CN114839291B

CN114839291B - 多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法

Info

Publication number: CN114839291B
Application number: CN202210463885.3A
Authority: CN
Inventors: 赵维; 时海燕; 郭紫璇; 吴月娥; 郝国祥
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Hu Haixun
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2022-04-28
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2042-04-28
Also published as: CN114839291A

Abstract

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法。本发明提供的多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法包括：将样品去除蛋白后，经液相色谱串联质谱进行检测；色谱中，色谱柱为C18柱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；质谱中采用电喷雾离子源，正离子模式。本发明通过对检测方法的优化，实现了对40种酪氨酸激酶抑制剂类药物的同时检测。

Description

多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法。

背景技术

癌症是全世界所有国家的主要死亡原因。随着人口数目的增长、年龄的增长，和增加癌症风险的生活方式的普遍化，癌症病例数和死亡人数预计将迅速增加，癌症所导致的健康问题将日益严重。血液肿瘤是较为常见的恶性肿瘤，约占所有癌症的9％。在男性(前列腺、肺部和结肠直肠之后)和女性(乳房、肺部和结肠直肠之后)最常见的恶性肿瘤排名中，都位列第四。其中，65岁以上患者占60％，未来这一比例还会继续增加。同时，血液肿瘤也是儿童和青少年中最常见的癌症类型，约占儿童肿瘤的三分之一。早在2013年，国内儿童血液肿瘤发生率已达百万分之五十三，并在逐年增长。

目前临床常用的抗肿瘤药物多为细胞毒性药物。细胞毒性肿瘤药物通常具有较高的急性毒性，具有选择性差、副作用强、易产生耐药性等缺点。而靶向药物通过作用于特定的靶点，在选择性、有效性和安全性方面都优于传统的化疗药物，近年来已成为抗肿瘤药物临床应用的大势所趋。

蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白，PTK障碍可在体内引起一系列疾病。既往研究表明，50％以上的原癌基因及癌基因产物具有PTK活性，其异常表达会导致细胞增殖调控紊乱，最终导致肿瘤发生。此外，PTK异常表达还与肿瘤侵袭转移、肿瘤新生血管形成和肿瘤化疗耐药有关。因此，酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)这一大类药物在血液肿瘤临床治疗过程中发挥着重要的作用。

酪氨酸激酶抑制剂是一种小分子药物，可以抑制由PTK活性增加引起的不受控制的细胞生长和增殖的生物途径。自2001年首个TKI——伊马替尼被用于治疗慢性粒细胞白血病以来，截至2021年，总共有68个TKI栅DA批准用于治疗各种恶性肿瘤。在血液肿瘤的治疗中更是发挥着重要的作用：伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼是治疗慢性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病的一线药物，能显著提高患者的预后情况和无事件生存率；帕纳替尼可作为慢性髓细胞白血病的二线或三线治疗方案，以克服一线药物的耐药性或不耐受情况；伊布替尼用于治疗慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤和巨球蛋白血症；米哚妥林、舒尼替尼、索拉非尼和吉列替尼已被批准作为复发或难治性急性髓细胞白血病的治疗方案。

由于血液肿瘤患者大多为儿童和老年人等特殊人群，与普通患者相比，其生理生化病理等机制存在较大差异，有不同药代动力学和药效学特征，且许多药物存在缺乏特殊人群临床数据或者超说明书用药等情况，用药安全形势十分严峻。因此在治疗过程中需要对临床合理用药进行指导，其中最强有力的手段是治疗药物监测(Therapeutic drugmonitoring，TDM)。TDM是指通过测定患者体液(包括血液、尿液、唾液等)中的药物浓度，调整给药剂量，使其达到预期目标水平。目前，在TDM中应用的方法主要有免疫分析法、高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC)法、液相色谱串联质谱(Liquidchromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术等。其中免疫分析法操作简单，检测周期短，但应用范围有限，不能同时测定多种药物；HPLC法专属性强，稳定性好，但灵敏度较低，分析时间长。r而LC-MS/MS技术能够弥补上述两种方法的不足，在特异性、灵敏度和多组分分析方面具有明显的优势，在临床诊断中发挥举足轻重的作用。临床上遴选需要进行检测的药物主要遵循以下几个原则：有效治疗浓度范围已确定或治疗窗窄、药物有效性或毒性与药物暴露量具有相关性、药物代谢存在较大个体差异、特殊人群患者、治疗失败会带来严重后果等。目前，血液肿瘤首选化学治疗方案。抗肿瘤药物多为细胞毒性药物，并且满足TDM的标准：药代动力学情况变异极大以及治疗窗狭窄。在肿瘤化疗过程中开展TDM，除个体化化疗作用外，还具有提高疗效、避免毒副作用的优点：包括增强依从性，尽量减少患者的药代动力学差异，调整肝和(或)肾功能不全患者的剂量和检测药物相互作用等。因此，临床血液肿瘤患者在治疗过程中，应当开展TDM。

