CN114908192A - 一种冻干型荧光定量pcr检测用试剂及制备方法和应用 - Google Patents

一种冻干型荧光定量pcr检测用试剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用，属于分子生物检测技术领域。以聚乙烯吡咯烷酮K30作为冻干保护剂与qPCR检测用试剂混合，使制备的试剂粉末达到快速自然溶解的目的。同时本发明提供的试剂与相同成分的液体试剂相比，能够达到相似的检测结果。可见，本发明提供的冻干型荧光定量PCR检测用试剂不仅自然复溶速度快，而且检测结果不受影响，满足冻干型试剂的要求，此外还能大大降低运输和保存的成分，具有极大的市场竞争力。

Description

一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物检测技术领域，具体涉及一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR现已运用到临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全检测等方面。
然而，现有的荧光定量PCR检测用试剂，大多为液体试剂，运输时需要冷冻运输，运输成本极高。除此之外，液体试剂还需要冷冻保存，需现配现用，这样对实验人员的操作能力有一定要求，试剂使用时反复冻融对其稳定性也有一定影响。而冻干型荧光定量PCR检测用试剂不仅使运输更未方便，而且运输和保存成本也大大降低，相对于液体试剂具有明显的优势。然而，目前的冻干型试剂存复溶时间长，检测结果不准确的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用，具有快速自然复溶且检测结果准确的特点。
本发明提供一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用
本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂，是由以下反应体系经冷冻干燥后得到，所述反应体系为含质量百分含量4.5％～5.5％聚乙烯吡咯烷酮K30的qPCR检测用试剂。
优选的，所述qPCR检测用试剂为含8～12U/20μL化学修饰Taq酶、8～12U/20μL RNA酶抑制剂、95～105mM KAc、1.8～2.2mM MgAc、体积百分浓度0.09％～0.11％NP-40、9～11mM硫酸铵、5.5～6.5mM甜菜碱、0.1～1mM dNTP的72～78mM Tris-HCl缓冲液。
优选的，所述qPCR检测用试剂还含有2～4U/20μL逆转录酶。
优选的，所述冷冻干燥的条件为在-50℃冻干1～2h，然后真空干燥3h，逐渐升温，每升高10℃保持1h，直到升到25℃。
本发明提供了所述试剂在制备疾病诊断或食品安全检测的试剂盒中的应用。
优选的，所述疾病诊断包括人临床疾病诊断和/或动物疾病检测。
本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂盒，包括所述试剂和检测用引物探针组。
优选的，所述检测用引物包括冠状病毒N基因扩增引物探针、冠状病毒ORF基因扩增引物探针和内参基因扩增引物探针。
优选的，所述病毒N基因扩增引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针；
所述ORF基因扩增引物探针包括如SEQ ID NO:4所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针；
所述内参基因扩增引物探针包括如SEQ ID NO:7所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的探针。
本发明提供了所述试剂盒在食品安全检测中的应用。
本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂，以聚乙烯吡咯烷酮K30作为冻干保护剂与qPCR检测用试剂混合，使制备的试剂粉末达到快速自然溶解的目的。本发明实施例中以常用的冻干保护剂为对照，本发明制备的试剂能够在3d内达到自然复溶的目的，而甘露醇、海藻糖以及蔗糖的自然复溶时间长达5～9s，效果明显不及本发明提供的试剂的复溶效果。同时本发明提供的试剂与相同成分的液体试剂相比，能够达到相似的检测结果。可见，本发明提供的冻干型荧光定量PCR检测用试剂不仅自然复溶速度快，而且检测结果不受影响，满足冻干型试剂的要求，此外还能大大降低运输和保存的成分，具有极大的市场竞争力。
附图说明
图1为同一浓度下不同冻干保护剂的冻干试剂外观形态；
图2为本发明制备的冻干试剂和液体试剂的扩增曲线；
图3为本发明制备的冻干试剂、液体试剂以及对照试剂的扩增曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂，是由以下反应体系经冷冻干燥后得到，所述反应体系为含质量百分含量4.5％～5.5％聚乙烯吡咯烷酮K30的qPCR检测用试剂。
在本发明中，所述聚乙烯吡咯烷酮K30的质量百分含量优选为5％。所述聚乙烯吡咯烷酮K30与常规的冻干保护剂(蔗糖、海藻糖或甘露醇)相比，具有使检测试剂自然复溶速度快的特点。
在本发明中，所述qPCR检测用试剂优选为含8～12U/20μL化学修饰Taq酶、8～12U/20μL RNA酶抑制剂、95～105mM KAc、1.8～2.2mM MgAc、体积百分浓度0.09％～0.11％NP-40、9～11mM硫酸铵、5.5～6.5mM甜菜碱、0.1～1mM dNTP的72～78mM Tris-HCl缓冲液，更优选为含10U/20μL化学修饰Taq酶、10U/20μL RNA酶抑制剂、体积百分浓度0.10％NP-40、100mM KAc、2.0mM MgAc、10mM硫酸铵、6mM甜菜碱、0.4mM dNTP的75mM Tris-HCl缓冲液。所述化学修饰Taq酶购自北京丹大生物技术有限公司。硫酸铵和甜菜碱优选发挥扩增增强剂的作用，降低解链反应时的能量。
在本发明中，当所述试剂检测RNA样本时，所述qPCR检测用试剂还优选含有2～4U/20μL逆转录酶，更优选为3U/20μL逆转录酶。
在本发明中，所述冷冻干燥的条件优选为在-50℃冻干1～2h，然后真空干燥3h，逐渐升温，每升高10℃保持1h，直到升到25℃。本发明对所述冷冻干燥的仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的真空冷冻干燥仪即可。
本发明提供了所述试剂在制备疾病诊断或食品安全检测的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述疾病诊断优选包括人临床疾病诊断和/或动物疾病检测。本发明对所述人临床疾病诊断和/或动物疾病检测的具体种类没有特殊限制，针对所检测的目标病原体设计引物，结合本发明提供的试剂进行检测即可。
本发明提供了一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂盒，包括所述试剂和检测用引物探针组。
