CN114836465A - 利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明了公开了一种利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法及多基因载体构建方法。基于In‑Fusion技术和P2A多肽结合的多基因组装策略成功构建含有6个甜苷合成酶基因——SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269‑1和SgUGT289‑3基因的多基因表达载体，利用农杆菌转化法将其分别转入黄瓜、番茄、烟草和拟南芥等四种高等植物中，实现了罗汉果甜苷类化合物在转基因黄瓜、番茄、拟南芥和烟草中的合成。不仅改善蔬菜风味，改善了蔬菜的口感，还可以作为鲜食型蔬菜食用，有益人体健康，还能够在异源植物中生产甜苷类化合物，提高甜苷类化合物的应用率。

Description

利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法
技术领域
本发明涉及一种利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法
背景技术
人们对甜味的偏爱似乎是一种本能，吃甜味食物不仅会使人感到愉悦，还能为人体提供所需的能量。然而，在日常生活中，摄入过多含糖过高的甜味食品使得越来越多的人患上肥胖症、糖尿病及心脑血管等重大疾病，因而人们一直尝试寻找一种非糖类的甜味物质。1983年，人们发现罗汉果果实中含有一种非常健康的非糖甜味物质——甜苷V，通常被用作天然的、高甜度、低热量的甜味剂之一。它的甜度比蔗糖高约300倍，并具有各种各样的药理活性，如抗肿瘤、抗癌、抗糖尿病、抗氧化、抗低血糖和抗炎作用。通常来说，根据加糖基的位置和数量的不同，甜苷类化合物分为甜苷V、赛门苷、甜苷Ⅲ、甜苷II及甜苷I等多种不同的类型，并且甜度也不同。其中，罗汉果甜苷V是当前发现的含量和甜度均较高的成分，其甜度约为5％蔗糖的392倍，是目前研究最广泛的甜苷类化合物。而赛门苷和甜苷IV都含有4个糖基，但是由于糖基连接位置的差异，其甜度也不同，分别是5％蔗糖的563和465倍。赛门苷是在C24位连接了3个糖基，C3连接了1个糖基，而甜苷IV则是在C3和C24位上各连接了2个糖基。另外，甜苷Ⅲ是含有3个糖基的一类甜苷化合物，其甜度更低。而且相比于甜菊苷、甜茶苷和甘草苷的先苦后甜，甜苷类化合物甜味持久，口感更好，是未来甜味剂的发展方向。20世纪90年代，罗汉果甜苷获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准作为食品甜味添加剂及糖尿病和肥胖症患者食用的代用糖，这些特性使得罗汉果甜苷在全球的需求量大幅增涨，在食品、饮料和药品行业具有良好的应用前景。作为一种出口型中药，每年约有70％罗汉果被加工成干果，出口至亚洲、美洲和欧洲等多个国家和地区。目前，罗汉果甜苷已经被雀巢、百事可乐、可口可乐和统一等食品公司作为甜味添加剂，其市场需求量逐年增长。然而，甜苷V在果实中特异性积累也严重导致了其产量较低，甜苷V仅存在于罗汉果果实中，在根、茎、种子和叶组织中几乎没有发现。特别的是，果实中含有大量的种子，约占干重的70％。而且由于罗汉果种植要求高，对生长环境的气候条件要求苛刻限制了其种植范围，这些问题限制了甜苷V在世界范围内的供应，因而研究人员一直在寻找一种能够绿色高效生产甜苷V的方法。近年来，甜苷V合成途径的解析和关键酶基因的挖掘，为甜苷类化合物的异源合成和植物甜味育种研究提供了可能。理论上来说，利用转基因生物技术将至少6个罗汉果甜苷合成酶基因转入含有甜苷合成所需的底物2，3-氧化鲨烯的植物宿主中，就能够培育新型甜味作物。
近年来，多个基因聚合的转基因技术研究飞速发展，使得多个基因转化成为了当前基因工程中的一个重点研究方向。传统的杂交育种和多次连续转化结合的传统方法、多个基因共转化法及多基因组装策略等方法都用于实现植物宿主中多个基因的堆叠。其中，将多个基因构建到一个载体的RB和LB之间的多基因组装策略更适用于4个以上的多基因转基因育种研究。理论上说，表达的多个外源基因通常是处于染色体的同一位点上，后代不会发生分离和重组。因此，利用多基因组装技术逐渐成为作物多基因转化育种研究的重要工具。目前，多基因组装技术已经取得许多重要的突破性进展，如最新的超大片段DNA序列合成和超长DNA扩增新技术、Gibson assembly、Cre recombinase/loxP-mediatedrecombination(TransGene Stacking II)、多位点的GATEWAY及In-Fusion等。此外，构建融合蛋白的方法也可以用于多基因表达载体的构建，如内部核糖体进入位点(Internalribosomalentry sites，IRESs)和自剪切的2A多肽策略等。IRESs能够不依赖帽子结构介导核糖体表达蛋白，而直接启动下游基因的表达。通常来说，IRESs元件连接的两个基因独立表达成为两个完整的目的蛋白，但IRESs核苷酸序列较长。因此，由于标准载体容量的限制，较长的序列插入往往会导致目的基因表达水平不均衡及基因表达量较低等问题。而2A多肽策略更好地规避了基因表达不均等问题，具有明显的应用优势。2A多肽是一类来源于病毒的短肽，大约由18-22个氨基酸组成，能够诱导含有2A多肽的重组蛋白的自我剪切，剪切位置一般在C末端甘氨酸-脯氨酸残基之间，目前常用的2A多肽包括手足口病毒2A多肽(Foot-and-mouth disease virus，F2A)、马甲型鼻炎病毒2A多肽(Equine rhinitis Avirus，E2A)、猪捷申病毒2A多肽(Porcine teschovirus，P2A)及明脉扁刺蛾病毒2A多肽(Thoseaasigna virus，T2A)。并且不同的2A多肽具有不同的剪切效率，目前剪切效率较好的是P2A多肽。该方法可以减少重复序列对多基因载体的限制，实现多个基因的共表达，推动了多基因转化的作物育种研究进程。这一方法不仅有助于开发口感复合型的园艺作物新种质，更是成为未来对植物细胞工厂开发的重要策略。目前利用同样的思路已经成共获得许多新的种子资源。例如营养强化作物的开发，富含β-胡萝卜素的玉米、油菜、马铃薯、香蕉和水稻(黄金大米)；含有黄酮类化合物、甜菜碱、维生素B1、B2和B9的水稻品种的培育；含有高含量花青素的“紫玉米”、“紫番茄”和“紫晶米”的开发；保健功能型作物的开发，如含有人参皂苷元的大米及含有L-DOPA和虾青素的番茄；一些具有显著的药理活性的次生代谢产物异源合成，目前利用烟草、拟南芥和小立碗藓等模式植物作为植物底盘已经实现了紫杉醇、青蒿素、DHA和不饱和脂肪酸等天然产物的异源合成，这为建立天然产物合成的“绿色无害的植物生物工厂”提供了重要的研究方向。
一个多基因转化后的植物，在适当的条件下培养成为一株完整的植株，对再生植株进行PCR、qRT-PCR及Western blot等分子检测，就可以筛选出表达具有生物活性外源蛋白的转基因植株。一些转基因植物的果实，如番茄、黄瓜、生菜、香蕉、草莓，生熟均可食用，还可以作为甜苷类化合物的植物生物工厂，操作简单、成本低廉。总而言之，植物底盘更适于复杂的天然产物的异源合成，通常利用合成代谢工程将一个甚至多个参与代谢生物合成途径的关键酶基因引入候选植物底盘从而合成天然产物的，这一方法不仅有助于开发更多功能型、复合型的营养强化品种，从而补充人们身体日常所需的营养素，改善世界范围内的广泛存在的营养不良问题。植物底盘的应用也能够对一些稀有植物资源具有保护作用，更是成为未来对植物细胞工厂开发的重要策略。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法。利用基于In-Fusion和P2A多肽结合的多基因组装策略成功将6个罗汉果甜苷合成酶基因转化黄瓜、番茄、拟南芥和烟草生产甜苷类化合物。这种方法具有很重要的应用价值，转基因黄瓜和番茄可以成为一种鲜食型甜味蔬菜产品，对人体健康有益，还可以利用黄瓜、番茄、拟南芥和烟草生产甜苷类化合物，解决甜苷类化合物天然含量低及种植限制等问题。
本发明提供一种载体，所述载体中含有SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因；
其中，所述SgSQE1基因为序列表中序列1中的第6209-7795位所示；
所述SgCS基因为序列表中序列1中的第8392-10671位所示；
所述SgEPH2基因为序列表中序列1中的第11376-12326位所示；
所述SgP450基因为序列表中序列1中的第4724-6142位所示；
所述SgUGT269-1基因为序列表中序列1中的第637-2061位所示；
所述SgUGT289-3基因为序列表中序列1中的第2661-4019位所示。
其中，所述载体为包含SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的pCAMBIA1300载体。
其中，所述载体为将载体pCAMBIA1300的EcoRI位点与HindIII位点之间的序列替换为序列1所示的序列，并保持其他序列不变，得到的重组载体pCAMBIA1300-6。
上述的载体在利用转基因植物生产甜苷类化合物上应用。
所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。
上述的载体的制备方法，其特征在于，包括分批次将SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因导入pCAMBIA1300的步骤。
具体包括如下步骤：
(1)甜苷合成关键酶基因SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的克隆。
(2)AtUBQ10、AtPD7及CaMV 35S启动子用于植物多基因表达载体构建，这三个启动子适用于大多数植物并且启动基因表达活性较强，对蔬菜和瓜果类作物如黄瓜、番茄、生菜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜等，水果类作物如苹果、香蕉、梨等，还有粮食作物如水稻、小麦、玉米等，都能够使用来生产驱动甜苷合成关键酶基因的表达。如需要特异性表达，可以适当使用器官特异性或组织特异性专一表达的启动子。
