CN114854803A - 镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种镰刀菌对3,6‑二氯咔唑生物降解的方法，该降解方法包括以下步骤：（1）筛选出能够以3,6‑二氯咔唑为唯一碳源生长的菌株；（2）将筛选的的菌株扩大培养，收集扩大培养后的菌体，将菌体接种至灭菌的MSM液体培养基进行培养；（3）筛选出3,6‑二氯咔唑高效降解菌株，将降解菌保藏备用；（4）将保藏的降解菌制成孢子悬液；（5）调整含有3,6‑二氯咔唑的环境介质的PH值为5.0‑9.0，温度为20℃‑40℃，并在孢子悬液中加入碳源，然后将孢子悬液接种至含有3,6‑二氯咔唑的环境介质中。本发明从土壤中筛选3,6‑二氯咔唑高效降解菌，为3,6‑二氯咔唑的降解提供了一种更有效的方法。

Description

镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，尤其涉及一种镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法。
背景技术
卤代咔唑是咔唑环上的氢原子被卤素原子取代的一种化合物。近年来，卤代咔唑在自然 环境中的检出率越来越高，才作为一类新型污染物逐渐引起研究者的重视。
卤代咔唑在环境中分布广泛，特别是在河流湖泊的沉积物、土壤以及一些生物样品中能 检测出较高浓度的卤代咔唑。基于卤代咔唑的生物累积性、持久性和类二恶英毒性，亟待寻 找关于卤代咔唑的降解及污染环境修复的方法。目前已有关于卤代咔唑光降解及化学氧化分 解等修复方法，但对于修复土壤和沉积物的卤代咔唑污染有一定的局限性。利用微生物降解 有机物的方法不仅成本低，且对环境产生的二次污染较小，近年来，越来越多的人通过筛选 出能够以目标污染物为唯一碳源的降解菌，利用降解菌的代谢活动降解污染物。微生物修复 可以作为修复环境中卤代咔唑污染的有效补充手段，然而目前关于3,6-二氯咔唑这一污染物 的微生物降解方法仍为空白。
发明内容
本发明目的是提供一种镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，该方法是从土壤中筛选 降解菌，并将降解菌投放到含有3,6-二氯咔唑的环境介质中，为3,6-二氯咔唑的降解提供了 一种更有效的方法，该方法对3,6-二氯咔唑的去除效果显著。
为了实现上述目的，本发明是采用以下技术方案实现的：
一种镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，该降解方法包括以下步骤：
（1）将受3,6-二氯咔唑污染的土壤加入到 MSM 液体培养基中，筛选出能够以3,6-二氯 咔唑为唯一碳源生长的菌株；
（2）将步骤（1）中筛选的的菌株在LB固体培养基上活化，挑取菌株至已灭菌的LB液体培养基扩大培养，收集扩大培养后的菌体，用已灭菌的MSM液体培养基清洗并重悬若干次， 将最后一次重悬的菌体接种至灭菌的 MSM液体培养基进行培养；
（3）对步骤（2）的MSM液体培养基的菌落取样，提取并检测MSM液体培养基中残留的3,6-二氯咔唑含量，计算各菌株降解率，直至筛选出 3,6-二氯咔唑高效降解菌株，将降解菌 保藏备用；
（4）利用步骤（3）中保藏的降解菌制成孢子悬液；
（5）调整含有3,6-二氯咔唑的环境介质的PH值为5.0-9.0，温度20℃-40℃，并在上述孢子悬液中加入碳源，然后将孢子悬液接种至含有3,6-二氯咔唑的环境介质中。
进一步的，步骤（1）中菌株富集和纯化的方法：在30℃和180 r/min的摇床中培养5d， 5d 后取5.00 mL富集培养液的上清液转接至新的含100.00 mg/L 3,6-二氯咔唑的MSM液体培养基中，重复操作3次，取最后一次富集的培养液1.00 mL加入灭菌的去离子水中，按照10-1、10-2、10-3的比例进行逐级梯度稀释，吸取稀释后的培养液50.00μL涂布于含3,6-二氯咔唑100.00mg/L 的MSM固体培养基中，将其倒置于30℃培养箱中培养；待菌落形成后，用灭菌牙签挑取不同形态的单菌落在LB固体培养基中划线，经过反复的挑选分离，直至分离出纯菌。
进一步的，所述MSM液体培养基的制作方法：以1000mL去离子水计，称取硫酸铵1.00g、氯化钠1.00g、磷酸氢二甲1.50g、磷酸二氢钾0.50g、硫酸镁0.20g，加入1000mL去离子水中溶解，再加入1.00mL微量元素溶液，用氢氧化钠调节pH至7.0左右，121℃高温高压灭菌30 min；
