CN113355350B - 一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用，涉及分子生物学技术领域；本发明公开一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO：1‑5的至少一种；通过所述靶位点序列构建CRISPR/Cas9表达载体后，采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，可定向的、精准的编辑特定位点，从而可以在较短的周期内获得高含量萝卜硫苷的芥蓝，节省了时间、人力和成本，且所述高含量萝卜硫苷的芥蓝具有较稳定的遗传特性。

Description

一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用。
背景技术
芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)，为十字花科芸薹属一年生草本植物，是中国的特产蔬菜之一。芥蓝主要以肥嫩的花薹和嫩叶作为食用部分，营养丰富，富含芥子油苷、类胡萝卜素、维生素C等营养成分，具有很高的营养价值和保健作用，深受人民群众的喜爱。
芥子油苷，又名硫代葡萄糖苷(Glucosinolates，GS)，是一类含氮和硫的植物次生代谢物质，通常情况下可以与钠盐或钾盐的形式存在于细胞质中。芥子油苷是一类仅在十字花科植物中发现的次生代谢物质。芥子油苷及其降解产物具有重要的生物学功能，例如杀菌杀虫作用，化学防御癌症作用。但不同种类的芥子油苷其活性也不尽相同，例如脂肪类芥子油苷萝卜硫苷(Glucoraphanin，GRA)的降解产物萝卜硫素是迄今为止发现的一种抗癌活性最强的天然植物化学物质，而3-丁烯基芥子油苷(Gluconapin，GNA)的抗癌活性较小，且对蔬菜中的苦味有所贡献。
芥蓝中芥子油苷含量较为丰富，以3-丁烯基芥子油苷为主，达到总芥子油苷的50％以上，而具有抗癌活性的萝卜硫苷含量极低，通常不足3-丁烯基芥子油苷含量的3％。由于芥蓝所有品种都是如此，因此利用常规杂交育种的方式无法获得高含量萝卜硫苷的芥蓝材料。虽然常规杂交育种是一种普遍的获得新品种的育种方式，但这种育种方式周期长，一般需要5-10年，且盲目性高、工作量巨大，且其结果是无法预期的。而化学诱变的方法同样存在耗时长、盲目性高、工作量大的问题。
短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated 9，CRISPR/Cas9)是一种全新的基因组编辑技术，可对DNA进行定点编辑，较常规转基因方法具有明显优势，越来越多的研究人员对其产生了兴趣。如今，CRISPR/Cas9基因编辑技术已成功的应用于多种植物基因编辑研究，如烟草、拟南芥、小麦、水稻、玉米等。在拟南芥和水稻的研究中揭示CRISPR/Cas系统具有较高的特异性，因此利用CRISPR/Cas系统改良作物性状，提高作物的产量、品质、抗逆性、抗病性成为可能。因此，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究一种创制高含量萝卜硫苷的芥蓝材料的方法，能定向的、精准的进行基因编辑，更能将育种时间缩短到1-2年，既解决了常规杂交育种周期长、盲目性高、工作量大的问题，又解决了利用常规杂交育种无法获得高含量萝卜硫苷的芥蓝材料的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO：1-5的至少一种。
本发明还提供一种CRISPR/Cas9表达载体，所述CRISPR/Cas9表达载体包含所述的靶序列。
本发明还提供一种高含量萝卜硫苷芥蓝的创制方法，所述创制方法为：利用所述的靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体后进行遗传转化。
进一步的，所述靶序列为以下任意一种：
(1)SEQ ID NO：1-5中的任意一种；
(2)SEQ ID NO：1-5的任意相同或不相同的两种串联而成；
(3)SEQ ID NO：1-5的任意相同或不相同的三种串联而成。
进一步的，所述构建CRISPR/Cas9表达载体的步骤为：
(1)根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA序列，并在其5’端分别添加酶切位点，退火复性得到具有粘性末端的DNA双链序列；
(2)采用限制性内切酶Bbs I酶切pSG载体，获得酶切产物；
(3)将步骤(2)所述酶切产物与步骤(1)所述DNA双链序列进行连接后，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，挑取单菌落进行震荡培养，获得pSG-Target重组质粒；
(4)使用EcoR I-HF和Xba I内切酶，将步骤(3)所述的pSG-Target重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，获得酶切产物；
(5)将步骤(4)所述的酶切产物进行连接，获得pCC-Target-sgRNA载体，转化农杆菌感受态，获得芥蓝Target-CRISPR/Cas9表达载体。
进一步的，所述遗传转化为农杆菌介导的遗传转化。
进一步的，所述农杆菌介导的遗传转化的具体步骤为：
(1)将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上生长；
(2)切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上生长；
(3)取芥蓝CRISPR/Cas9表达载体，接种于含抗生素的LB或YEB固体培养基上获得单克隆，挑取所述单克隆于含抗生素的YEB或LB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，以1∶100的比例放大培养，取获得的菌液离心收菌，用等体积的MS液体培养基悬浮后获得农杆菌菌液；
(4)所述农杆菌菌液活化后浸染预培养后的带柄子叶，将侵染后的带柄子叶按顺序置于M3、M4和M5培养基上培养；不定芽长至1-2cm时在M5培养基中进行继代培养，待不定芽长到3-4cm时在M6培养基中进行生根培养，即获得农杆菌介导的遗传转化后的植株。
进一步的，所述继代培养为每隔20天继代一次。
进一步的，所述M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，pH值为5.8；
