CN110607237A - 一种镰刀菌孢子的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种镰刀菌孢子的保存方法，涉及植物保护技术领域，包括如下步骤：以镰刀菌菌株为原材料进行镰刀菌孢子的培养，得到镰刀菌菌液；对镰刀菌菌液进行过滤，对滤液进行离心后，去除上清液，得到镰刀菌孢子；将镰刀菌孢子的浓度调至工作浓度，得到工作菌液；取工作体积的工作菌液装至第二离心管内，离心，去除上清液，得到孢子沉淀物；将第二离心管风干，得到干燥的孢子沉淀物；将第二离心管密封，于‑20℃条件下保存。本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法，保存的镰刀菌孢子，一方面可以作到随用随取，另一方面使用过程中不需要重新计算加入的双蒸水的体积，且制备的工作菌液中镰刀菌孢子的浓度可控，快捷方便，省时省力。

Description

一种镰刀菌孢子的保存方法

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，具体而言，涉及一种镰刀菌孢子的保存方法。

背景技术

镰刀菌(Fusarium)广泛存在于各种环境中，普遍存在于土壤及动植物有机体内，在地理分布上极为广泛；镰刀菌易侵染多种作物，尤其是粮食作物，例如，镰刀菌的侵染可造成小麦赤霉病、小麦根腐病和玉米穗腐病的发生。同时，镰刀菌在侵染过程中会产生多种毒素，包括单端孢霉烯族化合物、烟曲霉菌毒素、玉米赤霉烯酮等，这些毒素通过饲料、食品等途径进入人类食物链，给食品安全带来很大隐患(Bai G H,Plattner R,Desjardins A,et al.Resistance to Fusarium head blight and deoxynivalenol accumulation inwheat[J].Plant Breeding,2001,120(1):1-6.)。

目前由镰刀菌引起的小麦赤霉病在我国发病面积不断扩大，危害程度日益加重，培育和利用抗赤霉病小麦品种迫在眉睫，而对种质资源或育成品种(系)进行人工抗性鉴定则是培育和利用抗赤霉病品种的基础。小麦赤霉病的人工接种鉴定在小麦扬花期进行，因不同小麦品种的扬花期差异较大，因此小麦赤霉病抗性鉴定期间需要随时提供一定量活力强的镰刀菌孢子；目前在小麦赤霉病抗性鉴定期间，需要通过对镰刀菌菌株进行不间断的活化和摇菌，随时提供新鲜、活力强的孢子，这种方法费时费力，同时镰刀菌于室内连续多代移植培养会导致菌株的活力和致病性衰弱，而影响批次间和年度间鉴定结果的准确性和稳定性。

前人对镰刀菌长时间保持活力进行了一些研究，段双科等尝试“一次制种，多年应用”，将小麦赤霉病菌制备成小米粒菌体，置4℃冰箱环境中长期保存，结果表明，小麦赤霉菌小米粒菌体在4℃冰箱环境中可长期保存，7年之久仍有活力，且其田间致病性没有发生衰退(段双科,李宁,吴兴元,杨英.小麦赤霉病菌种保存及致病性研究[J].西北农业学报,2003(04):38-42.)；但这种方法制备小米粒菌体过程较为繁琐，而且在后期接种过程中虽然不需要重新活化，但接种量不易控制(作者描述为一个小米粒菌体的接种量，一是接种体积不易控制，米粒及附着基质有大有小，二是相同体积米粒带菌量的一致性不易控制)。

徐素珍等利用麦穗和麦粒作为保存基质，4℃下可保存13年，菌株的每代菌丝体和分生孢子存活率为100％，培养性状及产孢能力正常(徐素珍,陆仕华,周世明,陆金萍,魏春妹.致病产毒禾谷镰刀菌株的保存方法[J].上海农业学报,1992(02):55-59)，但这种方法需要重新活化，需要较长时间才能得到合适浓度和有活力的菌液。

