CN114807412A - 一种番石榴issr-pcr分子标记组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种番石榴ISSR‑PCR分子标记组合及其应用，其主要基于SEQIDNO：1～10组成的ISSR引物组实现鉴别番石榴遗传多样性分析的功能。且本发明中的引物组相对于传统方法，其能够在更大的样本量的情况下实现高精准度的测定工作，可识别的多态性高达89.68％。而且基于该方法，其条带分辨率更高，扩增片段更清晰，反应更加稳定，多态性识别度更高，可在短时间内完成大批量实验材料鉴定，能准确分辨番石榴种质资源间的亲缘关系，对番石榴种质资源的鉴定有重大意义。

Description

一种番石榴ISSR-PCR分子标记组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种番石榴ISSR-PCR分子标记组合及其应用。
背景技术
番石榴(Psidium guajava L.)是桃金娘科番石榴属乔木，又名芭乐、鸡屎果、拔子等。番石榴原产于热带美洲，现广泛分布于热带和亚热带地区，引入中国栽培已有300多年的历史。番石榴主要栽培于华南地区，在西南地区亦有分布。番石榴富含蛋白质、维他命C、A、B以及钙、磷、铁、钾等人体所需的多种微量元素。既可鲜食、煮食、酿酒，又可加工成果汁、果酱、罐头等，还具有抗菌、止泻、抗氧化、保肝、降血糖、降血脂、降血压、抗心血管疾病和抗肿瘤等药用价值。另外其种子含油率为5％～13％，富含不饱和脂肪酸，可作为保健用油。
目前，在我国多个省份、自治区都建有番石榴种质资源圃，番石榴的引种、试种和收集工作赓续进行，但现阶段中，番石榴种质资源的鉴定仍主要依据形态特征，缺乏科学系统的检测方法，从而导致种质亲缘关系难以正确判断，常有同物异名，同名异物的现象存在，为番石榴品种的鉴别工作带来了极大的挑战。
ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)是物种遗传多样性研究中的常见方法，具有不受环境影响，结合位点丰富和灵敏度准确性高等特点，在品种鉴定方面，DNA分子标记技术与传统技术相比具有更加突出的优点。
相关技术中，虽然也有采用ISSR分子标记技术鉴别番石榴的报道，但其鉴定准确度普遍无法实现大样本量下的高精度的要求。有研究人员对对36份番石榴种质资源的亲缘关系进行分析，共扩增出165条带，其中多态性条带129条，多态性百分率仅为78.18％。有研究对16份番石榴材料进行了亲缘关系分析，共扩增出44条可重复条带，其中多态性条带仅占61.4％，各种质间的相似系数在0.689～0.981之间。
因此，开发一种能够使用在更大规模样本量筛查中且能够显示出更高多态性百分率的番石榴品种鉴定方法对于提高番石榴品种鉴定的工作效率以及鉴定准确性都具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种番石榴ISSR-PCR分子标记组合及其应用。本申请发现了一组番石榴ISSR-PCR分子标记的引物组，可准确鉴定大样本量的番石榴样品，并准确的进行种质分类，从而实现番石榴品种的准确鉴定工作，降低番石榴选育难度和不确定性。
本发明的第一个方面，提供一组用于鉴别番石榴遗传多样性分析的ISSR引物组，所述引物组由SEQ ID NO：1～10组成。
其中，所述SEQ ID NO：1～10的具体核苷酸序列如下所示。
UBC807：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3’(SEQ ID NO:1)
UBC808：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGC-3’(SEQ ID NO:2)
UBC809：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’(SEQ ID NO:3)
UBC810：5’-GAGAGAGAGAGAGAGAT-3’(SEQ ID NO:4)
UBC835：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGYC-3’(SEQ ID NO:5)
UBC841：5’-GAGAGAGAGAGAGAGAYC-3’(SEQ ID NO:6)
UBC842：5’-GAGAGAGAGAGAGAGAYG-3’(SEQ ID NO:7)
UBC880：5’-GGAGAGGAGAGGAGA-3’(SEQ ID NO:8)
UBC881：5’-GGGTGGGGTGGGGTG-3’(SEQ ID NO:9)
UBC888：5’-BDBCACACACACACACA-3’(SEQ ID NO:10)
在本发明中，发明人发现上述引物组相较于现有技术中的番石榴ISSR引物组，其够在更大的样本量下实现更高精度的多态性检测，对于提高番石榴种质和品种鉴定提供了有利的技术支持。