(3)2A多肽元件的引入对于减少多基因在重复序列及提高载体稳定性具有重要意义，2A多肽一般由18-22个氨基酸组成，能够诱导含有2A多肽的重组蛋白的自我剪切，并且不同的2A多肽具有不同的剪切效率，目前剪切效率较好的是P2A多肽。该方法可以减少重复序列对多基因载体的限制，实现多个基因的共表达，在各种植物上都具有广泛适应性。
(4)以黄瓜、番茄、拟南芥和烟草作为植物底盘
黄瓜和番茄作为世界上种植最广泛的蔬菜作物，栽培简单、营养价值高，产量高。同时作为鲜食型蔬菜作物，可以直接生食，提高甜苷化合物的利用率，而且拟南芥和烟草作为模式作物在生长周期短，遗传背景清晰，转基因操作简单，这些植物都是较好的生物工厂。
(5)在本发明一个实施方案中，SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1基因置于CaMV35S启动子和NOS终止子的调控下，再将PD7启动子、SgSQE1和HSP终止子构建成为单基因重组质粒PD7-SgSQE1-Thsp、UBQ10启动子、SgUGT269-1和MAS终止子同源重组在PBI121载体上获得单基因表达盒UBQ:SgUGT269-1:Tmas。然后将单基因表达载体的启动子+目的基因+终止子区域扩增并连接成为双基因载体，获得双基因载体PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos和UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S::SgUGT289-3:Tnos。同样地，获得三基因表达盒PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos:::35S:SgEPH:Tnos和UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos:::35S:SgP450:Tnos。最后，以含有三个基因表达盒的三基因表达载体重组质粒为模板，将UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos::35S:SgP450(6.1-kb)和SgSQE1:Tnos::35S:SgCS:Tnos::35S:SgEPH:Tnos(6.5-kb)两个大片段用P2A多肽(序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)连接成一个含有6个基因的大载体U22p-SCE。
(6)本发明使用的植物表达载体包括PBI121(中间载体)和pCAMBIA1300载体(终载体)，pCAMBIA1300载体的植物筛选标记基因分别为HPTII(编码潮霉素抗性蛋白)，还可以使用其他合适的表达载体用于本发明。
(7)本发明使用的农杆菌转化法为冻融法，所选用的农杆菌菌株为GV3101。
上述的载体在利用转基因植物生产甜苷类化合物上应用应该在本发明的保护范围之内。
其中，所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。这里应特别指出，虽然在本发明的下述实例中以转基因因黄瓜、番茄、拟南芥和烟草中甜苷类化合物生产及检测进一步详细描述了本发明，但是这不意味着本发明的用于生产甜苷类化合物的多基因表达载体只能用于上述植物，本领域的研究人员可以利用已知的方法构建含有本发明的甜苷合成关键酶基因的多基因表达载体转化其他植物。因此，使用本发明所构建含有甜苷合成关键酶基因的多基因载体所获得的甜苷类化合物的植物，均在本发明的权利要求内，这些植物包括，蔬菜和瓜果类作物如黄瓜、番茄、生菜、西瓜、甜瓜、南瓜、苦瓜等，水果类作物如苹果、香蕉、梨等，还有粮食作物如水稻、小麦、玉米等。
一种利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法，使用包含所述的载体或者所述制备方法制备的载体的农杆菌转染目的植物的步骤。
其中，所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。
本发明的有益效果在于：
1)甜苷合成关键酶基因的多表达载体构建策略开发及转化植物，实现了园艺作物风味改善，提高蔬菜的营养成分；
2)稳定的转基因作物种植就可以生产大量的甜苷类化合物，减少了技术、设备和种植条件上的投入，降低了生产成本；
3)解决了罗汉果植物种植栽培的地域限制问题，提高了罗汉果甜苷的利用率，有利于实现甜苷类化合物的产业化生产；
4)甜苷类化合物在蔬菜中的合成有益于改善园艺作物口感，减少生食蔬菜的涩味，增加甜味，促进蔬菜食用率；
6)口感改善的蔬菜作物的生产于食用能够引导人们对食物的选择，促进营养素的吸收率。
附图说明
图1为多基因载体构建(a)多基因载体构建策略(b)多基因载体U22p-SCE上SgSQE1(1587bp)、SgCS(2280bp)、SgEPH2(951bp)、SgP450(1421bp)、SgUGT269-1(1253bp)、SgUGT289-3(1026bp)及Hyg(392bp)的PCR鉴定图。DNAmaker为4500bp。图中红线为maker的特异性条带大小。
图2为黄瓜转基因操作流程。
图3为转基因黄瓜株系的分子鉴定。(a)黄瓜转基因植株U1的叶片和果实。(b)黄瓜转基因植株U1的PCR检测。电泳条带从左至右分别为Maker、WT、U1果实和U1叶片。右下角为maker(4500bp)。(c)黄瓜转基因植株U1的实时荧光定量分析。Csactin为内参基因。黄瓜野生植株设为1。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。
图4为转基因番茄株系的分子鉴定。(a)番茄转基因株系。(b)番茄转基因株系的PCR检测。电泳条带从左至右分别为Maker、S8、S10、S14和S17。右下角为maker(4500bp)(c)番茄转基因株系的实时荧光定量分析。Leactin为内参基因。番茄野生植株设为1。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。
图5为转基因拟南芥的分子鉴定。(a，b)转基因拟南芥植株和WT(c)拟南芥转基因株系的RT-PCR检测。电泳条带从左至右分别为Maker、WT、AA3、AA5、AA6、AU7、AU10、AU11和A12。Atactin为内参基因。右下角为maker(4500bp)(d)拟南芥转基因株系的PCR分析。电泳条带从左至右分别为Maker、WT、AA3、AA5、AA6、AA7、AU6、AU7、AU8、AU10、AU11、AU12和AU13。右下角为maker(4500bp)。
图6为转基因烟草的分子鉴定。(a)转基因烟草PCR鉴定图电泳条带从左至右分别为Maker、WT、N16、N22、N30、N31、N32、N45、N46和N47。右下角为maker(4500bp)(b)烟草转基因株系的实时荧光定量分析。Nbactin为内参基因。烟草野生植株设为1。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。
图7为转基因黄瓜U1中甜苷类化合物的分析。(a)转基因黄瓜中甜苷类化合物的HPLC-MS/MS分析。(b)转基因黄瓜植株中甜苷类化合物的积累分析。n.(d)表示未检出。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。黑色箭头指向甜苷类化合物的色谱峰。
图8为转基因番茄和拟南芥株系中甜苷类化合物的HPLC/MS-MS分析。(a)转基因番茄及拟南芥株系中甜苷III的检测。(b)转基因番茄及拟南芥株系中赛门苷的检测。黑色箭头指向甜苷III和赛门苷的色谱峰。
图9为转基因番茄和拟南芥株系中甜苷含量的分析。(a)转基因番茄植株中甜苷III的积累分析。(b)转基因拟南芥株系AA3、AA6和AU7中甜苷类化合物的积累分析。n.(d)表示未检出。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。
图10为转基因烟草株系中甜苷含量的分析。(a)转基因番烟草株系中甜苷类化合物的HPLC/MS-MS分析。(b)转基因烟草株系中甜苷III的积累分析。(c)转基因烟草株系中甜苷II-E的积累分析。n.(d)表示未检出。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。黑色箭头指向甜苷III和赛门苷的色谱峰。
图11黄瓜和番茄转基因株系中罗汉果醇的积累。(a)转基因黄瓜株系U1中罗汉果醇含量积累的分析。(b)转基因黄瓜株系U1中罗汉果醇的鉴定。黑色箭头指示的是罗汉果醇的HPLC峰。(c)转基因番茄株系S8和S17中罗汉果醇含量积累的分析。(d)转基因番茄株系S8和S17中罗汉果醇的鉴定。黑色箭头指示的是罗汉果醇的HPLC峰。n.(d)表示未检出。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的载体PBI121，载体pCAMBIA1300，“津研四号”黄瓜，Micro-Tom番茄，本氏烟草，哥伦比亚野生型拟南芥，农杆菌GV3101均为市售品种，公众可以从北京华越洋生物、赛索飞生物科技等公司购买。
实施例1重组载体的构建
如图1所示，本发明利用InFusion和2A多肽结合的方法构建了一个含有SSgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的超级大载体pCAMBIA1300-6。所述载体的制备方法包括以下步骤：利用In-Fusion和2A多肽结合的多基因载体组装策略，首先获得单基因表达载体，也就是利用ClonExpress II One Step Cloning Kit构建35S:SgCS:Tnos、35S:SgEPH:Tnos、35S:SgP450:Tnos和35S:SgUGT289-3:Tnos同时利用ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit分别将PD7启动子、SgSQE1和HSP终止子构建成为单基因重组质粒PD7-SgSQE1-Thsp、UBQ10启动子、SgUGT269-1和MAS终止子同源重组在PBI121载体上获得单基因表达盒UBQ:SgUGT269-1:Tmas。