所述MSM固体培养基的制作方法：在MSM液体培养基基础上添加琼脂粉制成；所述微量元素溶液的制备方法：以1000 mL去离子水计，称取钼酸钠0.15g、一水硫酸锰0.13g、结晶氯化铝0.05g、氯化锌0.23g、一水硫酸铜0.03g、六水合氯化钴0.42g，加1000mL去离子水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH至7.0左右。
进一步的，所述 LB 液体培养基的制作方法：以1000mL去离子水计，向氯化钠10.00g、酵母浸膏5.00g、蛋白胨10.00g，加1000mL去离子水溶解，用氢氧化钠调节pH 至7.0左 右，121℃高温高压灭菌30 min；
所述LB固体培养基的制作方法：在LB液体培养基基础上添加琼脂粉制成。
进一步的，步骤（2）中，LB液体培养基扩大培养的条件：在30℃，180r/min的条件下扩大培养3d；收集扩大培养后的菌体的方法：在20℃，5000r/min条件离心5min收集 菌体。
进一步的，步骤（2）中的MSM液体培养基培养的条件：调整菌液浓度为OD600 = 1.0左右，使培养基中3,6-二氯咔唑浓度为10.00mg/L，在30℃，180r/min的条件下培养8d。
进一步的，步骤（3）中降解菌的保藏方法：配制质量分数30%的甘油，取30%的甘油加入冻存管中，将甘油以及冻存管121℃高温高压灭菌30min后，加入与甘油等体积的菌液，将液体充分混匀后密封，冷冻保存在-40℃的冰箱备用。
进一步的，步骤（4）中孢子悬液的制备方法：将冻存的菌株冰浴解冻，在无菌室中用灭 菌过的牙签蘸取适量菌液，在PDA固体培养基中进行平板划线，将划线后的平板倒扣在生化培养箱中培养，直至长出丰富的白色分生孢子，用牙签刮取平板表面的孢子至灭菌后的MSM液体培养基，涡旋振荡使菌丝在培养基溶液中分布均匀，使孢子悬液的OD600 =0.16 ~ 0.165。
进一步的，所述PDA固体培养基的制备方法：以1000mL去离子水计，取马铃薯200.00g、葡萄糖20.00g、琼脂粉15.00g，加1000mL去离子水溶解，121℃高温高压灭菌30min。
进一步的，步骤（5）中接种环境最适降解条件为：温度为30℃，pH为7.0，孢子悬液外加碳源为1 g/L蔗糖溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从土壤中分离得到了一株3,6-二氯咔唑高效降解菌，经鉴定为镰刀菌，经过降解条件优化，镰刀菌 K1对10.00 mg/L3,6-二氯咔唑的8d降解率达到84%，为环境中卤代咔唑污染提供了新的修复方法，并且通过对3,6-二氯 咔唑降解产物的测定，推测镰刀菌K1对3,6二氯咔唑的降解存在脱氯和有角度双加氧两种途径，其中有角度双加氧途径是降解菌K1分解利用3,6-二氯咔唑的主要途径，为卤代咔唑在 环境中生物转化的认知做了有效补充。
附图说明
图 1 为本发明镰刀菌 K1 菌落图。
图 2 为本发明镰刀菌 K1 扫描电镜图片。
图 3 为本发明镰刀菌 K1 与同源菌株的进化关系。
图 4 为初始 pH 值对镰刀菌 K1 降解能力的影响。
图 5 为温度对镰刀菌 K1 降解能力的影响。
图 6 为外加碳源对镰刀菌 K1 降解能力的影响。
图 7 为本发明中 3,6-二氯咔唑降解产物离子图。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明进行进一步描述，本实施案例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述 的实施案例。
实施例 1：本实施例提供了一种镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，该降解方法包括以下步骤：
（1）本实施例所筛选到的菌种来源于土壤，实验土壤采集于山东省滨州市某农药厂周边 排污口附近的农田土壤以或实验室中用 100.00 mg/L3,6-二氯咔唑污染驯化 120d 的土壤。 称取菌种土壤 5 g，加入到 50.00 mL 的含3,6-二氯咔唑 100.00 mg/L 的MSM 液体培养基中， 通过富集和纯化筛选出能够以3,6-二氯咔唑为唯一碳源生长的菌株。
