CN114831026B - 利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，涉及一种利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法，取沉香带腋芽的茎段诱导分化不定芽，增殖培养后进行无菌微扦插生根，经炼苗后移栽到栽培基质上，淋足定根水，经水肥管理、病虫害防治措施，得到沉香组培种苗。本发明有机地将组织培养技术与扦插繁殖技术结合在一起，高效地促进沉香组培苗不定芽生根率，简化了沉香育苗流程，通过优化生根剂、基质配方，实现了沉香组培苗生根及假植一步到位，提高扦插生根率及移栽成活率，缩短了组培苗成苗时间，保持了母株优良性状的稳定遗传，方法易行，操作简单，投入成本低，成苗速度快，为沉香资源的有效利用奠定基础。

Description

利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及一种沉香种苗繁殖方法，具体的说，涉及一种将组织培养技术与扦插繁殖技术相结合的高效繁殖沉香组培种苗方法。
背景技术
沉香为瑞香科沉香属植物白木香(Aquilaria sinensis(Lour.)Spreng.)，属国家二级保护植物，也是国际保护的树材，也是世界名贵香料和道地药材，具有很高的经济价值、文化价值、收藏价值等。由于森林资源、生态环境遭受自然灾害、人为破坏和掠夺式砍伐等原因，野生沉香树资源量在不断减少，目前野生的沉香树资源已处在珍稀濒危状态，其数量已经不能满足市场的需求。近年来，东南亚国家沉香树适宜种植区均在扩大人工种植规模，但多数栽培的是种子苗，具有遗传变异、结香性状不稳定等缺点，存在产香少，甚至不产香的风险。而人工种植沉香的目标是获得质优和量多的沉香，因此，为了更好的保护和利用沉香资源，有必要建立一种既高效，又能保持遗传稳定性的种苗繁育的方法，更好的保证沉香优良品种的推广应用。
近几年来，扦插繁殖和组培繁殖已成为沉香种苗繁殖的研究重点。传统的扦插繁殖能保持原品种的优良特性，成苗快，繁殖容易,但容易导致病虫害的传播蔓延，耗费植物材料较多，获得生根的时间长，繁殖效率较低。植物组织培养经过外植体消毒、丛生芽诱导、生根培养、假植炼苗、移栽等过程，具有原材料需求量少、不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点，在植物种苗繁育上广泛应用，但还是存在育苗周期长、生根率低、过程环节多把控不易等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法，以沉香带芽嫩茎为外植体，经过外植体消毒、不定芽诱导、丛生芽诱导及扦插生根等过程，有机地将组织培养技术与扦插繁殖技术结合在一起，通过优化生根剂、基质配方，提高组培不定芽的生根率、移栽成活率以及成苗速度，实现了沉香组培苗生根与假植一步到位，缩短了组培苗成苗时间，在保持母株优良性状稳定遗传的同时提高繁殖效率。
本发明所采用的技术方案是：
一种利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法，包括不定芽诱导、丛生芽诱导及扦插生根等过程，其步骤如下：
1、不定芽诱导过程
取沉香幼嫩枝条消毒后切成带腋芽的茎段为外植体，接种于诱导培养基上诱导分化不定芽。所述诱导培养基为WT+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.8。
所述沉香幼嫩枝条的消毒过程：在超净工作台上用0.1％升汞消毒6～10min，用无菌水冲洗4～5次，用吸水纸吸干表面水分。
2、丛生芽诱导过程
将诱导得到的不定芽转接到增殖培养基上，增殖培养形成丛生芽。所述增殖培养基为WT+6-BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。
3、无菌微扦插生根过程
A.无菌微扦插基质的制备：将河沙、草炭和椰糠按体积比1：1～3：1的比例混合均匀得到无菌微扦插基质，装入穴盘中，用水浸透基质，放入高压锅经高温高压灭菌后，备用。
B.无菌生根剂的配制：取2，4-D 2～4mg、IBA 500～1000mg，加水1kg配成无菌生根剂，高温高压灭菌后室温放置，备用。