接下来将单基因表达载体的启动子+目的基因+终止子区域扩增并连接成为双基因载体，使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit将PD7:SgSQE1:Thsp和35S:SgCS:Tnos两个片段融合在pCAMBIA1300载体上，成功构建出PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos，同样地，将UBQ:SgUGT269-1:Tmas和35S::SgUGT289-3:Tnos连接成为双基因表达盒UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S::SgUGT289-3:Tnos。
同样地，以双基因载体和单基因载体质粒为模板，通过PCR扩增分别获得双基因表达盒上的基因表达区域PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos以及UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos和单基因表达盒35S:SgEPH:Tnos和35S:SgP450:Tnos。使用了ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit将PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos和35S:SgEPH:Tnos同源重组获得三基因表达盒PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos:::35S:SgEPH:Tnos，UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos和35S:SgP450:Tnos两个片段重组构建UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos:::35S:SgP450:Tnos，
最后，以含有三个基因表达盒的三基因表达载体重组质粒为模板，利用PCR分别扩增候选基因表达区域，使用了ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit将UBQ:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos::35S:SgP450(6.1-kb)和SgSQE1:Tnos::35S:SgCS:Tnos::35S:SgEPH:Tnos(6.5-kb)两个大片段用P2A多肽(序列为GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP)连接成一个含有6个基因的大载体U22p-SCE。
所述pCAMBIA1300-6为将载体pCAMBIA1300的EcoRI位点与HindIII位点之间的序列替换为下述序列1之后得到的重组载体；序列1中的第6209-7795位为SgSQE1基因的序列；序列中的第8392-10671位为SgCS基因的序列；序列中的第11376-12326位为SgEPH2基因的序列；序列中的第4724-6142位为SgP450基因的序列；序列中的第637-2061位为SgUgt269-1基因的序列；序列中的第2661-4019位为SgUgt289-3基因的序列。序列1中的第1-636位为AtUBQ启动子基因序列；第2062-2314位为所述MAS终止子基因序列为序列表中序列1中的位所示；第2135-2660位、4378-4723位，8046-8391位，11030-11375位均为CaMV 35S启动子基因；第4020-4377位，10672-11029位，12327-12684位均为NOS终止子基因序列；第7796-8045位为HSP终止子基因序列。
实施例2转基因植物的获取
1.转基因黄瓜的制备
将重组载体pCAMBIA1300-6转入农杆菌GV3101中，验证，将含有重组载体pCAMBIA1300-6的农杆菌命名为农杆菌-6。利用与农杆菌-6共培育的方法，转染黄瓜伤愈组织，得到含有重组载体pCAMBIA1300-6的转基因黄瓜。另外，培育没有转染农杆菌的黄瓜野生型作为对照。
具体方法包括：
(1)外植体的准备
选取健康饱满的“津研四号”黄瓜种子置于55℃水浴温汤浸种15min，室温静置6h，75％酒精消毒30sec，无菌水冲洗4遍，然后用3％的次氯酸钠消毒18min(期间不断摇动)，无菌水冲洗5遍后，用无菌滤纸擦干种子表面的水分，用镊子均匀摆放在1/2MS固体培养基上，28℃黑暗条件下培养至出芽后转到光下培养，培养条件：25℃，光照16h光照/8h黑暗。
(2)外植体的获得
选择5-7d苗龄的长势良好的黄瓜子叶，将发芽的子叶顶端切除，并将子叶节和切成小块的子叶作为外植体。将切好的外植体叶背朝上置于预培养基上，并放置于28℃条件下暗培养1d。
(3)农杆菌侵染液的制备
1)取200μL含有重组质粒U22p-SCE的农杆菌菌液接种于50mL含有50mg/L的Kana和30mg/L的Rif的LB液体培养基中，28℃，180rpm/min，振荡培养至OD600＝0.6-0.8左右；
2)取菌液加到50mL无菌离心管中，5000rpm离心5min，弃上清液并加入等体积的1/2MS无菌液体培养基稀释至OD600＝0.2-0.3，并加入50μL silwet-77和100μL(母液浓度为0.1M)的乙酰丁香酮，摇匀后黑暗放置4h。
(4)外植体的侵染与共培养
将切好的外植体倒入预先准备好的菌液中侵染25min(期间不断轻轻震荡)，侵染结束后倒掉菌液，用无菌滤纸吸干表面附着的菌液后，将子叶背面朝上均匀摆放在表面放有一张无菌滤纸的共培养培养基上，黑暗条件下25℃共培养2d。
(5)分化筛选培养
共培养2d后，将外植体用无菌水清洗5次，再放入低抗生素浓度分分化筛选培养基中进行不定芽的诱导，子叶背朝下，置于28℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，放在继代培养基上继代3-5次。待长出愈伤组织分化出再生不定芽转入高抗生素浓度分化筛选培养基中继续筛选培养。
(6)诱导生根与驯化移栽
将分化出来的不定芽切下，并转入生根培养基中进行生根培养。当幼苗长出5条以上的根后，用镊子轻轻夹出幼苗，用自来水冲将残余的培养基清洗干净后，移栽到装有灭菌育苗基质的苗钵中，由于转基因幼苗比较弱，用保护罩将幼苗盖住5d左右，去除保护罩再继续培养一周，然后移栽到大盆中置于温室中正常管理。
PCR鉴定：分别取转基因黄瓜的叶和果实(如图3a和b所示)，提取基因组DNA；提取的基因组DNA为模板，利用KOD OneTM PCR master Mix特异性PCR扩增罗汉果甜苷合成基因SgSQE1(1587bp)、SgCS(2280bp)、SgEPH2(951bp)、SgP450(1421bp)、SgUGT269-1(1253bp)、SgUGT289-3(1026bp)和抗性筛选基因Hyg(392bp)，引物序列见表1，PCR检测结果发现黄瓜植株的叶片和果实中都检测到了6个候选基因和潮霉素筛选基因，(黄瓜转基因植株U1的PCR检测。电泳条带从左至右分别为Maker、WT、转基因黄瓜植株U1果实和转基因黄瓜植株U1叶片。右下角为maker(4500bp)。
表1 PCR检测引物
Table 1 Primers for PCR detection
Figure BDA0003598665070000101
qRT-PCR分析：根据候选基因的全长序列设计实时荧光引物(序列见表2)，根据南京诺唯赞生物科技股份有限公司的实时荧光定量试剂盒操作说明书分别对黄瓜阳性植株中SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的表达水平进行定量分析。其中，稀释4倍的cDNA作为模板，黄瓜的内参基因为Csactin，野生型黄瓜植株作为对照。由图3c可知，与黄瓜野生型对照相比，在黄瓜转基因植株U1的果实和叶片中SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的表达水平都很高，最高的都达到了上万倍。而SgSQE1基因的表达量也比对照高出100倍左右。转基因黄瓜中罗汉果甜苷合成酶基因具有较高的表达量，表明该多基因载体组装策略能够同时将6个基因转入转基因黄瓜植株中并且具有较高的表达水平。
表3-11实时荧光定量引物
Table3-11 Primers forqRT-PCR analysis
Figure BDA0003598665070000111
2.转基因番茄的制备
将步骤1中的黄瓜换为Micro-Tom番茄，其他步骤不变，得到转基因番茄和用作空白对照的野生型Micro-Tom番茄(简称野生型番茄)。
PCR鉴定结果见图4b所示，引物序列见表1，从图4b可以看出在转基因番茄一共获得4株阳性植株，包括S8、S10、S14和S17，6个候选基因和潮霉素筛选基因均表达，(电泳条带从左至右分别为Maker、S8、S10、S14和S17。右下角为maker(4500bp)。
利用实时荧光定量分析对4株阳性植株S8、S10、S14和S17(图4c)进行分析筛选。其中，S8株系中SgP450基因，S14株系中SgCS和SgUGT289-3基因和S17株系中SgEPH2、SgP450和SgUGT269-1基因的表达水平相对较低，其他所有株系的所有罗汉果甜苷合成酶基因均具有较高的表达水平(图4c)。并且在野生型番茄植株中未检测到目标基因的表达，表明在转基因番茄株系中同时表达了6个甜苷合成生物途径中关键酶基因。结果显示罗汉果甜苷合成关键酶基因已经成功转入转基因番茄植株中并且具有较高的基因表达水平(Leactin为内参基因。野生植株设为1。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复)。