其中，富集和纯化的方法：在 30℃和 180 r/min 的摇床中培养 5 d，5 d 后取5.00 mL富集培养液的上清液转接至新的含 100.00 mg/L3,6-二氯咔唑的 MSM 液体培养基中，重复操作3次，取最后一次富集的培养液 1.00 mL 加入灭菌的去离子水中，按照 10-1、10-2、10-3的 比例进行逐级梯度稀释，吸取稀释后的培养液 50.00 μL 涂布于含3,6-二氯咔唑 100.00 mg/L 的 MSM 固体培养基中，将其倒置于 30℃培养箱中培养；待菌落形成后，平板培养基上生长有 各种形态的菌落，用灭菌牙签挑取不同形态的单菌落在 LB 固体培养基中划线，经过反复的挑 选分离，直至分离出纯菌，获得能够以3,6-二氯咔唑为唯一碳源生长的菌株。
MSM 液体培养基（无机盐培养基）的制作方法：以 1000 mL 去离子水计，称取硫酸铵 1.00 g、氯化钠 1.00 g、磷酸氢二甲 1.50 g、磷酸二氢钾 0.50 g、硫酸镁 0.20 g，加入 1000 mL 去离子水溶解，再加入 1.00 mL 微量元素溶液，用氢氧化钠调节 pH 至 7.0左右，121℃高温 高压灭菌 30 min；
MSM 固体培养基的制作方法：在 MSM 液体培养基基础上添加 18 g 琼脂粉制成。
微量元素溶液的制备方法：以 1000 mL 去离子水溶液计，称取钼酸钠 0.15 g、一水硫酸 锰 0.13 g、结晶氯化铝 0.05 g、氯化锌 0.23 g、一水硫酸铜 0.03 g、六水合氯化钴 0.42 g，加 1000 mL 去离子水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 7.0 左右。
（2）将步骤（1）中筛选的菌株在 LB 固体培养基上活化，挑取菌株至已灭菌的 LB液体 培养基扩大培养，在 30℃，180 r/min 的条件下扩大培养3 d，于 20℃，5000 r/min条件离 心 5 min 收集菌体，用等体积已灭菌的 MSM 液体培养基清洗并重悬两次，将最后一次重悬的 菌体接种至灭菌的 MSM 液体培养基，调整菌液浓度为 OD600 = 1.0 左右，使培养基中,6-二氯咔唑浓度为 10.00 mg/L，30℃，180 r/min 的条件下培养 8 d。
LB 液体培养基（Luria-Bertani 培养基）的制作方法：以 1000 mL 去离子水溶液计，向 氯化钠 10.00 g、酵母浸膏 5.00 g、蛋白胨 10.00 g，加 1000 mL 去离子水溶解，用氢氧 化钠调节 pH 至 7.0 左右，121℃高温高压灭菌 30 min。 LB 固体培养基的制作方法：在 LB 液体培养基基础上 18 g 添加琼脂粉制成。
（3）对步骤（2）的 MSM 液体培养基的菌落在 8 d 时取样，提取并采用气相色谱-质谱联 用仪检测 MSM 中残留的3,6-二氯咔唑，计算各菌株降解率，直至筛选出3,6-二氯咔唑高效降 解菌，将降解菌保藏备用。
3,6-二氯咔唑降解菌的保藏方法：为了使筛选出的降解菌能够长时间保存并且能够在活 化后能恢复细菌活性，本实施例使用甘油保藏法将筛选分离出的降解菌进行保存。配制质量分数 30%的甘油，取 1.00 mL30%的甘油加入 2 mL 冻存管中，将甘油以及冻存管121℃高温高 压灭菌 30 min 后，加入 1.00 mL 菌液，将液体充分混匀后密封，冷冻保存在-40℃的冰箱备用。
（4）利用步骤（3）中保藏的降解菌制备孢子悬液。
孢子悬液制备方法：将冻存在-40℃冰箱中的菌株冰浴解冻，在无菌室中用灭菌过的牙签 蘸取适量菌液，在 PDA 固体培养基中进行平板划线，将划线后的平板倒扣在 30℃的生化培养 箱中培养，直至长出丰富的白色分生孢子。用牙签刮取平板表面的孢子至灭菌后的 MSM 液体 培养基，涡旋振荡使菌丝在培养基溶液中分布均匀制成孢子悬液，使孢子悬液的 OD600 = 0.16 ～0.165 左右。
（5）调整含有3,6-二氯咔唑的环境介质的 PH 值为 7.0，温度为 30℃，并在上述孢子悬液中加入 1 g/L 的蔗糖作为碳源，然后将孢子悬液接种至含有3,6-二氯咔唑的环境介质中。
3,6-二氯咔唑降解菌的鉴定：
I．3,6-二氯咔唑降解菌的形态学观察：
将保藏的高效降解菌在 LB 固体培养基上活化，挑选培养过程中长势较好、菌落外观生长 形状丰满的细菌单菌株进行形态学观察。肉眼观察细菌的大小、形状、颜色、透明度等形态 学特征。经观察该降解菌菌落呈圆形，白色绒毛状，参见图1。