C.不定芽无菌微扦插：在无菌条件下，将增殖培养获得的丛生芽，切取2～3cm高度的单株不定芽放入已灭菌的容器内保湿备用。用镊子夹住，将不定芽基部蘸入无菌生根剂后扦插到无菌微扦插基质中，扦插后用无菌水浇淋，促使芽基部与基质紧密接触，然后将穴盘放置于经紫外消毒的穴盘盒内，盖上薄膜密封保湿，放置于培养室内进行光照培养。
4、移栽管理
A.移栽：将生好根的穴盘苗连穴盘一起放置在控温大棚中炼苗，2～3d后将苗连带无菌微扦插基质一起移出穴盘，移栽到栽培基质上，淋足定根水。所述栽培基质是由泥土、椰糠和河沙混匀而成，其中按体积比计：泥土：椰糠：河沙＝1:2:1。
B.管理：移栽后7～10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％。
C.施肥：待移栽的幼苗发新叶后，晴天上午采用0.1％～0.2％尿素溶液进行叶面喷施，每7～15d施肥1次；
D.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明以沉香带芽嫩茎为外植体，采用组培繁殖技术分化不定芽，再采用扦插繁殖技术促进沉香组培苗不定芽生根，有机地将组织培养技术与扦插繁殖技术结合在一起，实现了沉香组培苗生根及假植一步到位，缩短组培苗成苗时间，具有方法易行，操作简单，投入成本低，成苗速度快，效率高等优点，为沉香资源的有效利用奠定基础。
2、利用沉香外植体经过不定芽分化、增殖，能有效减少沉香材料的耗费，提高产苗量，降低生产成本，为沉香的产业化发展和优良品种的推广应用提供技术支撑。
3、通过优化生根剂、基质配方，大大提高了生根率、移栽成活率，提高了成苗速度，在保持母株优良性状稳定遗传的同时提高繁殖效率。
附图说明
图1是沉香带芽茎段诱导分化不定芽效果图。
图2是沉香增殖形成丛生芽效果图。
图3是沉香不定芽扦插效果图。
图4是沉香不定芽扦插生根效果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
不定芽诱导及增殖培养的培养条件：培养温度为24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m-2·s-1。
一、微扦插繁育沉香组培苗
实施例一
1、不定芽诱导过程
取沉香幼嫩枝条，在超净工作台上用0.1％升汞消毒7min，用无菌水冲洗5次，用吸水纸吸干表面水分，然后切成带腋芽的茎段为外植体，接种于诱导培养基(WT+6-BA0.8mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽。培养7d左右，带芽茎段开始分化不定芽(图1)，培养30d后进行增殖培养。
2、丛生芽诱导过程
将诱导得到的不定芽转接到增殖培养基(WT+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，增殖培养形成丛生芽(图2)。
3、无菌微扦插生根过程
A.无菌微扦插基质的制备：将河沙、草炭和椰糠按体积比1：2：1的比例混合均匀得到无菌微扦插基质，装入穴盘中，用水浸透基质，放入高压锅经高温高压灭菌后，备用。
B.无菌生根剂的配制：取2，4-D 4mg、IBA 600mg，加水1kg配成无菌生根剂，高温高压灭菌后室温放置，备用。
C.不定芽无菌微扦插：在超净工作台上，将增殖培养获得的丛生芽，切取2～3cm高度的单株不定芽放入已灭菌的容器内保湿备用。用镊子夹住，将不定芽基部蘸入无菌生根剂5s后扦插到无菌微扦插基质中，扦插后用无菌水浇淋，促使芽基部与基质紧密接触，然后将穴盘放置于经紫外消毒的穴盘盒内(图3)，盖上薄膜密封保湿，放置于培养室内进行光照培养。培养温度26～28℃，光照时间10h/d。20d后，从穴盘底部可看到扦插的不定芽长出根来(图4)。
4、移栽管理
A.移栽：将生好根的穴盘苗(小苗)连穴盘一起放置在控温大棚中炼苗，3d后将小苗连带无菌微扦插基质一起移出穴盘，移栽到装载有栽培基质(体积比，泥土：椰糠：河沙＝1:2:1)的育苗杯上，淋足定根水。
B.管理：移栽后10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％。
C.施肥：待移栽的幼苗发新叶后，晴天上午采用0.2％尿素溶液进行叶面喷施，每8d施肥1次；
D.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
实施例二
1、不定芽诱导过程