而TKI类药物在应用过程中也存在许多问题。首先，所有TKI都是经由口服给药，通常以固定的药物剂量给予患者，而不考虑患者的体重、年龄或性别。因此，是否空腹、生物利用度差异以及给药依从性的影响会导致血浆水平个体间和个体内存在较大差异；其次，由于TKI治疗周期较长，其中许多药物主要经由肝脏CYP450代谢，使得用这些药物的患者存在药物-药物相互作用的巨大风险；此外，多项研究已经证实，TKI血浆药物浓度与临床结果(治疗效果和毒性反应)之间具有相关性。因此，TKI类药物是应当开展TDM的候选药物，以避免因给药剂量不足导致耐药性产生或给药剂量过高发生毒性反应，并可以在TKI治疗期间通过剂量调整来改善临床反应。

然而，当面对数量众多的应用不同TKI类药物的不同患者的临床样本，应用单个药物分析方法进行浓度测定时，这些方法的测定条件、样品处理方法等都各不相同，往往需要繁杂的处理过程、漫长的等待时间，不能在短时间内获得其血药浓度数据，失去TDM的时效性，不利于后续给药剂量的调整或不良反应的规避。

不过，随着分析测试技术的不断发展，在LC-MS/MS技术的基础上，应用于TDM的方法也在不断推陈出新，为TKI类药物TDM的开展创造了更优的选择。

多组分分析原本常见于中药有效成分的测定，但随着临床诊疗中TDM的不断推广普及，接受TDM的患者数量、药物种类都在迅速增加，针对单个药物所建立的浓度检测方法将逐渐不能满足临床需求。相较于传统针对单个药物的分析方法，多组分分析方法中所有的药物都能够使用相同的步骤进行样本处理，在相同的色谱条件下进行分离，在同一批次内获得全部测定结果，能够方便、快速地开展大规模TDM。因此，开发多组分分析方法是TDM发展的必然要求，尤其是作用靶点相同、结构相近的同一类药物，更适宜开发多组分分析方法，同时测定多种TKI药物的TDM方法开发已经成为主流研究方向。

近四年来，Nick Verougstraete等人发表的八项有关建立多组分TKI药物血药浓度测定方法的研究，各项方法所涉及到的TKI数量在4-17种不等，分析时间为5-20min。

Nick Verougstraete等人在2021年发表的研究中开发了一种同时测定博舒替尼、达沙替尼、吉列替尼、伊布替尼、伊马替尼、米哚妥林、尼洛替尼、帕纳替尼这八种TKI药物的LC-MS/MS方法。该方法使用的是C18色谱柱，0.1％甲酸水和0.1％甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，分析时间为4分钟，样品前处理方法为乙腈沉淀蛋白。

Dora Koller等人在2020年发表的研究中开发了一种同时测定伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、博舒替尼、帕纳替尼、芦可替尼、伊布替尼、非洛替尼、托法替尼、巴瑞替尼、吡西替尼这十一种TKI药物的LC-MS/MS方法。该方法使用的是C18色谱柱，0.1％甲酸水和0.1％甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，分析时间为12分钟，样品前处理方法为乙腈沉淀蛋白和固相萃取。

Shinya Takasaki等人在2019年发表的研究中开发了一种同时测定索拉非尼、舒尼替尼、阿昔替尼、帕唑帕尼这四种TKI药物的LC-MS/MS方法。该方法使用的是ODS色谱柱，pH＝5的10mmoL/L甲酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，分析时间为6分钟，样品前处理方法为乙腈萃取。