M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，pH值为5.8；
M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，pH值为5.8；
M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，pH值为5.8；
M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B10-15mg/L，pH值为5.8；
M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B10-15mg/L，pH值为5.8。
本发明还提供一种所述的靶序列或所述的CRISPR/Cas9表达载体在创制高含量萝卜硫苷芥蓝中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)在本发明方法中重点在于对缩短育种周期的体现，具体为：常规杂交育种或化学诱变育种周期长，可达5-10年，本发明通过可用的靶位点序列构建CRISPR/Cas9表达载体，最后采用根癌农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因突变植株。该技术的试验周期只需要1-2年，且得到的突变植株有较稳定的遗传特性。其从原理上体现了本发明高效的优势，节省了时间成本。
(2)在本发明方法中重点在于对定向、精准编辑的体现，具体为：常规杂交育种和化学诱变育种往往是具有盲目性的，其结果是无法预期的，本发明采用几个不同的靶序列进行单个靶位点、多个靶位点串联的方式，定向的、精准的编辑特定位点，从而得到高含量萝卜硫苷的芥蓝材料。
(3)由于常规杂交育种和化学诱变育种往往是具有盲目性的，因此在品种选育中需要创制大量群体，这就带来了工作量巨大的问题，费时费工费成本。本发明采用定向编辑的方法，可以将工作量显著下降，明显降低了对时间、人力和成本的需求。
(4)在本发明方法中重点在于能得到高含量萝卜硫苷的芥蓝材料的体现，具体为：芥蓝中芥子油苷以3-丁烯基芥子油苷为主，达到总芥子油苷的1/2以上，而具有抗癌活性的萝卜硫苷含量极低，通常不足3-丁烯基芥子油苷的3％。由于芥蓝所有品种都是如此，因此利用常规杂交育种的方式无法获得高含量萝卜硫苷的芥蓝材料。本发明采用农杆菌介导的CRISPR稳定遗传的方法，获得突变体材料，从而得到高含量萝卜硫苷的芥蓝材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为高含量萝卜硫苷芥蓝创制方法的流程图；
图2为实施例1构建的1号靶序列的CRISPR/Cas9表达载体结构图；
图3为实施例1获得的芥蓝植株；
图4为实施例1获得的Target 1-CRISPR/Cas9表达载体的转基因阳性植株的潮霉素抗性基因检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明的靶位点序列如表1所示：
表1可用的5个靶位点序列
本发明使用的培养基：
(1)M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，且pH值为5.8；
(2)M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，且pH值为5.8；
(3)M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸0.03mg/L，且pH值为5.8；
(4)M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，且pH值为5.8；
(5)M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B10-15mg/L，且pH值为5.8；
(6)M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B10-15mg/L，且pH值为5.8。
实施例1单靶位点的稳定遗传转化与高含量萝卜硫苷芥蓝材料的筛选
1.1构建芥蓝1号靶位点单独的CRISPR/Cas9表达载体(图2)，具体包括以下步骤：
(1)靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成一对互补的Oligo DNA序列，并在其5’端分别添加酶切位点，然后退火复性，得到具有粘性末端的DNA双链序列。其中，退火复性的反应程序为：95℃变性5min，1℃30s，降温至25℃，4℃保存。
(2)pSG载体的酶切：采用限制性内切酶Bbs I酶切pSG载体，酶切过程为37℃反应过夜，接着65℃反应20min，然后对酶切产物进行回收。
(3)连接和转化：将回收后的酶切产物与退火复性后的DNA双链序列进行连接，连接过程为16℃反应30min后，置于4℃反应过夜，接着转化大肠杆菌感受态细胞，再进行涂板，最后挑取单菌落进行震荡培养，并对菌液进行PCR鉴定，以确保该基因重组质粒的sgRNA片段完全正确。经PCR扩增后，可知扩增出与预期大小相近的条带，由此可知，成功构建了pSG-Target 1重组质粒。
(4)重组质粒和pCC质粒的双酶切：使用EcoR I-HF和Xba I内切酶，将构建好的pSG-Target 1重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，双酶切过程为：37℃酶切3h后，置于65℃反应20min。然后回收酶切产物。
(5)连接、转化和鉴定：将步骤(4)获得的酶切产物进行连接，即将sgRNA插入pCC载体的多克隆位点处，与pCC融合形成pCC-Target 1-sgRNA载体，最后转化农杆菌感受态GV3101，再进行涂板，挑取单菌落进行PCR鉴定。最后将构建成功的芥蓝Target1-CRISPR/Cas9表达载体保存于甘油中，-80℃贮藏，备用。
1.2农杆菌介导的遗传转化
具体过程如下：
(1)无菌苗的培养：将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上，生长7d。
(2)预培养：切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上，生长4d。