因此，需建立一种更为简便的保持镰刀菌活力的方法，该方法的确立可为抗赤霉病种质资源的筛选和抗赤霉病小麦新品种的培育等研究提供方法基础。

发明内容

本发明解决的问题是目前保存的镰刀菌在使用时需要重新活化，费时较长。

为解决上述问题，本发明提供一种镰刀菌孢子的保存方法，包括如下步骤：

S1：以镰刀菌菌株为原材料，以绿豆汤为培养基，进行镰刀菌孢子的培养，得到镰刀菌菌液；

S2：对所述镰刀菌菌液进行过滤，将滤液进行离心后，去除上清液，得到所述镰刀菌孢子；

S3：利用双蒸水，通过血球计数板将所述镰刀菌孢子的浓度调至工作浓度，得到工作菌液；

S4：取工作体积的所述工作菌液装至第二离心管内，离心，去除上清液，得到孢子沉淀物；

S5：将所述第二离心管风干，得到干燥的所述孢子沉淀物；

S6：将所述第二离心管密封，于-20℃条件下保存。

通过镰刀菌菌株来培养镰刀菌孢子，得到含有镰刀菌孢子的镰刀菌菌液；经过滤，去除得到的镰刀菌菌液中体积较大的杂质，得到含有镰刀菌孢子的滤液；为保证过滤效果，本发明优选利用四层无菌纱布对镰刀菌菌液进行过滤；将含有镰刀菌孢子的滤液加入至离心管内，本文记为第一离心管，对得到的滤液进行离心操作，在离心力的作用下，使镰刀菌孢子与液体分离，镰刀菌孢子沉积于第一离心管的底部；将第一离心管上部的清液去除后，即可在第一离心管的底部得到孢子沉淀物。

本发明通过镰刀菌菌株培养出镰刀菌孢子，并将制备的镰刀菌孢子进行分离，对分离出的镰刀菌孢子进行保存，以便于后期需要使用镰刀菌孢子时，直接将保存的镰刀菌孢子取出使用即可，不需再通过重新活化来得到有活力的镰刀菌孢子，方便快捷，随用随取，极大地缩短了制备适合浓度的有活力的镰刀菌菌液的时间。

为便于简化使用镰刀菌液时的配制过程，在对镰刀菌孢子进行保存之前，首先通过双蒸水(ddH₂O)来对镰刀菌孢子的浓度进行调节，将镰刀菌孢子的浓度调节至工作浓度，即使用该菌液进行接种时需要的浓度，得到工作菌液。

取工作体积的工作菌液装至第二离心管内，其中该工作体积即为使用该菌液进行接种时需要的体积；对第二离心管内的工作菌液进行离心，使得第二离心管内的镰刀菌孢子与双蒸水分离，镰刀菌孢子在第二离心管的底部沉淀，去除第二离心管上部的清液，即可在第二离心管底部得到镰刀菌孢子，即孢子沉淀物。

进一步将第二离心管放置于已灭菌的超净工作台内进行风干，直至孢子沉淀物完全干燥，得到干燥的孢子沉淀物；为缩短对孢子沉淀物进行风干的时间，进行风干时，优选将风干的风速调至最大风速。孢子沉淀物完全风干后，将第二离心管密封，于-20℃条件下保存即可。

其中对第二离心管进行密封的方式可以为通过封口膜来进行密封。

由于本发明直接对制备的镰刀菌孢子进行保存，保存过程中未引入其他介质，不仅前期制备方法简便，易于操作，而且后期使用过程中易于对镰刀菌孢子的接种量进行控制，保证接种量的一致性，从而提高鉴定结果的准确性。

本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法，由于对镰刀菌孢子进行密封保存前，将工作菌液内镰刀菌孢子的浓度调节至工作浓度，并进一步在第二离心管内取工作体积的工作菌液进行风干后密封保存，因此，需要使用镰刀菌孢子进行接种时，只需通过取工作体积的双蒸水对保存的镰刀菌孢子进行溶解，即可制备镰刀菌孢子的浓度为工作浓度的工作菌液，制备的工作菌液可直接用于小麦赤霉病及小麦镰刀菌根腐病抗性鉴定的人工接种工作，因此，通过本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法保存的镰刀菌孢子，一方面可以作到随用随取，另一方面使用过程中不需要重新计算加入的双蒸水的体积，且制备的工作菌液中镰刀菌孢子的浓度可控，快捷方便，省时省力。

可选地，步骤S1包括：

S1-1：取-20℃保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板，于28℃黑暗条件下培养3d，进行镰刀菌的活化；