Evelina Cardoso等人在2018年发表的研究中开发了一种同时测定达拉非尼、曲美替尼、维莫非尼、考比替尼、帕唑帕尼、瑞戈非尼这六种TKI药物的LC-MS/MS方法。该方法使用的是HSS色谱柱，0.1％甲酸水和0.1％甲酸乙腈作为流动相进行梯度洗脱，分析时间为9.5分钟，样品前处理方法为甲醇沉淀蛋白。

Evelina Cardoso等人在2018年发表的研究中开发了一种同时测定舒尼替尼、吉非替尼、凡德他尼、克唑替尼、阿法替尼、伊马替尼、达沙替尼、博舒替尼、厄洛替尼、阿昔替尼、芦可替尼、拉帕替尼、帕纳替尼、尼洛替尼、达拉非尼、索拉非尼、瑞戈非尼这十七种TKI药物的LC-MS/MS方法。该方法使用的是C18色谱柱，0.01％醋酸铵和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，分析时间为5分钟，样品前处理方法为固相萃取。

汇总分析到目前为止所有多组分TKI药物血药浓度测定方法后发现，每种方法中所涵盖的药物数目最多为17种，然而，目前临床应用的TKI类药物种类远超17种，如果一批患者的待测样本中存在方法中未包含的药物，则需要额外使用其他方法进行测定，不仅增添了操作的复杂性，同时也延长了分析时间，继续扩大一种方法中所涉及的药物范围，是TKI类药物多组分分析方法的发展要求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的液相色谱串联质谱的检测方法。

本发明提供的多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法包括：将样品去除蛋白后，经液相色谱串联质谱进行检测。

本发明提供的方法中，所述液相色谱的条件包括：

色谱柱为C18柱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱。

一些实施例中，所述流动相A为0.1vol％的甲酸水溶液，流动相B为100％乙腈。

本发明中所述色谱条件还包括：流动相的流速为0.3mL/min。柱温40℃，自动进样器温度4℃，进样体积为1μL。

一些实施例中，本发明所述的色谱柱为GL Sciences InertsilTM ODS-4色谱柱。所述色谱柱的尺寸为5μm，2.1×100mm。

所述梯度洗脱具体为：0～1.5min，流动相B体积分数为20％；1.5～2.5min，流动相B体积分数由20％至80％；2.5～5.5min，流动相B体积分数为80％；5.6～8min，流动相B体积分数为20％。

本发明提供的方法中，所述质谱的条件包括：

电喷雾离子源，正离子模式，离子喷雾电压4000～5000V，离子源温度为300～700℃。

所述离子喷雾电压4500V，所述离子源温度为500℃。

所述质谱条件还包括：气帘气的压力为35psi；碰撞气的压力为8psi；雾化气的压力为50psi；辅助气的压力为50psi。

所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括：阿法替尼、克唑替尼、拉帕替尼、米哚妥林、奈拉替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、曲美替尼、瑞戈非尼、塞瑞替尼、维莫非尼、伊马替尼、阿来替尼、阿美替尼、阿帕替尼、埃克替尼、安罗替尼、奥希替尼、吡咯替尼、波玛西林、达可替尼、达拉非尼、厄洛替尼、凡德他尼、呋喹替尼、吉非替尼、吉列替尼、卡博替尼、拉罗替尼、劳拉替尼、芦可替尼、仑伐替尼、尼达尼布、帕纳替尼、索拉非尼、伊布替尼、泽布替尼、阿昔替尼、达沙替尼和舒尼替尼中的一种或多种。

本发明所述方法中：

样品中阿法替尼、克唑替尼、拉帕替尼、米哚妥林、奈拉替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、曲美替尼、瑞戈非尼、塞瑞替尼、维莫非尼或伊马替尼的浓度范围为25-5000ng/mL。

样品中阿来替尼、阿美替尼、阿帕替尼、埃克替尼、安罗替尼、奥希替尼、吡咯替尼、波玛西林、达可替尼、达拉非尼、厄洛替尼、凡德他尼、呋喹替尼、吉非替尼、吉列替尼、卡博替尼、拉罗替尼、劳拉替尼、芦可替尼、仑伐替尼、尼达尼布、帕纳替尼、索拉非尼、伊布替尼或泽布替尼的浓度范围为4-800ng/mL。