本发明对所述引物探针组的种类有没有特殊限制，根据人临床疾病诊断、动物疾病检测和/或食品安全相关的病原体设计引物探针即可。在本发明实施例中，以冠状病毒为例，加以说明所述试剂盒的检测结果。所述检测用引物优选包括冠状病毒N基因扩增引物探针、冠状病毒ORF基因扩增引物探针和内参基因扩增引物探针。所述病毒N基因扩增引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针；所述ORF基因扩增引物探针包括如SEQ IDNO:4所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示的探针；所述内参基因扩增引物探针包括如SEQ ID NO:7所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的探针。
本发明提供了所述试剂盒在食品安全检测中的应用。
本发明对所述检测方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的qPCR检测方法即可。在本发明实施例中，冠状病毒的检测方法，程序：50℃，10min；95℃，3min；95℃，10s，60℃，30s，45个循环。荧光通道：FAM、VIC和Cy5。检测结果表明采用冻干型试剂与液体试剂相比，在Ct值、信号值以及扩增曲线方面综合考虑，均具有相同或相似的检测结果。可见，本发明提供的试剂盒可替代液体试剂应用到荧光定量PCR检测中。
下面结合实施例对本发明提供的一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种冻干的荧光定量PCR试剂，试剂成分主要为：酶混合液、反应缓冲液、冻干保护剂等，具体见表1。
表1qPCR检测试剂MIX(20μL)
Figure BDA0003634618170000051
制备方法：将上述组分按表1配比配制完成后分装到PCR 8联管中，含有液体组分的PCR 8联管迅速没入液氮中，静置10s后拿出放置于已经预冷冻到-50℃的冷冻干燥机中，真空冷冻干燥机在-50℃保持1-2h，然后抽真空干燥3h，之后逐渐升温，每升高10℃保持1h，直到升到25℃。
冻干后的PCR8联管和干燥机一起真空密封包装，可常温保存。
对比例1～3
按照实施例1的方法制备冻干型qPCR检测试剂MIX，区别仅在于，用甘露醇、海藻糖和蔗糖分别替换聚乙烯吡咯烷酮K30。
实施例2
不同冻干保护剂下冻干试剂的复溶速度比较实验
将实施例1和对比例1～3制备的冻干试剂观察拍照。图1为同一浓度下不同冻干保护剂的冻干试剂外观形态。分别向8连管中添加相同体积的ddH2O，观察并记录自然复溶时间。结果见表2。
表2同一浓度下不同保护剂的冻干试剂加水自然复溶时间
保护剂 甘露醇 海藻糖 蔗糖 本发明
复溶时间 9s 5s 8s 3s
由表2结果可知，本发明采用聚乙烯吡咯烷酮K30作为冻干保护剂较常规的冻干保护剂在试剂自然复溶方面具有明显的优势。
实施例3
冻干试剂与未冻干试剂扩增效果对比
实验仪器与程序
实验仪器：SLAN全自动医用PCR分析系统-96P
实验程序：
Figure BDA0003634618170000061
荧光通道：FAM VIC Cy5。
实验步骤：按照表3配制反应体系。
表3根据下表配制单个反应体系
Figure BDA0003634618170000062
Figure BDA0003634618170000071
其中，RNA模板购自广州邦德盛生物科技有限公司生产的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸性能验证参考品，批号2021001。
N-Probe：5'-VIC-ACC CCG CAT TAC GTT TGG TGG ACC-BHQ1-3'(SEQ ID NO:1)；
N-Primer-F：GAC CCCAAAATCAGC GAAAT(SEQ ID NO:2)
N-Primer-R：TCT GGT TAC TGC CAG TTGAAT CTG(SEQ ID NO:3)；
ORF-Probe：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'(SEQ ID NO:4)；
ORF-Primer-F：CCC TGT GGG TTT TACACT TAA(SEQ ID NO:5)；
ORF-Primer-R：ACGATTGTGCATCAGCTGA(SEQ ID NO:6)；
cov-Probe：cy5-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ3(SEQ ID NO:7)；
cov-Primer-F：AGATTTGGACCTGCGAGCG(SEQ ID NO:8)；
cov-Primer-R：GAGCGGCTGTCTCCACAAGT(SEQ ID NO:9)。
(2)配制完成的PCR8连管涡旋混匀15s，短暂离心后上机测定。
实验结果分析
(1)Ct值结果见表4。
表4冻干试剂和液体试剂对各基因的检测Ct值
冻干试剂 液体试剂
ORF基因 33.92 33.80
N基因 33.06 33.43
内参基因 27.98 28.19
(2)信号值见表5。
表5冻干试剂和液体试剂对各基因的检测信号值
Figure BDA0003634618170000072
Figure BDA0003634618170000081
(3)扩增曲线见图2。
由上述结合可知，冻干试剂与液体试剂相比，检测结果较为相似。
实施例4
冻干试剂与未冻干试剂置于37℃下放置15天扩增效果对比实验实验仪器与程序如下：
实验仪器：SLAN全自动医用PCR分析系统-96P
实验程序：
Figure BDA0003634618170000082
荧光通道：FAM VIC Cy5。
对照试剂：-20℃储存的液体试剂。
实验步骤
表6根据下表配制单个反应体系
Figure BDA0003634618170000083
Figure BDA0003634618170000091
(2)配制完成的PCR 8连管涡旋混匀15s，短暂离心后上机测定。
实验结果分析
(1)Ct值见表7。
表7 3种试剂的检测Ct值
基因种类 冻干试剂 液体试剂 对照试剂
ORF基因 33.56 34.2 33.16
N基因 33.31 33.35 33.24
内参基因 30.93 31.01 30.82
(2)信号值见表8。
表8 3种试剂的检测信号值
基因种类 冻干试剂 液体试剂 对照试剂
ORF基因 1.05 0.95 1.01
N基因 1.11 1.06 1.13
内参基因 1.49 1.47 1.48
(3)扩增曲线
扩增曲线见图3。
液体试剂经过37℃放置15d后，扩增效率有明显下降，而本发明冻干试剂以及-20℃下保存的液体试剂具有相似的扩增效率。这表明，本发明提供的冻干试剂具有良好的稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京丹大生物技术有限公司
<120> 一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂及制备方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accccgcatt acgtttggtg gacc 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccccaaaa tcagcgaaat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctggttact gccagttgaa tctg 24
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagcggctgt ctccacaagt 20