II．3,6-二氯咔唑降解菌的扫描电镜观察：
①样品制备：将筛选的高效降解菌株在 LB 液体培养基中扩大培养 3 d，5000r/min 离心 5 min 收集菌体至 1.5 mL 离心管中，加入锇酸固定，放入 4 ℃冰箱保存过夜，将菌株充分固定。
②样品前处理：将固定了一夜的菌株用 PBS 缓冲液冲洗 5 次，每次静置时间为20 min， 冲洗前将菌株在 5000 r/min 离心 5 min。冲洗结束后分别用 45%、55%、75%、85%、95%、100% 的乙醇脱水，每次脱水时间为 30 min，将菌株在 100%乙醇中脱水并放入 4℃冰箱保存过夜。 最后加入醋酸异戊酯溶液置换，每次 20 min，共置换两次。
③CO2 临界点干燥：利用菌体在临界状态下表面系数张力为零，能够 最大限度保持菌体 的自然形态。将干燥了的样品粘贴到样品台上，方便后续操作。
④离子喷涂：将处理后的样品用低真空镀膜仪喷金镀膜，使用扫描电子显微镜观察（蔡 司场发射）进行扫描观察并拍照留存，参见图2。
III．3,6-二氯咔唑降解菌 ITS 鉴定：
将保存的降解菌活化后在 LB 固体培养基上划线扩大培养，选取长势良好的细菌，将降解菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行菌株 ITS 测序，鉴定菌株的种属。经菌株 ITS 测序鉴定，K1 菌鉴定为镰刀菌，命名为镰刀菌 K1，参见图3。
3,6-二氯咔唑降解菌的降解特性：
I． 不同初始 pH 值对降解菌降解 3,6-二氯咔唑的影响，参见图4：
配制不同初始 pH 的 MSM 培养基，调节 pH 分别为 5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0，不同 pH 条件下各 150 mL，接种降解菌调整降解液吸光度至 OD600 = 0.16 左右，使降解液中 3,6-二氯 咔唑浓度为 10.00 mg/L，于 30℃, 180 r/min 条件下的摇床中培养，以不接种降解菌的培养 基为对照，每个pH 条件下设置三组平行，8 d 后取样用 GC-MS 测定剩余 3,6-二氯咔唑含量。 计算降解率，确定最佳降解 pH 条件为 pH=7.0。
II．不同温度条件对镰刀菌 K1 降解3,6-二氯咔唑的影响，参见图 5：
配制初始 pH 值为 7.0 的 MSM 培养基，接种降解菌调整降解液吸光度至 OD600= 0.16 左右， 使降解液中3,6-二氯咔唑浓度为 10.00 mg/L，分别在 20℃、25℃、30℃、35℃和 40℃的温 度条件，180 r/min 的摇床中培养，以不接种降解菌的培养基为对照，每个温度设置三组平 行，8 d 后取样用 GC-MS 测定剩余3,6-二氯咔唑含量。计算降解率，确定最佳降解温度条件 为 30℃。
III．不同外加碳源对镰刀菌 K1 降解3,6-二氯咔唑的影响，参见图6：
配制初始 pH 值为 7.0 的 MSM 培养基，接种降解菌调整降解液吸光度至 OD600= 0.16 左右， 使降解液中3,6-二氯咔唑浓度为 10.00 mg/L，分别加入 1 g/L、1 g/L、2g/L 的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作为外加碳源，在 30℃、180 r/min 的摇床中培养，以不接种降解菌的培养 基为对照，不同外加碳源条件设置三组平行，8 d 后取样用 GC-MS 中检测剩余 3,6-二氯咔唑 的含量。计算降解率，确定镰刀菌 K1 的最佳外加碳源为添加 1g/L 的蔗糖。
3,6-二氯咔唑降解产物分析：
参见图7，本实施例中对菌株 K1 降解3,6-二氯咔唑降解产物提取分别用二氯甲烷提取和 用乙腈提取，提取后用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）定性分析。