样品中阿昔替尼、达沙替尼或舒尼替尼的浓度范围为1-200ng/mL。

本发明所述的方法中，所述样品为血浆。所述去除蛋白包括：血浆与乙腈混合后，涡旋振荡，经离心收集上清液。作为优选，所述血浆与乙腈的体积比为1∶3。

本发明所述方法中，标准品以DMSO溶解配制储备液。所述储备液中，阿法替尼、阿来替尼、阿美替尼、阿帕替尼、阿昔替尼、埃克替尼、安罗替尼、奥希替尼、吡咯替尼、波玛西林、达可替尼、达拉非尼、达沙替尼、厄洛替尼、凡德他尼、呋喹替尼、吉非替尼、吉列替尼、卡博替尼、克唑替尼、拉罗替尼、拉帕替尼、劳拉替尼、芦可替尼、仑伐替尼、米哚妥林、奈拉替尼、尼达尼布、尼洛替尼、帕纳替尼、曲美替尼、瑞戈非尼、塞瑞替尼、舒尼替尼、索拉非尼、伊布替尼、伊马替尼、泽布替尼的浓度为1mg/mL。帕唑帕尼、维莫非尼的浓度为2mg/mL。达可替尼-d10、达沙替尼-d8、厄洛替尼-d6、吉非替尼-d6、卡博替尼-d6、克唑替尼-d5、仑伐替尼-d4、米哚妥林-d5、尼洛替尼-d6、帕纳替尼-d8、帕唑帕尼-d6、曲美替尼-¹³C-d3、瑞戈非尼-¹³C-d3、舒尼替尼-d4、索拉非尼-d3、维莫非尼-d7、伊布替尼-d5的浓度为1mg/mL。

本发明所述方法中，所述检测包括定性检测和定量检测。根据检测的质荷比进行定性，采用标准曲线法进行定量。

本发明提供的多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法包括：将样品去除蛋白后，经液相色谱串联质谱进行检测；色谱中，色谱柱为C18柱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；质谱中采用电喷雾离子源，正离子模式。本发明通过对检测方法的优化，实现了对40种酪氨酸激酶抑制剂类药物的同时检测。且该方法具有良好的准确性、稳定性和精密性，且对每种药物的检测都具有良好的线性范围。

附图说明

图1示四十种TKI和十七种同位素内标的结构及MRM谱图；

图2示TKI和同位素内标在血浆样本中的代表性色谱图；

图3示TKI分析方法的稀释稳定性(n＝20)，稀释前后质控样本测定准确度均在86.8％-114.0％范围内，对这两组数据进行比较，p值均大于0.1，无显著差异，说明稀释不会影响这六种药物的测定准确性；

图4示TKI分析方法的提取回收率与基质效应(n＝9)，当准确度在80％-120％范围内时，认为提取回收率和基质效应对样本测定无影响；

图5示对比例1中30％B相(乙腈)等度洗脱的色谱图；

图6示对比例1中梯度洗脱的色谱图；

图7示对比例1中梯度洗脱的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1、实验材料

四十种TKI类药物和十七种同位素内标(中国食品药品检定研究院、上海甄准生物科技有限公司，具体信息见表1)；乙腈(美国天地公司，质谱纯)；二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO，上海麦克林生化科技有限公司)；甲酸(赛默飞世尔科技，含量：98％)；实验用水(杭州娃哈哈集团有限公司，纯净水)；空白血浆(山东省千佛山医院)。

表1目标药物和同位素内标信息

2、实验仪器及条件

高校液相色谱仪(岛津公司，LC-20ADXR)；三重四极杆质谱仪(上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，Triiple Quad^TM 4500)；分析天平(岛津公司，AUW120)；电子天平(上海菁华科技仪器有限公司，YP202N)；微量离心机(赛默飞世尔科技，Sorvall^TM Legend^TMMicro 17)；旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，VORTEX-5)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ3200)；移液器(艾本德生命科学公司)；超低温保存箱(海尔生物医疗，DW-86L728J)。

