CN114813983A - 一种含红参复方中成药的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含红参复方中成药的检测方法，其包括下述步骤：供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；设置超高压液相色谱条件：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；色谱柱的柱温为28‑35℃；理论板数按人参皂苷Rb1的峰计算不低于40000；吸取供试品溶液和对照品溶液注入超高压液相色谱仪，测定，记录色谱图。本发明提供的检测方法操作简单、能有效减少其他组分对待测定成分的干扰，灵敏度高。含量检测稳定、准确、重现性好、检测效率高，可有效地检测分析和控制含红参复方中成药(尤其是参麦颗粒)的生产工艺过程中药物的质量。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种含红参复方中成药的检测方法。
背景技术
参麦颗粒，主要组方包括红参、南沙参、麦冬、黄精、山药、枸杞子，主要功效为养阴生津，临床上常用于面黄肌瘦、津少口渴、腰膝酸软、食欲不振、头晕眼花、心悸气短等神经衰弱的症状。为了生产出安全、有效和稳定的药物，在生产制备的整个过程中都有必要对其质量进行控制，以确保有效成分含量稳定均一。目前对参麦颗粒的质量控制方法为性状鉴别和基本的理化鉴别，例如简单的显色反应。由于其方法过于简单，缺乏有效的基于物质基础的质量控制手段，不利于生产过程中的质量控制。
高效液相色谱(HPLC)具有灵敏度高、准确度高等优点，己成为控制中药质量的重要手段之一，其基本模式为等度和梯度洗脱，将这两种模式组合应用，可以达到较好的分离效果。但是由于参麦颗粒产品辅料含量太高(大于90wt％)，对样本提取和含量检测有较大的干扰，成分难以富集，且在参麦颗粒中红参用量小，其他5味药的紫外吸收弱，吸收信号相应较小，有效成分难以监测，可列为指标物的有效成分更加难以测定。现有文献披露的实验方案均无法满足参麦颗粒中有效成分的含量检测。
因此，本领域技术人员亟需研发一种简单快速、准确可靠、能保证药物有效性和工艺过程质量控制可控性的检测方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中参麦颗粒中有效成分的含量检测干扰大、灵敏度差、定量不准确、生产过程中的质量控制手段不够可靠的缺陷，从而提供一种含红参复方中成药的检测方法。本发明的含红参复方中成药的检测方法简单快速、灵敏度高、准确可靠，能保证含红参复方中成药的有效性和工艺过程中质量控制可控性。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种含红参复方中成药的检测方法，其包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：配制浓度为1g/mL的含红参复方中成药的水溶液，用水饱和正丁醇提取，去除溶剂，残渣加50％甲醇溶解，转移至容量瓶中，继续加50％甲醇至刻度，摇匀即得；
(2)对照品溶液的制备：将人参皂苷Rb1对照品溶解在50％甲醇中，即得；所述对照品溶液的浓度为0.1mg/mL；
(3)设置超高压液相色谱条件：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；色谱柱的柱温为28-35℃；理论板数按人参皂苷Rb1的峰计算不低于40000；
(4)吸取所述供试品溶液和所述对照品溶液注入超高压液相色谱仪，测定，记录色谱图；
其中，步骤(1)、(2)和(3)顺序不分先后。
步骤(1)中，所述提取的方法可为本领域常规，较佳地为振摇提取。
所述提取的次数可为1-3次，较佳地为2次。
所述去除溶剂的方法可为本领域常规，较佳地为水浴蒸干。
所述容量瓶的容积较佳地为5mL。
步骤(1)中，所述供试品溶液中人参皂苷Rb1的浓度较佳地为0.01742-0.1742mg/mL。本发明的检测方法在该浓度范围内可准确检测。
步骤(3)中，所述梯度洗脱的洗脱程序可为：0～3min，流动相A为19％，流动相B为81％；3～5min，流动相A为19％-29％，流动相B为81％-71％；5～7min，流动相A为29％，流动相B为71％；7～10min，流动相A为29％-40％，流动相B为71％-60％；10～11min，流动相A为40％-19％，流动相B为60％-81％；11～13min，流动相A为19％，流动相B为81％。
所述梯度洗脱的流速可为本领域常规，较佳地为0.48-0.52mL/min，更佳地为0.5mL/min。
所述色谱柱的填充剂可为十八烷基硅烷键合硅胶。
所述填充剂的粒径可为1.7μm。
所述色谱柱可为：Waters ACQUITY
BEH C18 2.1×50mm。
所述色谱柱的柱温可为30℃。
步骤(4)中，所述供试品溶液和所述对照品溶液的进样量可为本领域常规，较佳地为1-5μL，更佳地为2μL。
所述超高压液相色谱仪的检测器可为紫外检测器。
所述紫外检测器的检测波长可为201-205nm，较佳地为203nm。
所述色谱图的记录时间可为13min。
本发明中，所述含红参复方中成药的药材成分较佳地包括红参、南沙参、麦冬、黄精、山药和枸杞子。
本发明中，所述含红参复方中成药中红参的含量较佳地为不低于0.2％。