HPLC-MS/MS测定分析了4株转基因番茄株系中是否存在甜苷类化合物的积累。根据HPLC的提取离子色谱图(EIC)表明，仅在转基因番茄株系S10中检测到少量的MⅢ成分(图8b)，其保留时间与MⅢ标准品一致(图8a)。而在野生型番茄植株中均未检测到任何甜苷类化合物的合成(图8b)。定量分析表明，S10转基因番茄株系中MⅢ的平均含量为25.92ng/gDW(图8a)。另外，如图11c，d所示，转基因番茄株系S8和S17发现了较少量的罗汉果醇积累。虽然转基因番茄株系中只发现甜苷Ⅲ和罗汉果醇，甜苷Ⅲ有一点甜味，培育了复合型口味的“微甜型番茄”转基因株系。
3.转基因拟南芥的制备
将步骤1中的黄瓜换为哥伦比亚野生型拟南芥，其他步骤不变，得到转基因拟南芥和用作空白对照的哥伦比亚野生型拟南芥(简称野生型拟南芥)。
PCR鉴定结果见图5c所示，引物序列见表1，检测到了6个候选基因及潮霉素筛选基因Hyg，拟南芥的T1代植株一共获得7株阳性植株，分别为AA3、AA5、AA6、AU7、AU10、AU11和A12。(电泳条带从左至右分别为Maker、WT、AA3、AA5、AA6、AU7、AU10、AU11和A12。Atactin为内参基因。右下角为maker(4500bp)。
利用拟南芥阳性植株的cDNA作为模板，内参基因为拟南芥Atactin基因，阴性对照为野生型拟南芥，利用罗汉果SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1、SgUGT289-3基因和Hyg的特异性扩增引物通过PCR扩增鉴定拟南芥阳性植株中罗汉果甜苷合成基因的表达情况。根据凝胶电泳图5d分析可知，虽然不同转基因株系的不同基因表达水平有差异，但是基本上所有拟南芥转基因株系的所有候选基因基本都能够表达。这些结果已经表明，罗汉果甜苷合成酶基因在拟南芥中均成功表达(电泳条带从左至右分别为Maker、WT、AA3、AA5、AA6、AA7、AU6、AU7、AU8、AU10、AU11、AU12和AU13。右下角为maker(4500bp)。
HPLC-MS/MS分析发现转基因拟南芥株系中发现了相对较高含量的甜苷Ⅲ和赛门苷(图5d)，其保留时间与甜苷Ⅲ和赛门苷标准品完全一致(图9a和9b)。但是不同转基因株系中赛门苷的含量差异较大。在AA3、AA6和AU7转基因系中，赛门苷的平均含量分别为29.65、224.57和1036.96ng/g DW(图9b)。同时AA3转基因株系中发现甜苷Ⅲ的积累(图9a)，平均含量约为202.75ng/g DW(图9b)。
4.转基因烟草的制备
将步骤1中的黄瓜换为本氏烟草，其他步骤不变，得到转基因烟草和用作空白对照的野生型烟草。
烟草转基因植株PCR的检测结果如图6b，共有6株转基因烟草能够同时鉴定出6个基因的阳性植株(N16、N22、N30、N32、N45和N47)(电泳条带从左至右分别为Maker、WT、N16、N22、N30、N31、N32、N45、N46、N47和N48。右下角为maker(4500bp)。
由图6c可知，与野生型烟草相比，所有甜苷合成酶基因在转基因烟草株系中都具有超级高的表达量(Nbactin为内参基因。野生植株设为1。数据用平均值±标准差表示，每个样品三次重复)。
HPLC-MS/MS分析结果显示转基因烟草叶片中积累了大量的甜苷II-E和少量的甜苷III(图10a，b)。
结合上述实验可以看出，作为同科植物的黄瓜共享了甜苷V生物合成的大部分基因(图1)，这也有助于未来在黄瓜中甜苷V的积累。而作为一种三萜类化合物，甜苷V合成的底物2，3-氧化鲨烯在植物中极为常见。本研究将利用In-Fusion和2A多肽结合的方法构建了一个含有SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的超级大载体，并且首次成功实现了六个基因同时整合到黄瓜、番茄、烟草和拟南芥转基因植株中。作为模式作物，烟草和拟南芥具有遗传背景明晰和遗传转化体系稳定等特点，是很理想的植物生物工厂。并且在这四个物种都检测出六个外源基因的表达，并且我们在转基因黄瓜果实中检测到了甜苷V及其中间产物罗汉果醇、甜苷IA-1、Ⅱ-E、Ⅲ、SI和V；番茄转基因植株中获得了少量的甜苷Ⅲ和罗汉果醇；而在拟南芥中获得了少量的Ⅲ和SI；而转基因烟草合成了大量甜苷II-E和少量的甜苷III。据此，本研究应用的基于In-Fusion和P2A多肽结合的多基因组装策略，构建方法简便，适用范围广，具有应用于多基因调控的作物育种的潜力。本研究不仅改变了鲜食蔬菜甜味育种的传统模式，由传统的提高糖含量模式向引入非糖非蛋白甜味物质的新模式转变，还为进一步开发多源甜苷原料植物奠定了基础。
实施例3转基因植株中甜苷类化合物的HPLC-MS/MS分析
(1)罗汉果甜苷类化合物的提取
分别称取黄瓜叶片和果实样品10g，番茄果实样品4g，烟草叶片样品5g及拟南芥样品0.1g，液氮研磨成粉末，根据样品量分别加入50mL、30mL和5mL 80％甲醇溶液，震荡混匀，超声提取1h，用甲醇溶液补齐超声损耗。5000rpm离心5min后取上清，随后再加入80％甲醇溶液补齐，40kHz超声1h，合并上清。40℃吹干浓缩至2mL，过膜备用。
(2)HPLC-MS/MS检测
本章所用的HPLC-MS/MS仪器、色谱柱型号、保留时间及离子源等具体参数如表3所示。
表3本章所用罗汉果甜苷化合物的HPLC-MS/MS参数表
Table3 LC-MS parameters ofmogrosidesinthis chapter
Figure BDA0003598665070000131
Figure BDA0003598665070000141
LC-MS/MS参数
Figure BDA0003598665070000142
HPLC-MS/MS测定结果发现，仅在黄瓜果实中发现甜苷V的积累(图7d)，其平均含量约为587.0ng/g DW，野生型黄瓜植株中未发现任何甜苷类化合物(图7b)。而且转基因黄瓜果实和叶片中均检测到了罗汉果醇、甜苷ⅠA-1、Ⅱ-E、Ⅲ、赛门苷(图7c)，其含量如图11a和图11b所示，转基因黄瓜果实罗汉果醇、甜苷ⅠA-1、Ⅱ-E、Ⅲ、赛门苷的平均含量分别为36.89、58.0、74.3、615.0和113ng/g DW，而叶片中的罗汉果醇、甜苷ⅠA-1、Ⅱ-E、Ⅲ、赛门苷分别为12.91、73.19、70.33、734.0和85.51ng/g。在野生型黄瓜植株中均未检测到甜苷类化合物的存在。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 利用转基因植物生产甜苷类化合物的方法
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcgacgagt cagtaataaa cggcgtcaaa gtggttgcag ccggcacaca cgagtcgtgt 60
ttatcaactc aaagcacaaa tacttttcct caacctaaaa ataaggcaat tagccaaaaa 120
caactttgcg tgtaaacaac gctcaataca cgtgtcattt tattattagc tattgcttca 180
ccgccttagc tttctcgtga cctagtcgtc ctcgtctttt cttcttcttc ttctataaaa 240
caatacccaa agagctcttc ttcttcacaa ttcagatttc aatttctcaa aatcttaaaa 300
actttctctc aattctctct accgtgatca aggtaaattt ctgtgttcct tattctctca 360
aaatcttcga ttttgttttc gttcgatccc aatttcgtat atgttctttg gtttagattc 420
tgttaatctt agatcgaaga cgattttctg ggtttgatcg ttagatatca tcttaattct 480
cgattagggt ttcatagata tcatccgatt tgttcaaata atttgagttt tgtcgaataa 540
ttactcttcg atttgtgatt tctatctaga tctggtgtta gtttctagtt tgtgcgatcg 600
aatttgtcga ttaatctgag tttttctgat taacagatgg tgcaacctcg ggtactgctg 660
tttcctttcc cggcactggg ccacgtgaag cccttcttat cactggcgga gctgctttcc 720
gacgccggca tagacgtcgt cttcctcagc accgagtata accaccgtcg gatctccaac 780
actgaagccc tagcctcccg cttcccgacg cttcatttcg aaactatacc ggatggcctg 840
ccgcctaatg agtcgcgcgc tcttgccgac ggcccactgt atttctccat gcgtgaggga 900
actaaaccga gattccggca actgattcaa tctcttaacg acggtcgttg gcccatcacc 960
tgtattatca ctgacatcat gttatcttct ccgattgaag tagcggaaga atttgggatt 1020
ccagtaattg ccttctgccc ctgcagtgct cgctacttat cgattcactt ttttataccg 1080
aagctcgttg aggaaggtca aattccatac gcagatgacg atccgattgg agagatccag 1140