2.1色谱条件

采用GL Sciences InertsilTM ODS-4色谱柱(5μm，2.1*100mm)进行色谱分离。将LC-MS/MS甲酸与实验用水按体积比1∶1000混合，此为流动相A相；100％色谱纯乙腈为流动相B相，以0.3mL/min的流速进行梯度洗脱，B相的比例随时间变化情况如下：0-1.5min，20％B；1.5-2.5min，20％-80％B；2.5-5.5min，80％B；5.6-8min，20％B，整体分析时间为8min。柱温为40℃，自动进样器温度为4℃，进样体积为1μL。

2.1质谱条件

质谱的离子源使用电喷雾离子源，在正离子模式下，采用MRM模式进行定量检测。质谱系统的各项参数如下：离子喷雾电压4500V；离子源温度为500℃；气帘气的压力为35psi；碰撞气的压力为8psi；雾化气的压力为50psi；辅助气的压力为50psi。硼替佐米和内标化合物阿帕替尼优化后的m/z、DP、CE等质谱检测参数见表2，化合物结构及其MRM谱图见图1。

表2目标药物和同位素内标的质谱参数

3、工作液的配制

3.1目标分析物和同位素内标储备液

以二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)为溶剂，将帕唑帕尼、维莫非尼分别配制为2mg/mL初始储备液，其余三十八种TKI类药物分别配制为1mg/mL初始储备液置于-80℃冰箱低温保存。

以DMSO为溶剂，将十七种同位素内标分别配制为1mg/mL内标初始储备液，置于-80℃冰箱低温保存。

3.2标准曲线工作液

将四十种目标分析物分成三种浓度组来进行标准曲线的建立。H组(工作液浓度25-5000ng/mL)：阿法替尼、克唑替尼、拉帕替尼、米哚妥林、奈拉替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、曲美替尼、瑞戈非尼、塞瑞替尼、维莫非尼、伊马替尼，其中帕唑帕尼和维莫非尼样本为稀释4倍后的浓度；M组(工作液浓度4-800ng/mL)：阿来替尼、阿美替尼、阿帕替尼、埃克替尼、安罗替尼、奥希替尼、吡咯替尼、波玛西林、达可替尼、达拉非尼、厄洛替尼、凡德他尼、呋喹替尼、吉非替尼、吉列替尼、卡博替尼、拉罗替尼、劳拉替尼、芦可替尼、仑伐替尼、尼达尼布、帕纳替尼、索拉非尼、伊布替尼、泽布替尼，其中达拉非尼、厄洛替尼、卡博替尼和索拉非尼样本为稀释6.125倍后的浓度；L组(工作液浓度1-200ng/mL)：阿昔替尼、达沙替尼、舒尼替尼。

精密吸取500μL H组(帕唑帕尼和维莫非尼为250μL)、80μL M组以及20μL L组的初始储备液置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，配制成TKI混合工作液P7。随后以乙腈作为稀释溶剂，将TKI混合工作液P7按表3自上向下稀释，配制TKI标准曲线工作液。

表3 TKI分析方法的标准曲线工作液配制

3.3质控工作液

以乙腈作为稀释溶剂，将TKI混合工作液P7按表4自上向下稀释，配制高(H)、中(M)、低(L)三种浓度的质控工作液。

表4 TKI分析方法的质控工作液配制

3.4内标工作液

将十七种同位素内标依据TKI标准曲线的分组也对应分成三种浓度。H组(工作液浓度1000ng/mL)：克唑替尼-d5、米哚妥林-d5、尼洛替尼-d6、帕唑帕尼-d6、曲美替尼-¹³C-d3、瑞戈非尼-¹³C-d3、维莫非尼-d7；M组(工作液浓度200ng/mL)：达可替尼-d10、厄洛替尼-d6、吉非替尼-d6、卡博替尼-d6、仑伐替尼-d4、帕纳替尼-d8、索拉非尼-d3、伊布替尼-d5；L组(工作液浓度40ng/mL)：达沙替尼-d8、舒尼替尼-d4。

精密吸取500μL H组、100μL M组以及20μL L组的内标初始储备液置于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，配制成TKI混合内标工作液。随后再用乙腈稀释5倍，配制成TKI内标工作液，将其置于-80℃冰箱低温保存备用。