本发明中，所述含红参复方中成药较佳地为经水提醇沉且含人参皂苷Rb1的复方中成药。也就是说，所述含红参复方中成药的制备过程较佳地包括水提醇沉的步骤。
本发明中，所述含红参复方中成药中辅料的含量可为90wt％以上。
所述辅料可为复方中成药的常规辅料，较佳地包括蔗糖、乳糖、淀粉和糊精中的一种或多种。
所述含红参复方中成药较佳地为参麦颗粒。
所述参麦颗粒为一种复方中成药，性状为淡黄棕色的颗粒，味甜、微酸；具有养阴生津的功效，用于面黄肌瘦，津少口渴，腰膝酸软，食欲不振，头晕眼花，心悸气短，神经衰弱等症状。所述参麦颗粒包括红参、南沙参、麦冬、黄精、山药和枸杞子六味药材经水提醇沉而得的提取物，以及辅料蔗糖。
所述参麦颗粒的制备方法可包括下述步骤：将红参切薄片，加入乙醇加热回流提取，过滤后回收滤液，即红参提取液；将红参药渣和南沙参、麦冬、黄精、山药和枸杞子加水煎煮两次，每次2小时，合并煎液，过滤后的滤液浓缩至适量，加等量乙醇，搅拌均匀，静置，过滤后回收滤液，浓缩得相对密度约为1.35kg/m3(80-85℃)的清膏；将上述红参提取液、清膏和920g蔗糖，混合，制成颗粒，干燥，即得约1000g的参麦颗粒。
本发明中，所述人参皂苷Rb1对照品可为本领域常规，一般购自中国食品药品检定研究所。
本发明中，所述50％甲醇是指50％的甲醇-水溶液，此处的百分数为体积百分数。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.本发明提供的含红参复方中成药的检测方法操作简单、能有效减少其他组分对待测定成分的干扰，灵敏度高；
2.本发明提供的含量检测方法稳定、准确、重现性好、检测效率高，可有效地检测分析和控制含红参复方中成药(尤其是参麦颗粒)的生产工艺过程中药物的质量。
附图说明
图1为本发明实施例1的条件下参麦颗粒成品中人参皂苷Rb1的色谱图；
图2为本发明实施例1的条件下对照品人参皂苷Rb1色谱图；
图3为本发明实施例1的条件下阴性对照品中人参皂苷Rb1的色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中：
所用参麦颗粒购自武汉康乐药业股份有限公司。
人参皂苷Rb1对照品购自中国食品药品检定研究所。
色谱柱品牌为Waters，规格为ACQUITY
BEH C18 2.1×50mm，1.7μm。UPLC品牌为Waters。
正丁醇、甲醇均为分析纯试剂，乙腈为SICIMA-ALORICH品牌色谱纯试剂。
水为纯净水，使用超纯水机(synery，MERCK MILLIPORE)制备。
实施例1
供试品溶液的制备：取装量差异项下的参麦颗粒约50g，精密称定其质量后，加水50mL使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干正丁醇，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，继续加50％甲醇至刻度，摇匀即得。
对照品溶液的制备：取人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定其质量后，加50％甲醇制成浓度为0.1mg/mL的溶液，即得。
实验条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(1.7μm,2.1×50mm)，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测波长203nm。流动相比例见下表1。
表1实施例1的流动相比例
| 时间，min | 流动相A，％ | 流动相B，％ |
| 0-3 | 19 | 81 |
| 3-5 | 19-29 | 81-71 |
| 5-7 | 29 | 71 |
| 7-10 | 29-40 | 71-60 |
| 10-11 | 40-19 | 60-81 |
| 11-13 | 19 | 81 |
精密吸取供试品溶液和对照品溶液各2μL，注入色谱仪，记录色谱图。此条件下，供试品溶液中人参皂苷Rb1与其它组分基本达到基线分离，理论板数按人参皂苷Rb1的峰计算不低于40000，色谱图记录时间为13min，供试品溶液中人参皂苷Rb1的保留时间为7.997min，对照品溶液中人参皂苷Rb1的保留时间为8.002min，分离度为1.44。
对比例1
供试品溶液和对照品溶液的制备方法同实施例1，检测方法使用常规的方法，色谱柱型为YMC C18 4.6mm×250mm×5μm，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长为203nm，分析时长为60min，流动相比例见下表2。
对比例1分离度小于2.0，且分析时间长。
表2对比例1的流动相比例
| 时间，min | 流动相A，％ | 流动相B，％ |
| 0 | 29 | 71 |
| 20 | 29 | 71 |
| 41 | 36 | 64 |
| 45 | 36 | 64 |
| 50 | 51 | 49 |
| 55 | 29 | 71 |
| 60 | 29 | 71 |
方法学验证结果
1.线性关系考察
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。