本发明的第二个方面，提供一种用于鉴别番石榴遗传多样性分析的检测试剂，所述检测试剂中含有本发明第一个方面所述的ISSR引物组。
在本发明中，本发明中的检测试剂相较于现有技术，其能够在更大的样本量下实现更高精度的多态性检测，对于提高番石榴种质和品种鉴定提供了有利的技术支持。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的ISSR引物组在制备番石榴遗传多样性检测产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试剂、检测试剂盒、检测芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还含有PCR扩增试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增试剂包括但不限于PCR预混液、缓冲液、体系溶剂。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理添加其他用于扩增的辅助试剂，以实现定向扩增的目的。
本发明的第四个方面，提供本发明第一个方面所述的ISSR引物组在番石榴种质选育中的应用。
在本发明中，发明人基于上述ISSR引物组对番石榴样品DNA进行扩增，并根据扩增产物在凝胶成像中的条带信息分析番石榴样品的种质信息，其测得的多态性百分率达到了89.68％，远超现有技术中的测得率。且对于59份番石榴样品均实现了精准分类，具有极高的准确性，从而有效的实现了优质化番石榴种植筛选以及为后续的育种工作提供了数据支持。
本发明的第五个方面，提供一种鉴别番石榴品种遗传多样性的方法，包括如下步骤：
(1)提取番石榴样品DNA，基于SEQ ID NO：1～10中至少一条引物分别独立进行扩增，得到扩增产物；
(2)电泳分离扩增产物，并进行凝胶成像，获得条带信息；
(3)根据条带信息进行聚类分析，并建立DNA指纹图谱，从而鉴别出番石榴品种。
在本发明的一些实施方式中，所述番石榴样品DNA的提取是基于商用试剂盒获得的，当然，本领域技术人员也可以根据实际检测需求选择本领域中其他常规的DNA提取方法提取获得。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应体系为：
Figure BDA0003580045970000031
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应体系为：
Figure BDA0003580045970000032
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：94～95℃预变性2～5min；94～95℃变性25～30s，50℃退火42～45s，40～45个循环；72℃延伸9～10min。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，40个循环；72℃延伸10min。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物为SEQ ID NO:2、4～8和10的组合。
在本发明实施例中，为了节省工作量，发明人仅从上述10条引物中随机筛选7条条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于番石榴DNA指纹图谱的编写，并最终得到了对于59份番石榴有效的番石榴种质资源指纹图谱编码，实现了番石榴品种的高效分类。
在本发明的一些实施方式中，所述引物为SEQ ID NO：1～10的组合。
在本发明中，发明人基于上述ISSR-PCR反应体系能够很好的用于番石榴样品的种质鉴别，使扩增多态性达89％以上，从而得到其对应的种质关系(亲缘关系)和具体的DNA分子指纹图谱，为ISSR分子标记在番石榴分类方面的应用提供借鉴，也为番石榴样品的种质开发和选育鉴定提供有效的技术支持和理论基础。
在本发明的一些实施方式中，聚类分析的具体操作为：具体为：读取扩增条带信息，将电泳图谱上100～5000bp范围内同一位置上清晰且重复出现的条带记为“1”，同一位置上没有条带的记为“0”，以此生成0、1条带矩阵。利用NT-SYSpc2.0软件中SimQual程序计算相似性系数矩阵，以Clustering程序中SHNN进行聚类分析；使用Tree Plot模块生成聚类图，并构建分子进化树。
在本发明的一些实施方式中，DNA指纹图谱的构建采用TBtools软件，绘制信息基于条带信息生成的0、1数据矩阵。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一组用于鉴别番石榴遗传多样性分析的ISSR引物组，该可以在更大的样本量的情况下实现高精准度的测定工作，可识别的多态性高达89.68％，远超传统技术，实现了番石榴品种的精准分类。