4血浆样品的处理

4.1标准曲线/质控样本

精密吸取5μL TKI标准曲线/质控工作液于1.5mL微量离心管中，分别加入45μL空白血浆，涡旋30s混匀后，得到稀释后的标准曲线样本P1-P7和稀释后的质控样本L，M，H，其浓度相当于稀释10倍后的对应工作液。随后向微量离心管中加入5μL内标工作液，涡旋30s混匀后，加入150μL乙腈，涡旋1min进行蛋白沉淀。在室温条件下，以13.8g/min的转速离心10min后，吸取100μL上清液加入内衬管中，放入棕色进样小瓶，置于自动进样器中等待进样分析。

4.2临床样本

精密吸取50μL临床血浆样本于1.5mL微量离心管中，随后加入5μL内标工作液，涡旋30s混匀后，加入150μL乙腈，涡旋1min进行蛋白沉淀。在室温条件下，以13.8g/min的转速离心10min后，吸取100μL上清液加入内衬管中，放入棕色进样小瓶，置于自动进样器中等待进样分析。

5、样品测定时限

根据技术方案验证中稳定性部分所得到的数据支撑，如果临床样本采集完毕后置于室温条件下储存，需要在采集后4小时内立即进行测定；如果立即置于4℃条件下储存，需要在采集后1天内进行测定；如果立即置于-80℃条件下储存，需要在采集后1周内进行测定；以保证全部药物稳定，测定结果准确。

6、技术方案验证

本研究依据FDA制定通过的生物样品定量分析方法验证指导原则，通过对选择性、线性与定量下限、准确度与精密度、稳定性、基质效应与提取回收率这五个方面的考察，来对所建立的同时测定血浆中四十种TKI类药物浓度的多组分分析方法进行验证。

6.1选择性

考察该方法的选择性是为了检查样品中是否有干扰成分的存在。对至少6个来自不同个体的空白DBS样本进行分析，并与LLOQ进行比较。当干扰组分的响应程度低于硼替佐米LLOQ响应的10％，并低于内标响应的5％时，是可被接受的。

四十种TKI的保留时间均在2.5-5min内，十七种同位素内标与其对应分析物的出峰时间一致。仅加入内标的空白血浆、仅加入TKI的空白血浆以及所有TKI各自LLOQ的色谱图见图2。在不同基质中目标化合物和IS峰形良好，出峰时间附近未见明显干扰组分存在，说明该方法选择性良好。

6.2线性与定量下限

为分析硼替佐米在DBS和血浆基质中的定量关系，以1/x²为加权系数，硼替佐米和内标的峰面积之比为y值，硼替佐米理论浓度为x值，通过最小二乘法来进行线性回归，连续三天校准曲线的建立。当相关系数(Correlation coefficient，r)＞0.99、标准曲线样本在理论浓度值的85％-115％之间、LLOQ样本在80％-120％之间、标准曲线至少含有6个有效浓度点时，线性考察即为合格。

LLOQ样本是标准曲线中浓度最低的点，最易受基质中干扰组分的影响。其信噪比(Signal-noise ratio，S/N)应当大于10，准确度和精密度范围要求在80％-120％之间即为合格。

连续三天建立TKI标准曲线，以1/x²为加权系数，四十种TKI各自得到的线性回归方程见表5，r均＞0.99，说明该方法中所有药物在其对应的标曲范围内线性良好。

连续三天测定三批次共十五份LLOQ样本后证明，每份样本中每种药物S/N均＞10，准确度的范围为90.9％-109.6％，日内精密度和日间精密度分别低于13.1％和17.5％(见表5)，均符合要求。

表5 TKI分析方法中所有药物的标准曲线信息

注：上标a表示该化合物已稀释4倍；上标b表示该化合物已稀释6.125倍。

6.3准确度与精密度

通过分析LLOQ和L、M、H样本来评估测定的准确度以及日内和日间精密度。四种浓度的QC样本在同一天内和重复三天进行检测，每种浓度制备五份。用测定浓度/理论浓度来表示准确度，用变异系数(Coefficient of variation，CV)来表示准确度和精密度。L、M、H样本的准确度要求在85％-115％之间、CV值要求在±15％之内，LLOQ样本的准确度要求在80％-120％之间、CV值要求在±20％之内。

TKI分析方法的日内和日间准确度、精密度的评估结果如表6所示。所有QC样本准确度在85.9％-114.1％之间，日内精密度和日间精密度CV值分别低于11.0％和10.1％，均在允许范围内。

表6 TKI分析方法的准确度和精密度(n＝20)