ggggtgccct tgttcgaagg tcttttgcga cggaatcatt tgcctggttc ttggtctgat 1200
aaatctgcag atatatcttt ctcgcatggc ttgattaatc agacccttgc agctggtcga 1260
gcctcggctc ttatactcaa caccttcgac gagctcgaag ctccatttct gacccatctc 1320
tcttccattt tcaacaaaat ctacaccatt ggacccctcc atgctctgtc caaatcaagg 1380
ctcggcgact cctcctcctc cgcttctgcc ctctccggat tctggaaaga ggatagagcc 1440
tgcatgtcct ggctcgactg tcagccgccg agatctgtgg ttttcgtcag tttcgggagt 1500
acgatgaaga tgaaagccga tgaattgaga gagttctggt atgggttggt gagcagcggg 1560
aaaccgttcc tctgcgtgtt gagatccgac gttgtttccg gcggagaagc ggcggaattg 1620
atcgaacaga tggcggagga ggagggagct ggagggaagc tgggaatggt agtggagtgg 1680
gcagcgcaag agaaggtcct gagccaccct gccgtcggtg ggtttttgac gcactgcggg 1740
tggaactcaa cggtggaaag cattgccgcg ggagttccga tgatgtgctg gccgattctc 1800
ggcgaccaac ccagcaacgc cacttggatc gacagagtgt ggaaaattgg ggttgaaagg 1860
aacaatcgtg aatgggacag gttgacggtg gagaagatgg tgagagcatt gatggaaggc 1920
caaaagagag tggagattca gagatcaatg gagaagcttt caaagttggc aaatgagaag 1980
gttgtcaggg gtgggttgtc ttttgataac ttggaagttc tcgttgaaga catcaaaaaa 2040
ttgaaaccat ataaatttta acttggactc ccatgttggc aaaggcaacc aaacaaacaa 2100
tgaatgatcc gctcctgcat atggggcggt ttgagtattt caactgccat ttgggctgaa 2160
ttgaagacat gctcctgtca gaaattccgt gatcttactc aatattcagt aatctcggcc 2220
aatatcctaa atgtgcgtgg ctttatctgt ctttgtattg tttcatcaat tcatgtaacg 2280
tttgcttttc ttatgaattt tcaaataaat tatctgagac ttttcaacaa agggtaatat 2340
ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 2400
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 2460
atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 2520
aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc tccactgacg 2580
taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 2640
catttcattt ggagagaaca atggatgctg cccaacaagg tgacaccaca accattttga 2700
tgcttccatg gctcggctat ggccatcttt cagcttttct cgagctggcc aaaagcctct 2760
caaggaggaa cttccatatc tacttctgtt caacctctgt taatcttgac gccattaaac 2820
caaagcttcc ttcttctttc tctgattcca ttcaatttgt ggagctccat ctcccttctt 2880
ctcctgagtt ccctcctcat cttcacacaa ccaacggcct tccccctacc ctcatgcccg 2940
ctctccacca agccttctcc atggctgccc agcactttga gtccatttta caaacacttg 3000
ccccgcacct tctcatttat gactctcttc aaccttgggc tcctcgggta gcttcatccc 3060
tcaaaattcc ggccatcaac ttcaatacca cgggagtttt cgtcatttct caagggcttc 3120
accctattca ctacccacat tctaaattcc cattctcaga gttcgttctt cacaatcatt 3180
ggaaagccat gtactccact gccgatggag cttctaccga aagaacccgc aaacgtggag 3240
aagcgtttct gtattgcttg catgcttctt gtagtgtaat tctaatcaat agtttcagag 3300
agctcgaggg gaaatatatg gattatctct ctgttctctt gaacaagaaa gttgttccgg 3360
ttggtccttt ggtttacgaa ccgaatcaag acggggaaga tgaaggttat tcaagcatca 3420
aaaattggct tgacaaaaag gaaccgtcct ccaccgtctt cgtgtcattt ggaagcgaat 3480
acttcccgtc aaaggaagaa atggaagaga tagcccatgg gttagaggcg agcgaggtta 3540
atttcatctg ggtcgttagg tttcctcaag gagacaacac cagcggcatt gaagatgcct 3600
tgccgaaggg ttttctggag agggcgggag agagagggat ggtggtgaag ggttgggctc 3660
ctcaggcgaa gatactgaag cattggagca cagggggatt cgtgagccac tgtggatgga 3720
actcggtgat ggagagcatg atgtttggcg ttcccataat aggggttccg atgcatgtgg 3780
accagccctt taacgccgga ctcgtggaag aagctggcgt cggcgtggag gccaagcgag 3840
atccagacgg caaaattcaa agagacgaag ttgcaaagtt gatcaaagaa gtggtggttg 3900
agaaaaccag agaagatgtg cggaagaaag caagagaaat gagtgagatt ttgaggagca 3960
agggagagga gaagtttgat gagatggtcg ctgaaatttc tctcttgctt aaaatatgag 4020
atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga 4080
tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca 4140
tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg 4200
cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta 4260
tgttactaga tccaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctttgg tggagcacga 4320
cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga 4380
gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 4440
tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga 4500
taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 4560
acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 4620
ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga 4680
cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acaatgtgga ctgtcgtgct 4740
cggtttggcg acgctgtttg tcgcctacta catccattgg attaacaaat ggagagattc 4800
caagttcaac ggagttctgc cgccgggcac catgggtttg ccgctcatcg gagagacgat 4860
tcaactgagt cgacccagtg actccctcga cgttcaccct ttcatccaga aaaaagttga 4920