取沉香幼嫩枝条，在超净工作台上用0.1％升汞消毒10min，用无菌水冲洗4次，用吸水纸吸干表面水分，然后切成带腋芽的茎段为外植体，接种于诱导培养基(WT+6-BA1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽。培养7d左右，带芽茎段开始分化不定芽，培养30d后进行增殖培养。
2、丛生芽诱导过程
将诱导得到的不定芽转接到增殖培养基(WT+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，增殖培养形成丛生芽。
3、无菌微扦插生根过程
A.无菌微扦插基质的制备：将河沙、草炭和椰糠按体积比1：3：1的比例混合均匀得到无菌微扦插基质，装入穴盘中，用水浸透基质，放入高压锅经高温高压灭菌后，备用。
B.无菌生根剂的配制：取2，4-D 2mg、IBA 1000mg，加水1kg配成无菌生根剂，高温高压灭菌后室温放置，备用。
C.不定芽无菌微扦插：在超净工作台上，将增殖培养获得的丛生芽，切取2～3cm高度的单株不定芽放入已灭菌的容器内保湿备用。用镊子夹住，将不定芽基部蘸入无菌生根剂4s后扦插到无菌微扦插基质中，扦插后用无菌水浇淋，促使芽基部与基质紧密接触，然后将穴盘放置于经紫外消毒的穴盘盒内，盖上薄膜密封保湿，放置于培养室内进行光照培养。培养温度26～28℃，光照时间10h/d。20d后，从穴盘底部可看到扦插的不定芽长出根来。
4、移栽管理
A.移栽：将生好根的穴盘苗(小苗)连穴盘一起放置在控温大棚中炼苗，2d后将小苗连带无菌微扦插基质一起移出穴盘，移栽到装载有栽培基质(体积比，泥土：椰糠：河沙＝1:2:1)的育苗杯上，淋足定根水。
B.管理：移栽后8d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％。
C.施肥：待移栽的幼苗发新叶后，晴天上午采用0.2％尿素溶液进行叶面喷施，每13d施肥1次；
D.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
实施例三
1、不定芽诱导过程
取沉香幼嫩枝条，在超净工作台上用0.1％升汞消毒8min，用无菌水冲洗5次，用吸水纸吸干表面水分，然后切成带腋芽的茎段为外植体，接种于诱导培养基(WT+6-BA1.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽。培养7d左右，带芽茎段开始分化不定芽，培养30d后进行增殖培养。
2、丛生芽诱导过程
将诱导得到的不定芽转接到增殖培养基(WT+6-BA 2.6mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上，增殖培养形成丛生芽。
3、无菌微扦插生根过程
A.无菌微扦插基质的制备：将河沙、草炭和椰糠按体积比1：1：1的比例混合均匀得到无菌微扦插基质，装入穴盘中，用水浸透基质，放入高压锅经高温高压灭菌后，备用。
B.无菌生根剂的配制：取2，4-D 3mg、IBA 800mg，加水1kg配成无菌生根剂，高温高压灭菌后室温放置，备用。
C.不定芽无菌微扦插：在超净工作台上，将增殖培养获得的丛生芽，切取2～3cm高度的单株不定芽放入已灭菌的容器内保湿备用。用镊子夹住，将不定芽基部蘸入无菌生根剂5s后扦插到无菌微扦插基质中，扦插后用无菌水浇淋，促使芽基部与基质紧密接触，然后将穴盘放置于经紫外消毒的穴盘盒内，盖上薄膜密封保湿，放置于培养室内进行光照培养。培养温度26～28℃，光照时间10h/d。20d后，从穴盘底部可看到扦插的不定芽长出根来。
4、移栽管理
A.移栽：将生好根的穴盘苗(小苗)连穴盘一起放置在控温大棚中炼苗，3d后将小苗连带无菌微扦插基质一起移出穴盘，移栽到装载有栽培基质(体积比，泥土：椰糠：河沙＝1:2:1)的育苗杯上，淋足定根水。
B.管理：移栽后7d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％。
C.施肥：待移栽的幼苗发新叶后，晴天上午采用0.1％尿素溶液进行叶面喷施，每10d施肥1次；
D.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
二、结合组培技术和微扦插技术的沉香种苗繁育效果鉴定
1.沉香不定芽诱导鉴定
为鉴定沉香幼嫩带腋芽茎段的诱导效果，对上述实施例的不定芽诱导情况进行观察，统计不定芽诱导数，计算诱导率，结果见表1。
表1沉香茎段诱导情况
项目 接种数 诱导出不定芽的外植体数 诱导率
实施例一 80 69 86.2％