6.4稳定性

储存时间和温度会影响TKI在血浆样品中的稳定性。通过将L、M、H样本，每种浓度制备五份，将样本稀释4倍和6.125倍后进行测定，来评价帕唑帕尼、维莫非尼和达拉非尼、厄洛替尼、卡博替尼、索拉非尼的稀释稳定性；在室温条件下保存4h、12h，在4℃条件下保存1天、3天，-80℃条件下保存7天、30天来评价其储存稳定性；将处理完的样本在自动进样器中放置6h后再次进样，来评价其自动进样器稳定性。用相对标准偏差(Relative standarddeviafion，RSD)来表示数据的离散程度。和初始浓度相比，如果测定浓度降低的比例小于15％，且RSD＜15％，则可以认为样本在此种条件下是稳定的。

TKI血浆样本在室温条件、4℃条件、-80℃条件和自动进样器中的稳定性结果如表7、8、9、10所示，帕唑帕尼、维莫非尼、达拉非尼、厄洛替尼、卡博替尼和索拉非尼的稀释稳定性结果如图3所示。这四十种TKI药物的血浆样本在室温条件下4h、4℃条件下1天、-80℃条件下1周内均可保持稳定。若将室温条件下的储存时间延长至24h，劳拉替尼、奈拉替尼不稳定(准确度＜80％)，阿美替尼、奥希替尼、尼达尼布、伊布替尼稍有降解(准确度在80％-85％之间)；若将4℃条件下的储存时间延长至3天，劳拉替尼、奈拉替尼不稳定(准确度＜80％)，阿美替尼、奥希替尼、伊布替尼稍有降解(准确度在80％-85％之间)，；若将-80℃条件下的储存时间延长至1月，吡咯替尼、劳拉替尼、奈拉替尼、伊布替尼不稳定(准确度＜80％)，卡博替尼、塞瑞替尼、泽布替尼稍有降解(准确度在80％-85％之间)，未提到的剩余三十种TKI的血浆样本的测定结果准确度在85.4％-114.9％之间，在本方法所验证过的储存条件中均能保持稳定。四十种TKI药物的血浆样本在经过处理后放置在自动进样器中6h内能够保持稳定。帕唑帕尼和维莫非尼的血浆样本稀释4倍后分析；达拉非尼、厄洛替尼、卡博替尼和索拉非尼血浆样本稀释6.125倍后分析，稀释前后质控样本测定准确度均在86.8％-114.0％范围内，对这两组数据进行比较，p值均大于0.1，无显著差异，说明稀释不会影响这六种药物的测定准确性(表11、图3)。

表7 TKI分析方法的室温稳定性(n＝15)

表8 TKI分析方法的4℃稳定性(n＝15)

表9 TKI分析方法的-80℃稳定性(n＝15)

表10 TKI分析方法的自动进样器稳定性(n＝15)

表11 TKI分析方法的稀释稳定性(n＝20)

6.5提取回收率和基质效应

通过对L、M、H样本，每种浓度制备五份，进行A、B、C三个系列的分析，来考察基质效应、提取回收率和总体流程效率的影响。A：按4.1“所示步骤处理的样本；B：空白血浆样本经乙腈沉淀蛋白后再加入TKI QC工作液；C：与A、B中理论浓度相同的TKI溶液。用B/C 100％来表示基质效应，如果比值在85％-115％之间，则可以排除基质对样本测定结果的影响。用硼替佐米是否经历提取步骤所得测定结果的比值(A/B×100％)来考察该方法的提取回收率。

四十种TKI药物在血浆样品中的提取回收率和基质效应见表12、图4，所有药物的提取回收率均在92.6％-114.7％之间，基质效应在88.8％-111.3％之间，这说明血浆基质以及该方法的总体流程对TKI样本的测定没有显著影响。

表12 TKI分析方法的提取回收率与基质效应(n＝9)