线性溶液：精密吸取对照品储备液1mL，2.5mL，4mL，5mL，6mL，7.5mL分别置于10mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为0.02mg/mL，0.05mg/mL，0.08mg/mL，0.1mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL的溶液。
精密吸取空白溶液、对照品溶液和线性溶液和对照品储备液各2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
可接受标准：标准曲线的线性方程为y＝kx+b，相关系数R2不小于0.9990，每个浓度水平的溶液重复进样3次，测得峰面积的RSD％不大于2.0％。
线性测定结果：线性回归方程为y＝1082157.3959x+21.8864，R2＝0.9998，人参皂苷Rb1的浓度在0.01742-0.1742mg/mL的范围内线性符合可接受标准。
2.专属性
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
阴性对照样品溶液：参麦颗粒处方中去除红参，按供试品溶液的制备方法同法制成。
精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和阴性对照样品溶液各2μL,注入液相色谱仪，记录色谱图。
专属性测试结果：如图1-3所示，供试品溶液色谱图对应位置有峰，而阴性对照样品色谱图对应位置无峰，专属性良好。
3.重复性
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。平行配制2份。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。
精密吸取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
表3重复性测试结果
表3中“含量ug/g”是指人参皂苷Rb1(ug)在参麦颗粒(g)中的含量，同表4中的“含量ug/g”的含义。
RSD的计算公式为：
RSD＝标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)*100％，也可根据Excel表格计算公式RSD＝STDEV()/AVERAGE()*100计算得到。根据计算公式计算的结果，依据有效数字修约规则，RSD采用“只进不舍”的修约规则保留有效数字。
重复性的测试标准为RSD％不大于6.0％。如表3所示，6份供试品溶液的测定含量RSD％为3.5％，符合标准，重复性良好。
4.中间精密度
在同一仪器同批样本的情况下，改变实验人员和实验时间进行中间精密度的测试。
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。平行配制2份。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。平行配制6份。
精密吸取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
表4中间精密度测试结果
中间精密度的测试标准为RSD％不大于6.0％。如表4所示，6份供试品溶液的测定含量RSD％为2.8％，符合标准，中间精密度良好。
5.准确度
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。平行配制2份。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。平行配制2份。
50％准确度溶液：取参麦颗粒约25g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，精密加入对照品溶液1.3mL与供试品溶液同法处理，即得。平行配制3份。
100％准确度溶液：取参麦颗粒约25g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，精密加入对照品溶液2.5mL与供试品溶液同法处理，即得。平行配制3份。
150％准确度溶液：取参麦颗粒约25g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，精密加入对照品溶液3.7mL与供试品溶液同法处理，即得。平行配制3份。
精密吸取上述溶液各2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
表5准确度测试结果
回收率的计算公式为：
回收率(％)＝(实测量-样品含有量)/加入量*100％。
准确度的测试标准为RSD％不大于6.0％。如表5所示，回收率为89.22-99.73％，在80-115％范围内，回收率RSD％为3.3％，符合标准，准确度良好。
6.溶液稳定性
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。平行配制2份。
精密吸取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
表6溶液稳定性测试结果
稳定性标准为人参皂苷Rb1峰的峰面积在适宜的时间内RSD％不大于6.0％，如表6所示，对照品溶液室温放置23h稳定，样品溶液室温放置14h稳定。
7.耐用性
空白溶液：50％甲醇。