Claims (10)

1.一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂，其特征在于，是由以下反应体系经冷冻干燥后得到，所述反应体系为含质量百分含量4.5％～5.5％聚乙烯吡咯烷酮K30的qPCR检测用试剂。
2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，所述qPCR检测用试剂为含8～12U/20μL化学修饰Taq酶、8～12U/20μL RNA酶抑制剂、95～105mM KAc、1.8～2.2mM MgAc、体积百分浓度0.09％～0.11％NP-40、9～11mM硫酸铵、5.5～6.5mM甜菜碱、0.1～1mM dNTP的72～78mMTris-HCl缓冲液。
3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，所述qPCR检测用试剂还含有2～4U/20μL逆转录酶。
4.根据权利要求1～3任意一项所述试剂，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为在-50℃冻干1～2h，然后真空干燥3h，逐渐升温，每升高10℃保持1h，直到升到25℃。
5.权利要求1～4任意一项所述试剂在制备疾病诊断或食品安全检测的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述疾病诊断包括人临床疾病诊断和/或动物疾病检测。
7.一种冻干型荧光定量PCR检测用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项所述试剂和检测用引物探针组。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述检测用引物包括冠状病毒N基因扩增引物探针、冠状病毒ORF基因扩增引物探针和内参基因扩增引物探针。
9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述病毒N基因扩增引物探针包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的探针；
所述ORF基因扩增引物探针包括如SEQ ID NO:4所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的探针；
所述内参基因扩增引物探针包括如SEQ ID NO:7所示的正向引物、核苷酸序列如SEQID NO:8所示的反向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的探针。
10.权利要求7～9任意一项所述试剂盒在食品安全检测中的应用。
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