CN114836055A - 一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，涉及天然色素生产技术领域，包括以下步骤：(1)将甜菜根与固定化酶加入pH4～6的缓冲溶液中，在40～55℃恒温水浴下酶解70～180min；所述固定化酶含有果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶；(2)将固定化酶去除，再置于超声波水浴中提取，得甜菜色素。本发明方法得到的产品中甜菜色素的含量大大提高；且抗氧化活性高于传统提取方法、酶法和超声法得到的甜菜色素，有着更为良好的生物活性。
Description
技术领域
本发明涉及天然色素生产技术领域，特别涉及固定化酶提取技术，进一步涉及一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法。
背景技术
甜菜是一种糖料作物，在我国主要种植于新疆、山东等地。甜菜根中含有多种活性物质如类胡萝卜素、维生素等，具有很高的营养价值，同时还含有大量甜菜色素，是天然色素的重要来源之一。
甜菜色素具有良好的生物活性，如：抗氧化活性、抑制肿瘤细胞增殖、抗氧化应激等，被应用于生活的各领域，特别是在食品工业如冰淇淋、汽水等产业有着广泛的应用。甜菜色素主要由红色的甜菜红素和黄色的甜菜黄素组成，主要存在于甜菜根细胞的液泡中。
作为一种天然色素，甜菜色素的缺点是稳定性差，对温度极其敏感，因此对提取条件和提取方法提出了严格的要求。传统的甜菜色素提取方法主要采用固液萃取法，此方法存在着溶剂用量大、提取时间过长等问题，长时间的提取会导致目标化合物的分解，进而使产品得率下降。目前被用于甜菜色素的提取方法如双水相萃取法、微波辅助提取法等存在条件不够温和、提取率低等问题。
因此，如何提供一种稳定性高和提取率高的甜菜色素提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法。本方法具有反应条件温和、成本低、效率高、易从体系分离、可重复利用等优点，且实现了提取率和提取效率的双提高，能够减少甜菜色素在提取过程中的损失，还能重复利用固定化酶从而实现成本的降低。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，包括以下步骤：
(1)将甜菜根与固定化酶加入pH4～6的缓冲溶液中，在40～55℃恒温水浴下酶解70～180min；
其中，所述固定化酶含有果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶；
(2)酶解完毕之后，去除固定化酶，再置于超声波水浴中提取，得甜菜色素。
本发明将果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶进行复配并固定化后，用于甜菜色素的提取，一方面固定化提高了酶的耐热性和稳定性，增加了提取效率，且固定化酶易与提取体系相分离，能够重复利用，节约成本；另一方面，复合酶对甜菜细胞壁降解地更有针对性且彻底，使甜菜色素更多的从细胞器中溶出。超声提取与固定化酶提取相结合，反应条件更为温和，有助于提高提取效率和收率。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述甜菜根与所述固定化酶的质量比为100:0.3～1.5。
更优选的，所述甜菜根与固定化酶的质量比为100:0.9，所述缓冲液pH值为5.0，所述酶解的温度为50℃，酶解的时间为150min。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)所述固定化酶的制备方法为：(1)以3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为表面改性剂对磁性氧化三铁纳米粒子进行氨基功能化，得氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子；
(2)以戊二醛作为交联剂，把所述果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶固定在氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子上，得固定化酶；
其中，所述固定化酶中果胶酶、半纤维素酶与纤维素酶的质量比为1:1:1；所述果胶酶的活力为400u/mg，所述半纤维素酶的活力为5u/mg，所述纤维素酶的活力为400u/mg。
更优选的，所述固定化酶的制备方法为：将3-6g四氧化三铁纳米离子加入300mL乙醇和水的混合溶液(乙醇与水体积比为1：2-2:1)中，再加入10-20ml3-氨基丙基三乙氧基硅烷搅拌10-20h，用磁铁对混合物进行分离，再用去离子水和乙醇洗涤，得到氨基功能化的四氧化三铁纳米离子；取50-200mg氨基功能化四氧化三铁纳米粒子加入30mL乙酸缓冲液(1mol/L，pH5.0)中，然后在其中加入10-50mmol戊二醛和10-30mg果胶酶、10-30mg半纤维素酶和10-30mg纤维素酶的混合酶，混合物体系在20-40℃恒温环境下搅拌2h得到负载酶；随后将负载酶的磁性纳米粒子用磁铁吸出，用乙酸缓冲液冲洗得到固定化酶。
作为本发明优选的技术方案，所述pH5.0的缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠的混合液。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述将固定化酶去除的方法为磁铁吸除。
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)所述超声波水浴提取的参数为超声功率100-480W，超声频率40KHz，超声时间20-50min。