对照品溶液：取人参皂苷Rb1对照品约20mg，精密称定其质量，置于100mL容量瓶，加50％甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.2mg/mL的对照品储备液(冷藏放置，临用前放置至室温)。精密吸取25mL对照品储备液至50mL容量瓶，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(冷藏放置，临用前放置至室温)。平行配制2份。
供试品溶液：取参麦颗粒约50g，精密称定其质量，加50mL水使其溶解，依次用50mL、25mL水饱和正丁醇振摇提取2次，水浴蒸干上述正丁醇液，残渣加50％甲醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。平行配制2份。
1.将色谱条件中流速设为0.5mL/min，柱温分别设为30℃、25℃、28℃和35℃，分别精密吸取上述溶液2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
2.将色谱条件中的柱温设为30℃，流速分别设为0.5mL/min、0.4mL/min、0.48mL/min、0.52mL/min和0.6mL/min，分别精密吸取上述溶液2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
3.更换同型号的不同色谱柱，将色谱条件中的柱温设为30℃，流速设为0.5mL/min，分别精密吸取上述溶液2μL，注入液相色谱仪测定，即得。
表7耐用性测试结果
耐用性标准为改变色谱条件和更换色谱柱后人参皂苷Rb1峰的峰面积相对平均偏差(％)不大于6.0％，如表7所示，流速在0.48-0.52mL/min，柱温在28-35℃范围内，耐用性符合标准。
Claims (10)
1.一种含红参复方中成药的检测方法，其包括下述步骤：
(1)供试品溶液的制备：配制浓度为1g/mL的含红参复方中成药的水溶液，用水饱和正丁醇提取，去除溶剂，残渣加50％甲醇溶解，转移至容量瓶中，继续加50％甲醇至刻度，摇匀即得；
(2)对照品溶液的制备：将人参皂苷Rb1对照品溶解在50％甲醇中，即得；所述对照品溶液的浓度为0.1mg/mL；
(3)设置超高压液相色谱条件：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱；色谱柱的柱温为28-35℃；理论板数按人参皂苷Rb1的峰计算不低于40000；
(4)吸取所述供试品溶液和所述对照品溶液注入超高压液相色谱仪，测定，记录色谱图；
其中，步骤(1)、(2)和(3)顺序不分先后。
2.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述提取的方法为振摇提取；
和/或，所述提取的次数为1-3次，较佳地为2次；
和/或，所述去除溶剂的方法为水浴蒸干。
3.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述容量瓶的容积为5mL。
4.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0～3min，流动相A为19％，流动相B为81％；3～5min，流动相A为19％-29％，流动相B为81％-71％；5～7min，流动相A为29％，流动相B为71％；7～10min，流动相A为29％-40％，流动相B为71％-60％；10～11min，流动相A为40％-19％，流动相B为60％-81％；11～13min，流动相A为19％，流动相B为81％。
5.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述梯度洗脱的流速为0.48-0.52mL/min，较佳地为0.5mL/min；
和/或，所述色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
和/或，所述色谱柱的填充剂的粒径为1.7μm；
较佳地，所述色谱柱为Waters ACQUITY
BEH C18 2.1×50mm；
和/或，所述色谱柱的柱温为30℃。
6.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述供试品溶液和所述对照品溶液的进样量为1-5μL，较佳地为2μL；
和/或，所述超高压液相色谱仪的检测器为紫外检测器；所述紫外检测器的检测波长较佳地为201-205nm，更佳地为203nm；
和/或，所述色谱图的记录时间为13min。
7.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，所述含红参复方中成药的药材成分包括红参、南沙参、麦冬、黄精、山药和枸杞子；
和/或，所述含红参复方中成药中红参的含量不低于0.2％。
8.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，所述含红参复方中成药为经水提醇沉且含人参皂苷Rb1的复方中成药。
9.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，所述含红参复方中成药为参麦颗粒。
10.如权利要求1所述的含红参复方中成药的检测方法，其特征在于，所述含红参复方中成药中辅料的含量为90wt％以上；
和/或，所述含红参复方中成药的辅料包括蔗糖、乳糖、淀粉和糊精中的一种或多种。
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