aagatacggg ccgatcttca aaacatgtct ggccggaagg ccggtggtgg tgtcggcgga 4980
cgcagagttc aacaactaca taatgctgca ggaaggaaga gcagtggaaa tgtggtattt 5040
ggatacgctc tccaaatttt tcggcctcga caccgagtgg ctcaaagctc tgggcctcat 5100
ccacaagtac atcagaagca ttactctcaa tcacttcggc gccgaggccc tgcgggagag 5160
atttcttcct tttattgaag catcctccat ggaagccctt cactcctggt ctactcaacc 5220
tagcgtcgaa gtcaaaaatg cctccgctct catggttttt aggacctcgg tgaataagat 5280
gttcggtgag gatgcgaaga agctatcggg aaatatccct gggaagttca cgaagcttct 5340
aggaggattt ctcagtttac cactgaattt tcccggcacc acctaccaca aatgcttgaa 5400
ggatatgaag gaaatccaga agaagctaag agaggttgta gacgatagat tggctaatgt 5460
gggccctgat gtggaagatt tcttggggca agcccttaaa gataaggaat cagagaagtt 5520
catttcagag gagttcatca tccaactgtt gttttctatc agttttgcta gctttgagtc 5580
catctccacc actcttactt tgattctcaa gctccttgat gaacacccag aagtagtgaa 5640
agagttggaa gctgaacacg aggcgattcg aaaagctaga gcagatccag atggaccaat 5700
tacttgggaa gaatacaaat ccatgacttt tacattacaa gtcatcaatg aaaccctaag 5760
gttggggagt gtcacacctg ccttgttgag gaaaacagtt aaagatcttc aagtaaaagg 5820
atacataatc ccggaaggat ggacaataat gcttgtcacc gcttcacgtc acagagaccc 5880
aaaagtctat aaggaccctc atatcttcaa tccatggcgt tggaaggact tggactcaat 5940
taccatccaa aagaacttca tgccttttgg gggaggctta aggcattgtg ctggtgctga 6000
gtactctaaa gtctacttgt gcaccttctt gcacatcctc tgtaccaaat accgatggac 6060
caaacttggg ggaggaacga ttgcaagagc tcatatattg agttttgaag atgggttaca 6120
tgtgaagttc acacccaagg aaggaagcgg agctactaac ttcagcctgc tgaagcaggc 6180
tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat ggtggatcag tgcgcgttgg gatggatctt 6240
ggcctccgcg ctgggcctcg taattgcgct ttgtttcttc gtggctccga ggaggaatca 6300
cagaggagtg gattcgaagg agagggacga gtgcgtccaa agcgctgcaa ccacgaaggg 6360
agaatgcaga ttcaacgatc gcgacgtcga cgttatcgtc gttggcgccg gtgttgccgg 6420
ttccgctctt gctcacactc ttggcaagga tggtcgtcga gttcatgtaa ttgaaagaga 6480
cttgacagag cctgacagaa tcgttggtga attattacaa cctgggggtt acctcaaatt 6540
gattgaatta ggacttcaag actgcgtcga ggagattgat gctcaaaggg tgtatggcta 6600
cgcccttttc aaggatggaa agaacactcg actctcttac ccattggaaa attttcactc 6660
tgatgtatct ggaagaagct ttcacaacgg gcgcttcata cagagaatga gggagaaggc 6720
tgcttccctt cccaatgtca gattggagca agggacagtt acttcgctgc ttgaagaaaa 6780
gggaacgatc aaaggtgtgc agtataagtc taaaaatggt gaagaaaaaa cagcatatgc 6840
acctctgacc attgtttgtg atggctgctt ctcaaacttg cgccgctctc tctgcaaccc 6900
tatggttgat gttccctctt attttgtggg attagttcta gagaattgtg agcttccttt 6960
tgcaaatcac gggcacgtta tcctcggaga tccttctccc attttattct accagattag 7020
caggaccgag atccgttgtt tggttgatgt tcctggtcag aaggttcctt ctatagcaaa 7080
tggtgaaatg gagaaatatt tgaagactgt agtagctcct caggttcccc cgcaaatcta 7140
cgattccttt atcgctgcta tcgacaaggg taatataagg acaatgccaa acagaagcat 7200
gcctgctgct ccccacccaa cgcccggtgc cttactgatg ggtgatgctt tcaacatgcg 7260
ccaccctctt accggtggag gaatgaccgt agcattgtct gatatagttg tattgcggaa 7320
cctcctcaag cctctgaagg acttgagtga tgcatctacc ctctgcaagt atcttgaatc 7380
cttttacact ttgcgaaagc cagtggcttc gaccatcaac acattggcag gggcattata 7440
caaggtcttt tgtgcatcac cagatcaagc taggaaggaa atgcgacaag cttgcttcga 7500
ttacttgagc cttggaggaa tattctcaaa tggacctgtc tccttgcttt cagggttgaa 7560
tcctcgcccc ttaagtttgg ttctccattt ctttgccgtc gcgatatacg gagttggtcg 7620
cttattactt ccatttcctt cagtgaaagg catctggatt ggagctagat tgatctatag 7680
cgcatcaggt atcatattcc caattatacg ggcggaagga gttagacaga tgttcttccc 7740
tgcaactgtt cctgcttatt atagaagtcc accagtgttt aagccaatcg tttaaatatg 7800
aagatgaaga tgaaatattt ggtgtgtcaa ataaaaaggt tgtgtgctta agtttgtgtt 7860
tttttcttgg cttgttgtgt tatgaatttg tggctttttc taatattaaa tgaatgtaac 7920
atctcattat aatgaataaa caaatgtttc tataatccat tgtgaatgtt ttgttggatc 7980
tcttctccag catataacta ctgtatgtgc tatggtatgg actatggaat atgattaaag 8040
ataagtgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc tcctcggatt ccattgccca 8100
gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctccta caaatgccat 8160
cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 8220
ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 8280
caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 8340
tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagagaac aatgtggagg 8400
ttaaaggtcg gagcagaaag cgttggggag aatgatgaga aatggttgaa gagcataagc 8460
aatcacttgg gacgccaggt gtgggagttc tgtccggatg ccggcaccca acaacagctc 8520
ttgcaagtcc acaaagctcg taaagctttc cacgatgacc gtttccaccg aaagcaatct 8580