实施例二 80 59 73.7％
实施例三 80 62 77.5％
上述沉香茎段的不定芽诱导效果表明，本发明以WT培养基进行不定芽诱导，7d左右开始分化不定芽，诱导率最高达86％以上，具有非常好的分化效果。
2.沉香不定芽增殖效果鉴定
为鉴定沉香不定芽的增殖效果，对上述实施例的不定芽的增殖情况进行观察，统计增殖数，计算增殖系数，结果见表2。
表2不定芽的增殖情况
项目 不定芽数 增殖数 增殖系数
实施例一 50 203 4.06
实施例二 50 214 4.3
实施例三 50 194 3.9
上述不定芽增殖效果表明，本发明以WT为基础培养基，对培养30d后的不定芽进行增殖，增殖系数达到4.0左右，增殖效果明显。
3.不定芽微扦插生根效果鉴定
为鉴定不定芽的生根效果，对上述实施例的不定芽生根情况进行观察，统计生根数，计算生根率，结果见表3。
表3不定芽的生根情况
项目 不定芽数 生根数 生根率
实施例一 150 136 90.7％
实施例二 150 145 96.7％
实施例三 150 141 94.0％
上述微扦插不定芽生根效果表明，本发明以河沙、草炭和椰糠的混合物为无菌微扦插基质，以2，4-D和IBA的混合溶液为生根剂，对不定芽进行诱导生根，微扦插30d后统计生根数，生根率最高达96％。
4.穴盘苗移栽效果鉴定
为鉴定生根后穴盘苗的移栽成活效果，对上述实施例的穴盘苗移栽生长情况进行观察，移栽40天后统计成活数，计算成活率，结果见表4。
表4穴盘苗的移栽生长情况
项目 生根苗数 成活数 成活率
实施例一 100 96 96％
实施例二 100 93 93％
实施例三 100 94 94％
上述移栽效果表明，本发明以诱导出良好根系的穴盘苗进行移栽(育苗杯)，以泥土、椰糠和河沙的混合物为栽培基质，具有较高的穴盘苗移栽成活率，最高达到96％以上，可以满足批量种苗繁殖，为沉香种苗繁育和产业化生产奠定基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法，其特征在于，其步骤如下：
1)不定芽诱导过程
取沉香幼嫩枝条消毒后切成带腋芽的茎段为外植体，接种于诱导培养基上诱导分化不定芽；所述诱导培养基为WT+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+活性炭0.5g/L，pH值为5.8；
2)丛生芽诱导过程
将诱导得到的不定芽转接到增殖培养基上，增殖培养形成丛生芽；所述增殖培养基为WT+6-BA 2.0～3.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；
3)无菌微扦插生根过程
A.无菌微扦插基质的制备：将河沙、草炭和椰糠按体积比1：1～3：1的比例混合均匀得到无菌微扦插基质，装入穴盘中，用水浸透基质，放入高压锅经高温高压灭菌后，备用；
B.无菌生根剂的配制：取2，4-D 2～4mg、IBA 500～1000mg，加水1kg配成无菌生根剂，高温高压灭菌后室温放置，备用；
C.不定芽无菌微扦插：在无菌条件下，将增殖培养获得的丛生芽，切取2～3cm高度的单株不定芽放入已灭菌的容器内保湿备用；用镊子夹住，将不定芽基部蘸入无菌生根剂后扦插到无菌微扦插基质中，扦插后用无菌水浇淋，促使芽基部与基质紧密接触，然后将穴盘放置于经紫外消毒的穴盘盒内，盖上薄膜密封保湿，放置于培养室内进行光照培养；
4)移栽管理
A.移栽：将生好根的穴盘苗连穴盘一起放置在控温大棚中炼苗，2～3d后将苗连带无菌微扦插基质一起移出穴盘，移栽到栽培基质上，淋足定根水；所述栽培基质是由泥土、椰糠和河沙混匀而成，其中按体积比计：泥土：椰糠：河沙＝1:2:1；
B.管理：移栽后7～10d，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；
C.施肥：待移栽的幼苗发新叶后，晴天上午采用0.1％～0.2％尿素溶液进行叶面喷施，每7～15d施肥1次；
D.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。
2.根据权利要求1所述的利用无菌微扦插生根的高效繁殖沉香组培种苗的方法，其特征在于：所述沉香幼嫩枝条的消毒过程：在超净工作台上用0.1％升汞消毒6～10min，用无菌水冲洗4～5次，用吸水纸吸干表面水分。
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