利用二氯甲烷提取降解产物的前处理方法为：将高效降解菌接种配制降解液，在最佳 pH， 最适温度以及加入 1 g/L 蔗糖外加碳源条件下培养，以不加 3,6-二氯咔唑的样品为对照，分 别在降解前期（3 d）、降解中期（6 d）取样和降解后期（9 d）取样。取 1.00mL 降解液， 于 10 mL 离心管中，加入 2.00 mL 色谱二氯甲烷，涡旋 10 min 后在 4℃、6000 r/min 条件下 离心 5 min 使体系分层，吸取下层有机相，重复此提取步骤 3 次，将提取出的有机相定容到 10.00 mL，用高纯氮气氮吹干后用 5.00 mL 丙酮复溶，过 0.22 μm 有机滤头后用 GC-MS 检测。 经鉴定，二氯甲烷提取到的降解产物为 3-氯咔唑。
利用乙腈提取降解产物的前处理方法为：将高效降解菌接种配制降解液，在最佳pH，最 适温度以及加入 1 g/L 蔗糖外加碳源条件下培养，以不加3,6-二氯咔唑的样品为对照，分别 在降解前期（3 d）、降解中期（6 d）取样和降解后期（9 d）取样。取 1.00 mL 降解液，于 10 mL 离心管中，加入 2.00 mL 乙腈，涡旋 10 min 后加入 1.00 g NaCl 盐析，在 4℃、6000 r/min 条件下离心 5 min 使体系分层，吸取上层有机相，重复此提取步骤 2次，将提取出的有机相 过 0.22 μm 有机滤头后用 GC-MS 检测。经 GC-MS 鉴定识别到（E）-4-氯-2-羟基戊-2,4-二烯 酸、2-氨基-5-氯-3,4-二羟基苯甲酸、3-氯咔唑和（2E,4E）-6-（2-氨基-5-氯-3,4-二羟基 苯基）-4-氯-2-羟基-6-氧代六-2,4-二烯酸四种主要的降解产物，推测镰刀菌 K1 对3,6二氯 咔唑的降解存在脱氯和有角度双加氧两种途径，其中有角度双加氧途径是降解菌 K1 分解利用 3,6-二氯咔唑的途径。
利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）定性分析降解产物，质谱仪检测条件为：色谱柱为 TG-5MS（30m*0.25mm*0.25μm）。3,6-二氯咔唑通过选择离子监测（SIM）模式检测，扫描质荷比范围为 20 ~500 m/z。GC 进样器以脉冲不分流模式运行，升温程序设定初始温度为80℃， 保留 3 min，以 10℃/min 升至 150℃，再以 5℃/min 升至 250℃，保留 10 min，最后以 5℃ /min 升温至 300℃，保留 10 min。进样口温度、柱箱温度、四极杆温度、离子源分别为 280 ℃、80℃、250℃、230℃。每次进样量为 2.00 μL，载气为高纯氦气，载气流速为 1.20 mL/min。 实施例 2：本实施例与实施例 1 基本相同，其不同之处在于：步骤（5）中含有3,6-二氯 咔唑的环境介质的PH 值为 5.0，温度为 20℃，并在孢子悬液中加入 1 g/L的葡萄糖作为碳源。
实施例3：本实施例与实施例 1 基本相同，其不同之处在于：步骤（5）中含有3,6-二氯 咔唑的环境介质的 PH 值为 9.0，温度为 40℃，并在孢子悬液中加入 2 g/L 的可溶性淀粉作为碳源。

Claims (10)

1.一种镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：该降解方法包括以下步骤：
（1）将受 3,6-二氯咔唑污染的土壤加入到 MSM 液体培养基中，通过富集和纯化筛选出 能够以 3,6-二氯咔唑为唯一碳源生长的菌株；
（2）将步骤（1）中筛选的的菌株在 LB 固体培养基上活化，挑取菌株至已灭菌的 LB 液体培养基扩大培养，收集扩大培养后的菌体，用已灭菌的 MSM 液体培养基清洗并重悬若干次， 将最后一次重悬的菌体接种至灭菌的 MSM 液体培养基进行培养；
（3）对步骤（2）中 MSM 液体培养基的菌落取样，提取并检测 MSM 液体培养基中残留的3,6-二氯咔唑含量，计算各菌株降解率，直至筛选出 3,6-二氯咔唑高效降解菌株，将降解菌 保藏备用；
（4）利用步骤（3）中保藏的降解菌制成孢子悬液；
（5）调整含有 3,6-二氯咔唑的环境介质的 PH 值为 5.0-9.0，温度为 20℃-40℃，并在 上述孢子悬液中加入碳源，然后将孢子悬液接种至含有 3,6-二氯咔唑的环境介质中。