更优选的，步骤(2)所述超声波水浴提取的参数为超声功率480W，超声频率40KHz，超声时间30min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种固定化酶辅助超声从甜菜根中提取甜菜色素的方法，该方法具有以下有益效果：
(1)本发明所用的由果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶组成的固定化复合酶能够对植物细胞壁进行酶解，有助于甜菜色素从细胞内释放，此外超声波的作用可以产生声空化，促进溶剂穿透植物基质细胞壁，使目标化合物更好地释放到萃取溶剂中，使得到的产品中甜菜色素的含量大大提高。
(2)本发明所得的甜菜色素的抗氧化活性高于传统提取方法、酶法和超声法得到的甜菜色素，有着更为良好的生物活性。
(3)相较目前常规的甜菜色素提取方法，本发明所得用的条件更为温和，与对于现有的超声辅助提取甜菜色素的方法相比，本发明所用酶为具有磁性固定化复合酶，通过磁铁即可将其从体系中分离，可重复利用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例提取的甜菜色素产量示意图；
图2附图为本发明实施例提取的甜菜色素热稳定性测定示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，所用原料均为市售可得，对其来源不做具体限定。所用方法如无特别提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)制备固定化酶
将6g四氧化三铁纳米粒子加入300ml乙醇和水(体积比为1:1)的混合物中，把18mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为表面改性剂加入到上述混合物中，搅拌19h；用磁铁对混合物进行分离，之后用去离子水洗涤三次，再用无水乙醇洗涤1次得到氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子；将100mg氨基功能化四氧化三铁纳米粒子加入30mL的pH为5.0乙酸缓冲液中，然后在其中加入40mmol戊二醛和的果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶各25mg，混合物体系在30℃恒温环境下搅拌2h；随后将负载酶的磁性纳米粒子用磁铁吸出，用醋酸缓冲液冲洗得到固定化酶。
(2)提取甜菜色素
将甜菜根洗净去皮，切成0.5*0.5*2cm3的长方体，将甜菜根与固定化酶(甜菜根与固定化酶的质量比为100:0.9)混合于pH为5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中，在50℃恒温水浴条件下进行酶解提取150min。
用磁铁去除固定化酶后，将甜菜根置于480W，工作频率为40KHz的超声波水浴中提取30min后得到甜菜色素。
实施例2
调整酶解提取恒温水浴温度为40℃，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例3
调整酶解提取恒温水浴温度为55℃，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例4
调整柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液pH为4.0，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例5
调整柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液pH为6.0，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例6
调整酶解提取时间为70min，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例7
调整酶解提取时间为180min，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例8
实施例1方式去掉制备固定化酶和酶解步骤，其他环节相同。
实施例9
调整使用的固定化酶为未负载复合酶的固定化体系，其他操作均与实施例1相同，提取得到甜菜色素。
实施例10
传统法提取：将甜菜根洗净去皮，切成0.5*0.5*2cm3的长方体，将甜菜根置于pH为5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中，在50℃恒温水浴条件下进行提取150min，得到甜菜色素。
效果例1
统计实施例1-12所得甜菜色素的含量，测定方法为：
所有提取物中甜菜色素含量用紫外可见分光光度计进行测量。波长为480nm的是甜菜红素，波长为538nm的是甜菜黄素。甜菜色素含量由公式(1)计算：
其中A为吸光度，FD为稀释因子，1为比色皿长度；甜菜红素的分子质量(MM)和摩尔消光系数(e)分别为：MM＝550g/mol，e＝60000.0g/mol·cm，甜菜黄素的分子质量(MM)＝308g/mol，e＝48000.0g/mol·cm，结果用mg/g表示。结果如表1所示。
表1
不同提取方法(实施例1代表超声-酶法、实施例8代表超声法和实施例10代表传统法)得到的甜菜色素的含量参见附图1，如附图1所示，固定化酶辅助超声法提取甜菜黄素和甜菜红素的含量高于传统法、超声法(p＜0.05)。仅使用超声法进行提取过程中，由于缺少复合酶对植物细胞中纤维素、半纤维素和果胶等物质的降解作用，相同功率和作用时间下超声并不能使植物细胞壁等完全被破坏，导致提取的甜菜色素含量不如本发明的超声波-酶法高。如果对原料长时间进行超声处理或高功率处理会使反应温度提高，导致甜菜色素的分解。