tccgatctct ttatcactat tcagtatgga aaggaagtag aaaatggtgg aaagacagcg 8640
ggagtgaaat tgaaagaagg ggaagaggtg aggaaagagg cagtagagag tagcttagag 8700
agggcattaa gtttctactc aagcatccag acaagcgatg ggaactgggc ttcggatctt 8760
ggggggccca tgtttttact tccgggtctg gtgattgccc tctacgttac aggcgtcttg 8820
aattctgttt tatccaagca ccaccggcaa gagatgtgca gatatgttta caatcaccag 8880
aatgaagatg gggggtgggg tctccacatc gagggcccaa gcaccatgtt tggttccgca 8940
ctgaattatg ttgcactcag gctgcttgga gaagacgcca acgccggggc aatgccaaaa 9000
gcacgtgctt ggatcttgga ccacggtggc gccaccggaa tcacttcctg gggcaaattg 9060
tggctttctg tacttggagt ctacgaatgg agtggcaata atcctcttcc acccgaattt 9120
tggttatttc cttacttcct accatttcat ccaggaagaa tgtggtgcca ttgtcgaatg 9180
gtttatctac caatgtcata cttatatgga aagagatttg ttgggccaat cacacccata 9240
gttctgtctc tcagaaaaga actctacgca gttccatatc atgaaataga ctggaataaa 9300
tctcgcaata catgtgcaaa ggaggatctg tactatccac atcccaagat gcaagatatt 9360
ctgtggggat ctctccacca cgtgtatgag cccttgttta ctcgttggcc tgccaaacgc 9420
ctgagagaaa aggctttgca gactgcaatg caacatattc actatgaaga tgagaatacc 9480
cgatatatat gccttggccc tgtcaacaag gtactcaatc tgctttgttg ttgggttgaa 9540
gatccctact ccgacgcctt caaacttcat cttcaacgag tccatgacta tctctgggtt 9600
gctgaagatg gcatgaaaat gcagggttat aatgggagcc agttgtggga cactgctttc 9660
tccatccaag caatcgtatc caccaaactt gtagacaact atggcccaac cttaagaaag 9720
gcacacgact tcgttaaaag ttctcagatt cagcaggact gtcctgggga tcctaatgtt 9780
tggtaccgtc acattcataa aggtgcatgg ccattttcaa ctcgagatca tggatggctc 9840
atctctgact gtacagcaga gggattaaag gctgctttga tgttatccaa acttccatcc 9900
gaaacagttg gggaatcatt agaacggaat cgcctttgcg atgctgtaaa cgttctcctt 9960
tctttgcaaa acgataatgg tggctttgca tcatatgagt tgacaagatc atacccttgg 10020
ttggagttga tcaaccccgc agaaacgttt ggagatattg tcattgatta tccgtatgtg 10080
gagtgcacct cagccacaat ggaagcactg acgttgttta agaaattaca tcccggccat 10140
aggaccaaag aaattgatac tgctattgtc agggcggcca acttccttga aaatatgcaa 10200
aggacggatg gctcttggta tggatgttgg ggggtttgct tcacgtatgc ggggtggttt 10260
ggcataaagg gattggtggc tgcaggaagg acatataata attgccttgc cattcgcaag 10320
gcttgcgatt ttttactatc taaagagctg cccggcggtg gatggggaga gagttacctt 10380
tcatgtcaga ataaggtata cacaaatctt gaaggaaaca gaccgcacct ggttaacacg 10440
gcctgggttt taatggccct catagaagct ggccaggctg agagagaccc aacaccattg 10500
catcgtgcag caaggttgtt aatcaattcc cagttggaga atggtgattt cccccaacag 10560
gagatcatgg gagtctttaa taaaaattgc atgatcacat atgctgcata ccgaaacatt 10620
tttcccattt gggctcttgg agagtattgc catcgggttt tgactgaata agatcgttca 10680
aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 10740
atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 10800
tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 10860
aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 10920
gatccaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttt ggtggagcac gacacacttg 10980
tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca aagggcaatt gagacttttc 11040
aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg cccagctatc tgtcacttta 11100
ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa 11160
aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga 11220
ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg 11280
atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct 11340
ctatataagg aagttcattt catttggaga gaacaatgga aaacatcgaa cacaccaccg 11400
ttcaaaccaa cggcatcaaa atgcatgtcg ccgccatcgg aacaggccca ccggtgcttc 11460
tcctccacgg cttcccggag ctctggtact cctggcgcca ccagctcctc tacctctcct 11520
ccgccggcta ccgcgccatc gcccccgacc tccgcggcta cggcgacacc gacgcgccgc 11580
cctctccctc ctcctacacg gccctccaca tcgtcggcga cctggtgggg ctcctcgacg 11640
tgctggggat cgaaaaagtc ttcttaatcg gccatgactg gggagctata atcgcctggt 11700
atttctgctt gttcagaccc gatcggatca aagccttggt gaatctgagc gtccagttct 11760
tccccagaaa ccccaccacg ccatttgtca aaggcttcag tgctgttctg ggcgaccagt 11820
tctacatggt caggtttcag gaaccgggga aggccgagga agaatttgcc tcagtggaca 11880
tacgagagtt tttcaagaac gtgttgtcga atcgtgaccc acaagctcca tatttgccga 11940
atgaagtgaa gttcgaaggg gttccgccgc cggcgcttgc tccgtggctc acgccggaag 12000
atatcgacgt ttacgccgac aagttcgccg agactggctt caccggcgga ctgaattatt 12060
atcgagcttt tgaccgaacc tgggagctaa cggcgccatg gacgggggca cggatcgggg 12120
taccggtgaa gttcatcgtc ggggacttgg atctgaccta ccattttcca ggagctgaga 12180
agtacatcca tggcgagggg ttcaaaaagg ctgtgccagg tttggaagaa gtggttgtaa 12240