2.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤（1）中菌株富集和纯化的方法：在 30℃和 180 r/min 的摇床中培养 5 d，5 d 后取 5.00mL 富集培养液的上清液转接至新的含 100.00 mg/L 3,6-二氯咔唑的 MSM 液体培养基中，重复操 作 3 次，取最后一次富集的培养液 1.00 mL 加入灭菌的去离子水中，按照10-1、10-2、10-3的 比例进行逐级梯度稀释，吸取稀释后的培养液 50.00 μL 涂布于含 3,6-二氯咔唑 100.00 mg/L 的 MSM 固体培养基中，将其倒置于 30℃培养箱中培养；待菌落形成后，用灭菌牙签挑取不同 形态的单菌落在 LB 固体培养基中划线，经过反复的挑选分离，直至分离出纯菌。
3.根据权利要求 2 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于： 所述 MSM 液体培养基的制作方法：以 1000 mL 去离子水计，称取硫酸铵 1.00 g、氯化钠1.00 g、磷酸氢二甲 1.50 g、磷酸二氢钾 0.50 g、硫酸镁 0.20 g，加入 1000 mL 去离子水 溶解，再加入 1.00 mL 微量元素溶液，用氢氧化钠调节 pH 至 7.0 左右，121℃高温高压灭菌 30 min；
所述 MSM 固体培养基的制作方法：在 MSM 液体培养基基础上添加琼脂粉制成；
所述微量元素溶液的制备方法：以 1000 mL 去离子水计，称取钼酸钠 0.15 g、一水硫酸 锰 0.13 g、结晶氯化铝 0.05 g、氯化锌 0.23 g、一水硫酸铜 0.03 g、六水合氯化钴0.42 g，加 1000 mL 去离子水溶解，用氢氧化钠或盐酸调节 pH 至 7.0 左右。
4. 根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于： 所述 LB 液体培养基的制作方法：以 1000 mL 去离子水计，向氯化钠 10.00 g、酵母浸膏5.00 g、蛋白胨 10.00 g，加 1000 mL 去离子水溶解，用氢氧化钠调节 pH 至 7.0 左右，121 ℃高温高压灭菌 30 min； 所述 LB 固体培养基的制作方法：在 LB 液体培养基基础上添加琼脂粉制成。
5. 根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤 （2）中， LB 液体培养基扩大培养的条件：在 30℃，180 r/min 的条件下扩大培养 3 d；收集扩大培养后的菌体的方法：在 20℃，5000 r/min 条件离心 5 min 收集菌体。
6.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤（2）中，MSM 液体培养基培养的条件：调整菌液浓度为 OD600 = 1.0 左右，使培养基中 3,6- 二氯咔唑浓度为 10.00 mg/L，在 30℃，180 r/min 的条件下培养 8 d。
7.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤（3）中降解菌的保藏方法：配制质量分数 30%的甘油，取 30%的甘油加入冻存管中，将甘油以及冻存管 121℃高温高压灭菌 30 min 后，加入与甘油等体积的菌液，将液体充分混匀后密 封，冷冻保存在-40℃的冰箱备用。
8.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤（4）中孢子悬液的制备方法：将冻存的菌株冰浴解冻，在无菌室中用灭菌过的牙签蘸取适量菌液，在 PDA 固体培养基中进行平板划线，将划线后的平板倒扣在生化培养箱中培养，直至 长出丰富的白色分生孢子，用牙签刮取平板表面的孢子至灭菌后的 MSM 液体培养基，涡旋振 荡使菌丝在培养基溶液中分布均匀，使孢子悬液的 OD600 = 0.16～0.165。
9.根据权利要求 8 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：所述PDA 固体培养基的制备方法：以 1000 mL 去离子水计，取马铃薯 200.00 g、葡萄糖 20.00g、 琼脂粉 15.00 g，加 1000 mL 去离子水溶解，121℃高温高压灭菌 30 min。
10.根据权利要求 1 所述的镰刀菌对3,6-二氯咔唑生物降解的方法，其特征在于：步骤 （5）中接种环境最适降解条件为：温度为 30℃，pH 为 7.0，孢子悬液外加碳源为 1 g/L蔗 糖溶液。
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