(3)农杆菌菌液的制备：取-80℃保存的芥蓝Target1-CRISPR/Cas9表达载体，划线于含抗生素的LB或YEB固体培养基上，再挑取单克隆于含抗生素的YEB或LB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养24h，PCR检测阳性克隆，后以1∶100的比例放大培养，取获得的菌液离心收菌，用等体积的MS液体培养基悬浮后用于浸染。
(4)共培养：用活化好的农杆菌菌液浸染预培养后的带柄子叶，再将其转入M3培养基上，暗培养3天。
(5)延迟筛选：将共培养后的叶片转入M4培养基上，培养一周。
(6)抗性筛选：将步骤(5)所得物转入M5培养基进行培养，待不定芽长至1-2cm时进行下一个步骤。
(7)继代培养：生长在抗性培养基上的外植体及长出的抗性芽，每隔20天继代一次(继代培养所用培养基为M5培养基)，待不定芽长到3-4cm时转入下个步骤；
(8)生根培养：将步骤7所得物转入M6培养基中进行生根培养，待根系长达3-5cm时即可进行炼苗移栽。
1.3转基因抗性植株Hyg潮霉素抗性检测
先提取抗生素培养基上筛选出的抗性植株的染色体组DNA，根据载体上所含的潮霉素抗性基因设计特异性引物，使用特异性引物Hyg-F和Hyg-R(表2)进行PCR扩增，并进行电泳检测，筛选转基因阳性植株，统计转化率。
表2 Hyg潮霉素抗性检测时所用引物
1.4转基因植株芥子油苷组分及含量分析
采取HPLC法进行芥子油苷组分与含量分析，具体操作如下：
将冷冻干燥的样品(25mg)在1mL水中煮沸10min。离心(5min，7000×g)后收集上清液，并将残留物用水洗涤一次，离心，并与先前的提取物合并。将水提取物上样到DEAE-Sephadex A-25柱上。该柱用1mL乙酸吡啶酯洗涤3次，并用1mL水洗涤两次。100μL0.1％芳基硫酸酯酶过夜处理，将芥子油苷转化为它们的脱硫类似物，然后用2×0.5mL水洗脱去硫代芥子油苷。使用HPLC仪器对芥子油苷进行HPLC分析，在30℃下，使用乙腈和水以1mL/min的流速在Waters Spherisorb C18色谱柱上分离样品。该程序在开始的5min内使用1.5％乙腈等度洗脱；在接下来的15min内线性梯度洗脱至20％乙腈；然后在最后10min内用20％乙腈等度洗脱。
1.5统计结果
1.5.1CRISPR/Cas9系统介导的芥蓝转化率的统计
通过上述制备方法，共获得了14株抗性植株，部分植株如图3。分别提取这14株植株的总DNA，使用特异引物(表2)进行PCR扩增，发现空载、质粒及13株植株均扩增出558bp的目的条带，而水、野生型植株和A13未扩增出任何条带，表明除1株假阳性植株(A13)外，目标片段已转入其余13株芥蓝植株中，计算Target1-CRISPR/Cas9表达载体的转基因阳性率为92.31％(图4)。
1.5.2转基因植株芥子油苷组分与含量分析
对这13株转基因株系的芥子油苷组分与含量进行了检测与分析，其中以WT野生型芥蓝和空载转基因植株作为对照。野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。13株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.279-1.476μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(A26和A50)，与野生型含量相当的植株有3株(A45、A84和A86)，显著低于野生型植株的有8株(A17、A57、A62、A70、A73、A104、A107和A108)(表3)。
对这13株转基因突变株系以及空载和野生型芥蓝植株进行了总脂肪族芥子油苷、GNA和GRA的含量分析，结果表明(表3)，转基因突变株的GNA含量显著低于野生型(空载植株、A26和A45除外)，GRA含量显著高于野生型(空载植株和A45除外)。在这13株转基因突变植株中，突变株A107的GRA含量最高(0.363μmol/g)，是野生型的77倍。
综上所述，通过本发明方法，获得了13株转基因阳性植株。进一步对这13株突变株的芥子油苷组分以及含量进行了分析，结果表明，突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株(A45除外)，其中A107突变株的萝卜硫苷含量高达野生型植株的77倍，而GRA/GNA比值也显著提高。因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
表3 1号靶位点转基因植株芥子油苷组分与含量
注：*代表与同列的WT数据存在显著差异(p<0.05)，下表同。
实施例2
除实施例1外，本发明还建立了不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，包括单独靶位点(2号，3号，4号，5号)、串联靶位点(1号-3号、4号-4号、2号-5号、1号-2号-3号、2号-4号-5号、3号-3号-5号、1号-1号-1号和1号-2号-3号)，不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体的构建方法同实施例1。
以WT野生型芥蓝和空载转基因植株作为对照，对上述不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体的转基因植株芥子油苷组分与含量分析，结果如表4-15所示。
2.1 2号靶位点
表4 2号靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.762-1.987μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(B38和B101)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中B38的GRA含量最高(0.375μmol/g)，是野生型的75倍；除空载、B38和B101外，3株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.2 3号靶位点
表5 3号靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。4株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.612-1.536μmol/g，其中显著高于野生型植株的有1株(C31)。