S1-2：取所述镰刀菌中活化的菌丝，接种于绿豆汤液体培养基，于光照条件，28℃震荡培养，进行所述镰刀菌孢子的培养，得到所述镰刀菌菌液。

通过以绿豆汤为培养基进行培养，以便于镰刀菌菌株产生分生镰刀菌孢子。

可选地，所述绿豆汤的浓度为6％。

可选地，所述震荡培养的时间范围为5～7d。

可选地，步骤S2中所述离心的转速为5000rpm，所述离心的时间为10min。

可选地，步骤S3中所述的工作浓度为5×10⁵个/ml。

可选地，步骤S4中所述的工作体积为1ml。

可选地，步骤S4中所述离心的转速为10000rpm，所述离心的时间为1min。

可选地，步骤S5中所述风干的时间为2～3小时。

与现有技术相比，本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法具有如下优势：

本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法，保存过程不需要昂贵的仪器设备，成本低，省工省力，保存的镰刀菌孢子可在一年内活力，对小麦品种的赤霉病和镰刀菌茎腐病抗性鉴定效果好，使用过程方便快捷，不需重复活化摇菌，可以较长时间保持镰刀菌孢子活力，不仅做到一次制备，一年内随时可用的效果，同时避免了镰刀菌室内连续继代培养而导致菌株活力和致病性减弱的问题，从而保证了不同批次抗性鉴定结果的准确性和稳定性，有较高的应用价值，适于推广应用。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。

实施例一

本实施例提供一种镰刀菌孢子的保存方法，该方法包括：

S1-1：取-20℃保存的禾谷镰刀菌菌株黄冈一号，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板，于28℃的培养箱中，在黑暗条件下培养3d，进行镰刀菌的活化。

S1-2：取镰刀菌中活化的菌丝，接种于浓度6％的绿豆汤液体培养基，于光照条件下，28℃震荡培养5d，产生分生孢子，进行镰刀菌孢子的培养，得到镰刀菌菌液。

为保证制备的镰刀菌菌液中镰刀菌孢子的浓度满足接种需求，震荡培养期间不时用镜检方法检测镰刀菌孢子的浓度，当检测到镰刀菌孢子的浓度达到5×10⁵个时，停止镰刀菌孢子的培养，得到镰刀菌菌液。

S2：利用四层无菌纱布对镰刀菌菌液进行过滤，滤去菌丝，收集滤液于无菌三角瓶中；将滤液放置于容积为50ml的第一离心管内，以5000rpm的转速离心10min，去除上清液，得到镰刀菌孢子。

S3：利用双蒸水，通过血球计数板对镰刀菌孢子的浓度进行调节，将镰刀菌孢子的浓度调至5×10⁵个/mL，得到工作菌液；

S4：对第一离心管进行充分震荡后，将第一离心管内的工作菌液分装至容积为2mL的第二离心管内，每个第二离心管内工作菌液的体积为1mL；以10000rpm的转速对第二离心管进行离心1min，缓慢倒弃上清液，再用移液器将剩余的上清液吸走，得到孢子沉淀物。

S5：将盛有孢子沉淀物的第二离心管放置于已灭菌30min的超净工作台内，风速调至最大，风干2-3h，直至孢子沉淀物完全干燥，得到干燥的孢子沉淀物；

S6：将盛有干燥的孢子沉淀物的第二离心管用封口膜密封，并用记号笔做好标记后，放入-20℃冰箱中保存备用。

为验证保存的镰刀菌孢子的活性，对保存的镰刀菌孢子进行萌发，取在-20℃保存0d、1d、3d、7d、10d、15d、30d、45d、60d、180d和365d的镰刀菌孢子，上述每个不同保存时长取出3只保存有镰刀菌孢子的第二离心管，加入1ml ddH2O，涡旋振荡器将固态孢子完全溶解，制备工作菌液；分别从每个第二离心管吸取10ul工作菌液接种于不同的PDA平板中心，在超净工作台风干表面水珠后密封，于28℃培养箱中黑暗倒置培养3d，完成镰刀菌孢子的萌发。

再对镰刀菌孢子的活力进行测定，分别取出各个接种培养3d后的PDA平板，利用十字交叉法测量PDA平板上的菌落直径，以直径的平均测量值大小代表镰刀菌孢子活力的程度，并拍照记录，不同保存时长的镰刀菌孢子的活力参见表1所示。

表1

表1中的数据表明，本实施例提供的镰刀菌孢子的保存方法保存的镰刀菌孢子在一年时间内，孢子活力变化不大，证明本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法能够很好的保持镰刀菌孢子的活力。