对比例1

一、流动相比例

1.以30％B相(乙腈)等度洗脱，其他条件与实施例1一致。

图谱显示：药物出峰时间较迟，7min内无法全部出峰(2.10min前的为上一针未出的药物峰)；有些药物峰形矮宽、分叉、不规则(图5)。

2.梯度洗脱条件如下，其他条件与实施例1一致。

0～1min，流动相B体积分数为30％；

1～2min，流动相B体积分数由30％至70％；

2～6.5min，流动相B体积分数为70％；

6.6～9min，流动相B体积分数为30％。

图谱显示：药物出峰时间不集中，在高水相和高有机相比例均有分布；6.5min处有一个非常矮宽的药物峰；部分药物峰形不好(图6)。

3.梯度洗脱条件如下，其他条件与实施例1一致。

0～1.5min，流动相B体积分数为10％；

1.5～2.5min，流动相B体积分数由10％至90％；

2.5～5.5min，流动相B体积分数为90％；

5.6～8min，流动相B体积分数为10％。

图谱显示：药物出峰时间不集中，在高水相和高有机相比例均有分布；部分药物峰形非常矮宽(图7)。

4、样本稀释：依据临床有效浓度的高低，将所有药物分成了高、中、低三种浓度组，对应的标准曲线范围分别为25-5000、4-800、1-200ng/mL。

帕唑帕尼和维莫非尼的临床有效浓度可达到微克级别，浓度太大，无法直接应用LC-MS/MS方法进行测定，因此将其稀释4倍，使其落于H组的标曲范围内；达拉非尼、厄洛替尼、卡博替尼和索拉非尼依据临床有效浓度本被归于H组，但在使用H组的标曲范围时，仪器的响应值过大，出现饱和情况，标曲无法通过，测定结果不准确，因此将其稀释6.125倍，归于M组进行测定；并在方法验证部分对这六种药物的稀释稳定性进行考察。

5、溶剂选择：在配制药物和内标储备液时，由于极性不同，其在水、乙腈、甲醇等普通溶剂中的溶解度大小各异，甚至无法溶解。因此，在配制单个物质的初始储备液时，选用DMSO进行溶解；但由于DMSO粘度较大，若在后续溶液配置过程中继续使用DMSO充当稀释剂，会导致峰面积波动较大，重现性差；为了尽可能消除溶剂粘度对分析测定的影响，在后续的溶液配制过程中，应选用粘度较小的溶剂作为稀释剂；但实验中发现，用水或50％乙腈效果仍然不好，只能使用常见溶剂中粘度最小的纯乙腈作为稀释剂。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.多种酪氨酸激酶抑制剂类药物的检测方法，其特征在于，包括：将样品去除蛋白后，经液相色谱串联质谱进行检测；

所述液相色谱的条件包括：

色谱柱为C18柱，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱；

所述梯度洗脱具体为：

0~1.5 min，流动相B体积分数为20%；

1.5~2.5 min，流动相B体积分数由20%至80%；

2.5~5.5 min，流动相B体积分数为80%；

5.6~8 min，流动相B体积分数为20%；

所述质谱的条件包括：

电喷雾离子源，正离子模式，离子喷雾电压4000~5000 V，离子源温度为300~700℃；

所述酪氨酸激酶抑制剂类药物包括：

阿法替尼、克唑替尼、拉帕替尼、米哚妥林、奈拉替尼、尼洛替尼、帕唑帕尼、曲美替尼、瑞戈非尼、塞瑞替尼、维莫非尼、伊马替尼、阿来替尼、阿美替尼、阿帕替尼、埃克替尼、安罗替尼、奥希替尼、吡咯替尼、波玛西林、达可替尼、达拉非尼、厄洛替尼、凡德他尼、呋喹替尼、吉非替尼、吉列替尼、卡博替尼、拉罗替尼、劳拉替尼、芦可替尼、仑伐替尼、尼达尼布、帕纳替尼、索拉非尼、伊布替尼、泽布替尼、阿昔替尼、达沙替尼和舒尼替尼。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.1vol%的甲酸水溶液，流动相B为100%乙腈。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，流动相的流速为0.3 mL/min。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为GL SciencesInertsilTM ODS-4色谱柱。

5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：柱温40℃，自动进样器温度4℃，进样体积为1μL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述离子喷雾电压4500 V，所述离子源温度为500℃。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：气帘气的压力为35 psi；碰撞气的压力为8 psi；雾化气的压力为50 psi；辅助气的压力为50 psi。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述样品为血浆。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述去除蛋白包括：血浆与乙腈混合后，涡旋振荡，经离心收集上清液；所述血浆与乙腈的体积比为1:3。