4株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中C31的GRA含量最高(0.284μmol/g)，是野生型的57倍；除C31外，空载与其余三株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.3 4号靶位点
表6 4号靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.743-1.712μmol/g，其中显著高于野生型植株的有1株(D35)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中D46的GRA含量最高(0.412μmol/g)，是野生型的82倍；除空载和D35外，4株突变株的GNA含量低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.4 5号靶位点
表7 5号靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.743-1.712μmol/g，其中显著高于野生型植株的有1株(E25)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中E55的GRA含量最高(0.402μmol/g)，是野生型的80倍；除空载和E25外，4株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.5 1号和3号靶位点串联
表8 1号和3号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.658-1.532μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(F15和F28)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中F28的GRA含量最高(0.372μmol/g)，是野生型的74倍；除空载和F28外，4株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.6 4号和4号靶位点串联
表9 4号和4号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.758-1.432μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(G29和G39)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中G29的GRA含量最高(0.363μmol/g)，是野生型的73倍；除空载外，5株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.7 2号和5号靶位点串联
表10 2号和5号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。4株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.835-1.122μmol/g，其中显著高于野生型植株的有1株(H44)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中H44的GRA含量最高(0.317μmol/g)，是野生型的63倍；除空载外，4株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.8 1号、2号和3号靶位点串联
表11 1号、2号和3号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。4株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.708-1.052μmol/g。
4株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中J14的GRA含量最高(0.355μmol/g)，是野生型的71倍；除空载和J36外，3株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.9 2号、4号和5号靶位点串联
表12 2号、4号和5号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.792-1.321μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(K48和K57)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中K48的GRA含量最高(0.343μmol/g)，是野生型的69倍；除空载外，5株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.10 3号、3号和5号靶位点串联
表13 3号、3号和5号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.608-1.032μmol/g。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中L39的GRA含量最高(0.356μmol/g)，是野生型的71倍；除空载外，5株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.11 1号、1号和1号靶位点串联
表14 1号、1号和1号串联靶位点
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.535-1.232μmol/g，其中显著高于野生型植株的有2株(M37和M46)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中M78的GRA含量最高(0.343μmol/g)，是野生型的69倍；除空载和M46外，4株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
2.12 1号、2号和3号靶位点串联
表15 备用