验证实施例一

为进一步验证通过本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法保存的镰刀菌孢子的活力，分别用通过实施例一中保存的镰刀菌孢子和新鲜镰刀菌孢子对小麦进行大田赤霉病人工接种，将通过实施例一提供的保存方法保存的镰刀菌孢子的活力与新鲜镰刀菌孢子的活力进行比对，从而对本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法进行验证，具体过程如下：

(1)孢子溶解

取实施例一中-20℃保存365d的镰刀菌孢子，分别往第二离心管中加入1mlddH2O，通过涡旋振荡器将固态镰刀菌孢子完全溶解，此时镰刀菌孢子的浓度即为工作浓度5×10⁵个/ml。

按照实施例一中提供的方法制备新鲜镰刀菌孢子(不用风干)，并将镰刀菌孢子的浓度也调至工作浓度5×10⁵个/ml。

将上述两种方法制备的镰刀菌孢子液(工作菌液)放在冰上备用。

(2)接种

以抗性水平比较清楚的苏麦3号、扬麦158、武汉1号、鄂麦170和安农8455为接种材料，选取刚开花的穗子，在穗中部小花内分别注射接种10μl上述备好的两种镰刀菌孢子悬浮液，每个小麦品种用上述两种镰刀菌孢子悬浮液分别接种20个穗子，接种以后套袋保湿3d。

(3)调查验证

接种后21d后调查发病情况，并统计调查发病情况。根据每个接种穗的病情级别，计算各品种的严重度。

分级标准：0级，接种小穗无可见发病症状；1级，接种小穗发病，穗轴不发病；2级，穗轴发病，但发病小穗数不足全穗的1/4；3级，发病小穗数占全穗的1/4～1/2；4级，发病小穗数占全穗的1/2以上。

各小麦品种发病的平均严重度按以下公式进行计算：

平均严重度＝所有接种穗子的病级之和/接种的小麦总穗数。

抗性分级标准：抗(R)，平均严重度＜2.0；中抗(MR)，2.0≤平均严重度＜3.0；中感，3.0≤平均严重度＜3.5；感(S)，平均严重度≥3.5。

研究结果参见表2数据所示。

表2

表2中的结果表明，新鲜制备的镰刀菌孢子和风干后-20℃保存一年的镰刀菌孢子抗病鉴定结果基本一致，在参试品种中，苏麦3号的抗赤霉病能力最强，而安农8455的抗病性最差，与前人的研究结果相符。

这说明，利用本发明提供的镰刀菌孢子的保存方法保存一年之久的镰刀菌孢子完全可替代新鲜制备的镰刀菌孢子，从而可以做到一次制备，一年内随时可用的效果，省时省力。

虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：以镰刀菌菌株为原材料，以绿豆汤为培养基，进行镰刀菌孢子的培养，得到镰刀菌菌液；

S2：对所述镰刀菌菌液进行过滤，对滤液进行离心后，去除上清液，得到所述镰刀菌孢子；

S3：将所述镰刀菌孢子的浓度调至工作浓度，得到工作菌液；

S4：取工作体积的所述工作菌液装至第二离心管内，离心，去除上清液，得到孢子沉淀物；

S5：将所述第二离心管风干，得到干燥的所述孢子沉淀物；

S6：将所述第二离心管密封，于-20℃条件下保存。

2.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S1包括：

S1-1：取-20℃保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板，于28℃黑暗条件下培养3d，进行镰刀菌的活化；

S1-2：取所述镰刀菌中活化的菌丝，接种于绿豆汤液体培养基，于光照条件下，28℃震荡培养5～7d，进行所述镰刀菌孢子的培养，得到所述镰刀菌菌液。

3.如权利要求1或2所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，所述绿豆汤的浓度为6％。

4.如权利要求2所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，所述震荡培养的时间范围为5～7d。

5.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S2中所述离心的转速为5000rpm，所述离心的时间为10min。

6.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，所述过滤次数为2次。

7.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S3中所述的工作浓度为5×10⁵个/ml。

8.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S4中所述的工作体积为1ml。

9.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S4中所述离心的转速为10000rpm，所述离心的时间为1min。

10.如权利要求1所述的镰刀菌孢子的保存方法，其特征在于，步骤S5中所述风干的时间为2～3小时。