检测分析,计算标准曲线及定量下限。
以硫酸阿米卡星与内标物的峰面积比为纵坐标(Y),硫酸阿米卡星的质量浓度为横坐标(X,μg/mL),进行线性回归,得到线性方程为Y=0.678086X-0.0348444(r2=0.9953)。表明硫酸阿米卡星0.25~25.00μg/mL浓度范围内的线性良好。定量下限为0.25μg/mL,标准曲线见图7。
5、回收率:配制低、中、高三个浓度的血浆样本,每一浓度平行6次。另取空白血浆,除不加内标外,进行相同处理,得到的上清液中加入一定浓度的对照溶液,使硫酸阿米卡星和内标最终浓度分别与低、中、高血浆样本处理后的理论浓度相同,平行6次,根据峰面积的比值计算回收率。
按照上述条件,结果表明硫酸阿米卡星和卡那霉素回收率均在80%以上,精密度均小于15%,符合相关要求。结果统计见表3.
6、基质效应:考察低、中、高三个浓度水平下的基质效应。取6个不同来源的空白血浆,比较上述空白血浆预处理后添加硫酸阿米卡星和内标溶液的样品与硫酸阿米卡星、内标纯溶液的相应比值,如表4所示。
结果如表4所示,硫酸阿米卡星在不同人血浆中,在低中高浓度水平内标归一化的基质效应因子为0.99~1.03,精密度≤2.62%,符合基质效应的考察标准。
表4血浆中硫酸阿米卡星的基质效应
7、稳定性:配制低、中、高血浆样本,分别在室温下放置6h,室温下放置24h,4℃下放置24h和反复冻融(-80℃→25℃)三次后,按“血浆样品处理”操作,进样检测,计算其稳定性,在本实施例中,血浆样本的相对偏差均在±15%范围内。
8、患者均因治疗需要接受硫酸阿米卡星(600mg,ivgtt,qd)治疗7d。共收集患者血浆标本60例,均为每次接受硫酸阿米卡星治疗后10-24h采集的血浆样本。患者血浆中硫酸阿米卡星的浓度如表5所示,样本浓度为0.82~12.83μg/mL。
表5接受硫酸阿米卡星治疗的患者血浆中硫酸阿米卡星浓度
Claims (9)
1.一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,包括如下步骤:
S01、在待检测的血浆样本中加入内标试剂,涡旋混匀后得到混合样本液;
S02、在混合样本液中加入蛋白沉淀剂,经涡旋混匀、离心后得到上清液;
S03、上清液经超高效液相色谱串联质谱检测,得到硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值;
S04、利用内标定量法,将血浆样品中硫酸阿米卡星和内标物的色谱峰面积比值代入已经建立的标准曲线中,即可计算出待测血浆中硫酸阿米卡星的浓度,其中,标准曲线以硫酸阿米卡星和内标的色谱峰面积比为纵坐标,以血浆中硫酸阿米卡星浓度为横坐标而制作;
其中,标准曲线的制备步骤为:
(1)在血浆空白样本中依次加入内标物标准试剂及不同浓度的硫酸阿米卡星标准试剂,涡旋混匀后分别得到相对应的标准曲线工作液;
(2)以硫酸阿米卡星和内标的色谱峰面积比为纵坐标,以空白血浆中硫酸阿米卡星浓度为横坐标,绘制得到标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤(2)中,涡旋时间为20~60s。
3.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤S01中,内标试剂选用卡那霉素或依替米星或链霉素标准溶液。
4.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤S03中,蛋白沉淀剂是甲酸或三氟乙酸-甲醇-乙腈的混合物,其中甲酸或三氟乙酸:甲醇:乙腈的体积比为1~90:600~660:310~339。
5.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤S03中,涡旋时间为:1-3min,温度条件为4℃-15℃,8000-15000r/min,离心时间为5-10min。
7.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤S03中,测定的质谱条件为:
Waters Xevo TQ-S cronos/H-Class Plus三重四级杆-超高效液色谱仪质谱联用仪,采用电喷雾离子化模式,检测方法采用正离子反应监测模式,硫酸阿米卡星方法的锥孔电压为10-40V,碰撞电压为10-40V,m/z为586.3000→163.0000(ESI+),卡那霉素的锥孔电压为10-40V,碰撞电压为10-40V,m/z为485.2000→163.0000(ESI+)。扫描时间为8min。
8.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,在步骤(1)中,所述标准曲线所采用的的标准品浓度如下:
硫酸阿米卡星的七个浓度点依次为:25.00μg/mL、10.00μg/mL、5.00μg/mL、2.50μg/mL、1.00μg/mL、0.50μg/mL、0.25μg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法,其特征在于,血浆样本采集自因治疗需要接受硫酸阿米卡星的患者。
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210405235.3A Pending CN114923994A (zh) | 2022-04-18 | 2022-04-18 | 一种检测血浆中硫酸阿米卡星浓度的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
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CN (1) | CN114923994A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117783372A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-03-29 | 裕菁科技(上海)有限公司 | 基于lc-ms/ms同时测定血浆、血清中阿米卡星和多粘菌素b的方法 |
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2022
- 2022-04-18 CN CN202210405235.3A patent/CN114923994A/zh active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN117783372A (zh) * | 2024-01-08 | 2024-03-29 | 裕菁科技(上海)有限公司 | 基于lc-ms/ms同时测定血浆、血清中阿米卡星和多粘菌素b的方法 |
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