既使用固定化酶又使用超声对甜菜色素进行提取，复合酶能够对植物细胞壁中的果胶，纤维素，半纤维素进行降解，以促进甜菜色素的释放，超声波可以产生声空化，促进溶剂穿透植物基质细胞壁，促进分子间运动，使目标化合物尽可能地释放到萃取溶剂中。
效果例2
抗氧化活性测定
DPPH自由基常被用来测定抗氧化剂的自由基清除能力，而PSC检测常被用来评价过氧自由基清除能力。本研究采用DPPH和PSC对不同提取方法的提取物进行抗氧化活性评价。50μL的甜菜根提取物加入0.8ml的DPPH(200mg/ml，用无水乙醇溶解)的试管中，加入0.15mL的去离子水。混合后，样品在黑暗中放置25min，用紫外/可见分光光度计测定吸光度,同提取方法得到的提取物对DPPH自由基的清除活性按公式(2)计算:
其中A0为对照吸光度减去空白吸光度，A1为样品溶液吸光度减去空白吸光度。
用磷酸盐缓冲盐水(PBS,75mM,pH7.4)稀释甜菜根提取物。将100μL稀释后的甜菜根提取物和已知浓度的VC溶液加入96孔板，PBS溶液为空白组。160μL DCFH(2.48mM)加入1.34mL氢氧化钾溶液(1.0mM)中混合5min，然后在加入10.5mL PBS稀释DCFH溶液。96孔板中分别加入稀释后的DCFH溶液100μL，然后加入50μL的ABAP溶液(200mM)。采用酶标仪在485nm和535nm的激发波长下，每隔5min测量溶液的荧光强度，持续60min。PSC表示为每10mg样品中μmol VC当量(μmol VCE/10mg)。结果如表2所示。
表2通过3种不同方法得到甜菜根提取物的DPPH值和PSC值
用DPPH的方法来检测，固定化酶辅助超声法得到的甜菜根提取物对DPPH自由基的清除活性最高，且显著高于其他方式(p<0.05)。传统方法提取的甜菜色提取物清除DPPH自由基的活性最低，超声法略高于传统法。PSC的结果与DPPH相似，固定化酶辅助超声法提取的PSC值明显高于其他方法(p<0.05)。
固定化酶辅助超声法得到的甜菜根提取物的抗氧化活性明显高于其他方法得到的甜菜根提取物，这是由于固定化酶辅助超声法中甜菜色素的含量最高，且甜菜红素具有较强的抗氧化活性，证明了通过固定化酶辅助超声法提取得到的甜菜色素含量较高。
效果例3
热稳定性测定
对不同提取方法(实施例1代表超声-酶法、实施例8代表超声法和实施例10代表传统法)得到的甜菜色素进行热稳定性测定，甜菜根提取物溶液在70℃水浴条件下处理4h，测定其热稳定性。热降解率按公式(3)计算:
A0是0h的吸光度Ai是第ih的吸光度。
测定结果参见附图2，图2a为甜菜红素的热降解率，通过4种提取方法的得到的甜菜红素在热处理4小时后的降解率约为55％，没有显著差异。图2b图为甜菜黄素的热降解率，甜菜红素的热稳定性明显低于甜菜黄素(p<0.05)。
由上述结果看出本发明所得的产品中甜菜色素含量高，抗氧化活性高于传统提取方法和超声法得到的甜菜色素，与其他方法所得产品相比有着更为良好的生物活性和相似的热稳定性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将甜菜根与固定化酶加入pH4～6的缓冲溶液中，在40～55℃恒温水浴下酶解70～180min；
其中，所述固定化酶含有果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶；
(2)酶解完毕之后，去除固定化酶，再置于超声波水浴中提取，得甜菜色素。
2.根据权利要求1所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，步骤(1)所述甜菜根与所述固定化酶的质量比为100:0.3～1.5。
3.根据权利要求1或2所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，所述甜菜根与固定化酶的质量比为100:0.9，所述缓冲液pH值为5.0，所述酶解温度为50℃，酶解的时间为150min。
4.根据权利要求1所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，步骤(1)所述固定化酶的制备方法为：
1)以3-氨基丙基三乙氧基硅烷作为表面改性剂对磁性氧化三铁纳米粒子进行氨基功能化，得氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子；
2)以戊二醛作为交联剂，把所述果胶酶、半纤维素酶和纤维素酶固定在氨基功能化的四氧化三铁纳米粒子上，得固定化酶；
其中，所述固定化酶中果胶酶、半纤维素酶与纤维素酶的质量比为1:1:1。
5.根据权利要求1所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，所述pH5.0的缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠的混合液。
6.根据权利要求1所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，步骤(2)所述将固定化酶去除的方法为磁铁吸除。
7.根据权利要求1所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，步骤(2)所述超声波水浴提取的参数为超声功率100-480W，超声频率40KHz，超声时间20-50min。
8.根据权利要求1或7所述的一种从甜菜根中提取甜菜色素的方法，其特征在于，步骤(2)所述超声波水浴提取的参数为超声功率480W，超声频率40KHz，超声时间30min。
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