野生型和空载植株的总脂肪族芥子油苷含量为1.049μmol/g和1.200μmol/g，其中烯基芥子油苷GNA的含量最高，达到0.777μmol/g和0.894μmol/g。5株突变株的总脂肪族芥子油苷的含量范围为0.634-1.245μmol/g，其中显著高于野生型植株的有1株(N45)。
5株突变株的GRA含量均显著高于野生型，其中N58的GRA含量最高(0.374μmol/g)，是野生型的75倍；除空载外，5株突变株的GNA含量显著低于野生型。突变株的萝卜硫苷含量和GRA/GNA的比值均高于野生型和空载植株，因此，我们利用本发明方法成功创制了高含量萝卜硫苷的芥蓝稳定遗传材料。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种用于创制高含量萝卜硫苷芥蓝的靶序列及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatgtaatg gtgagaagaa tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagaagtg ggttgaagtg agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgtaaagctc ttgaagacta cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcatatgat agagtgtcag agg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtagtcttc aagagcttta cgg 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgattgcgtc gcatcgacc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttctacaacc ggtcgcggag 20

Claims (6)

1.一种靶序列或CRISPR/Cas9表达载体在创制高含量萝卜硫苷芥蓝中的应用，其特征在于，所述靶序列为以下任意一种：
(1)SEQ ID NO：4；
(2)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：4相同靶位点串联；
(3)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5三种串联而成；
所述CRISPR/Cas9表达载体包含所述的靶序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述创制高含量萝卜硫苷芥蓝的方法为：利用所述靶序列构建CRISPR/Cas9表达载体后进行遗传转化。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建CRISPR/Cas9表达载体的步骤为：
(1)根据选定的靶序列，合成一对互补的OligoDNA序列，并在其5’端分别添加酶切位点，退火复性得到具有粘性末端的DNA双链序列；
(2)采用限制性内切酶BbsI酶切pSG载体，获得酶切产物；
(3)将步骤(2)所述酶切产物与步骤(1)所述DNA双链序列进行连接后，转化大肠杆菌感受态细胞，涂板，挑取单菌落进行震荡培养，获得pSG-Target重组质粒；
(4)使用EcoRI-HF和XbaI内切酶，将步骤(3)所述的pSG-Target重组质粒、pCC质粒分别进行双酶切，获得酶切产物；
(5)将步骤(4)所述的酶切产物进行连接，获得pCC-Target-sgRNA载体，转化农杆菌感受态，获得芥蓝Target-CRISPR/Cas9表达载体。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述遗传转化为农杆菌介导的遗传转化。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述农杆菌介导的遗传转化的具体步骤为：
(1)将芥蓝种子表面消毒后，接种于M1培养基上生长；
(2)切取无菌苗带柄子叶，接种于M2培养基上生长；
(3)取芥蓝CRISPR/Cas9表达载体，接种于含抗生素的LB或YEB固体培养基上获得单克隆，挑取所述单克隆于含抗生素的YEB或LB液体培养基中，黑暗条件下振荡培养，以1∶100的比例放大培养，取获得的菌液离心收菌，用等体积的MS液体培养基悬浮后获得农杆菌菌液；
(4)所述农杆菌菌液活化后浸染预培养后的带柄子叶，将侵染后的带柄子叶按顺序置于M3、M4和M5培养基上培养；不定芽长至1-2cm时在M5培养基中进行继代培养，待不定芽长到3-4cm时在M6培养基中进行生根培养，即获得农杆菌介导的遗传转化后的植株；
所述M1培养基包括1/2MS培养基、蔗糖20g/L和琼脂粉7.5g/L，pH值为5.8；
所述M2培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L和2，4-二氯苯氧乙酸0.5mg/L，pH值为5.8；
所述M3培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L和萘乙酸20.03mg/L，pH值为5.8；
所述M4培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L、羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L，pH值为5.8；
所述M5培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、6-苄氨基嘌呤0.75mg/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及的潮霉素B10-15mg/L，pH值为5.8；
所述M6培养基包括MS培养基、蔗糖20g/L、琼脂粉7.5g/L、萘乙酸0.03mg/L，羧苄西林300-350mg/L和特美汀300-350mg/L以及潮霉素B10-15mg/L，pH值为5.8。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述继代培养为每隔20天继代一次。
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