tggaagacac ttcctacttc atcaaccaag aaaggcctca tgaaatcaac tctcacatcc 12300
atgatttctt ctctaagttc tgttaagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 12360
gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 12420
agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 12480
gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 12540
ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcc aggaaacagc tatgaccatg 12600
attacgccaa gctttggtgg agcacgacac acttgtctac tccaaaaata tcaaagatac 12660
agtctcagaa gaccaaaggg caat 12684
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtggatc agtgcgcg 18
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaaacactg gtggacttct ataataag 28
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtggaggt taaaggtcgg agc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttattcagtc aaaacccgat ggc 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggaaaaca tcgaacacac 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
taacagaact tagagaagaa atc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtggactg tcgtgctcgg 20
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcattccttg ggtgtgaact tcacatgt 28
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggtgcaac ctcgggta 18
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttaaaattta tatggtttca atttt 25
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggatgctg cccaacaa 18
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcatatttta agcaagagag aaatttca 28
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttggcgacct cgtattggga 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caagacctgc ctgaaaccga a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcttcgacca tcaacacatt g 21
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttcctccaag gctcaagtaa tc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttgggttga agatccctac tc 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccacaactgg ctcccattat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gatgttcggt gaggatgcga 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tggtgccggg aaaattcagt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agctttggct ccatggttga 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccaggttct gtcaaaggct 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccgattgaag tagcggaaga a 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cctcaacgag cttcggtata aa 22
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cagagaagat gtgcggaaga a 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcagcgacca tctcatcaaa c 21
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ataaaagacc cagcaccaca ttc 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cccttgccga ctacaacatc c 21
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attcttgcat ctctaagtac cttcc 25
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ccaactaaag ggaaataact cacc 24
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tattccctag tattgttggc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctggggtatt aaaagtctca 20
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccaggtattg ctgatagaat gag 23
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagcctccaa tccagacac 19
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cacttgcacc aagcagcatg aaga 24
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aatggaacca ccgatccaga cac 23

Claims (10)

1.一种载体，其特征在于，所述载体中含有SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因；
其中，所述SgSQE1基因为序列表中序列1中的第6209-7795位所示；
所述SgCS基因为序列表中序列1中的第8392-10671位所示；
所述SgEPH2基因为序列表中序列1中的第11376-12326位所示；
所述SgP450基因为序列表中序列1中的第4724-6142位所示；
所述SgUGT269-1基因为序列表中序列1中的第637-2061位所示；
所述SgUGT289-3基因为序列表中序列1中的第2661-4019位所示。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体为包含SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因的pCAMBIA1300载体。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体为将载体pCAMBIA1300的EcoRI位点与HindIII位点之间的序列替换为序列1所示的序列，并保持其他序列不变，得到的重组载体pCAMBIA1300-6。
4.权利要求1-3任一所述的载体在改善植物口感中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。
6.权利要求1所述的载体的制备方法，其特征在于，包括分批次将SgSQE1、SgCS、SgEPH2、SgP450、SgUGT269-1和SgUGT289-3基因导入pCAMBIA1300的步骤。
7.权利要求6所述的制备方法在改善植物口感中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。
9.一种改善植物口感的方法，其特征在于，使用包含权利要求1-3任一所述的载体或者权利要求6制备的载体的农杆菌转染目的植物的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物为园艺作物，所述园艺作物为黄瓜、番茄、拟南芥或者烟草。
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