(2)本发明中的集合了番石榴DNA提取方法、番石榴ISSR-PCR反应、琼脂糖凝胶对ISSR-PCR扩增产物分离等多个步骤，通过其组合实现了大规模番石榴品种遗传多样性高准确度分析工作，而且基于该方法，其条带分辨率更高，扩增片段更清晰，反应更加稳定，多态性识别度更高，可在短时间内完成大批量实验材料鉴定。
(3)本发明中的鉴定方法鉴定成本低，有效缩短了样品的检测时间，结果稳定可靠，且能准确分辨番石榴种质资源间的亲缘关系，对番石榴种质资源的鉴定有重大意义。
附图说明
图1为本发明实施例中获得的部分番石榴样品的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为使用UBC880引物扩增部分番石榴样品的扩增结果。
图3为使用UBC888引物扩增部分番石榴样品的扩增结果。
图4为本发明实施例中基于ISSR遗传距离的不同番石榴样品的UPGMA聚类图。
图5为本发明实施例中基于ISSR遗传距离的不同番石榴样品的UPGMA聚类图。
图6为本发明实施例中基于ISSR遗传距离的不同番石榴样品的UPGMA聚类图。
图7为本发明实施例中得到的DNA指纹编码图谱原图。
图8为图7所示的DNA指纹编码图谱的部分放大图。
图9为图7所示的DNA指纹编码图谱的部分放大图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
番石榴总DNA提取
在下述实施例中，其所用的番石榴样本为采自均由广东省农业科学院果树研究所从广东省各地收集得到，共59份番石榴样本(嫩叶)。
其中，具体的试验编号信息与品种来源情况如表1所示。
表1番石榴样品试验编号信息与品种来源情况
Figure BDA0003580045970000051
Figure BDA0003580045970000061
具体提取步骤如下：
将番石榴总DNA提取过程中用到的枪头、离心管、研钵等预先高压灭菌30min。
取植物基因组DNA提取试剂盒(M5 HiPer Plant Genomic DNA Kit，购自北京聚合美)中的裂解液，按质量比计，加入10％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％巯基乙醇，放入65℃水浴锅中预热。在液氮中研磨0.1g待测的番石榴嫩叶，加入上述裂解液混合液，混匀，倒入灭菌后的离心管中，65℃水浴45min～1h，期间，每间隔10min摇晃一次以帮助充分裂解。加入等体积的氯仿，混匀，12000rpm常温离心8min。取上清，重复离心1次。取上清，按1：1.5的体积比加入试剂盒中的结合液，充分混匀；吸取上清，将其转移至DNA纯化柱中。12000rpm常温离心30s，弃去收集管内的液体，重复此步骤直至将溶液完全转移。向DNA纯化柱中加入700μL漂洗液(来自上述植物基因组DNA提取试剂盒)，12000rpm常温离心30s，弃去收集管内的液体，然后重复该步骤1次；12000rpm再次离心2min。将DNA纯化柱取出晾干，直至无乙醇残留。然后将DNA纯化柱置于新的1.5ml离心管中，向纯化柱正中央加入50-100μL的ddH2O，静置2min，12000rpm离心1min。再次加入50-100μL的ddH2O，静置2min，12000rpm离心1min。弃去纯化柱，收集离心管内的液体，即得纯化后的番石榴总DNA。
使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测所得的番石榴总DNA纯度，-20℃保存备用。
其中，部分样品的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
ISSR引物组合及PCR反应体系的设置
在本实施例中，发明人共采用了10条引物构建检测引物组合，以用于检测番石榴品种多态性。
具体的引物序列如表2所示。
表2引物及其核苷酸序列
引物编号 引物序列(5’→3’)
UBC807 AGAGAGAGAGAGAGAGT(SEQ ID NO:1)
UBC808 AGAGAGAGAGAGAGAGC(SEQ ID NO:2)
UBC809 AGAGAGAGAGAGAGAGG(SEQ ID NO:3)
UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT(SEQ ID NO:4)
UBC835 AGAGAGAGAGAGAGAGYC(SEQ ID NO:5)
UBC841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC(SEQ ID NO:6)
UBC842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG(SEQ ID NO:7)
UBC880 GGAGAGGAGAGGAGA(SEQ ID NO:8)
UBC881 GGGTGGGGTGGGGTG(SEQ ID NO:9)
UBC888 BDBCACACACACACACA(SEQ ID NO:10)
基于上述10条引物分别对番石榴总DNA进行PCR检测，具体反应体系如表3所示。
表3PCR反应体系
组分 含量
番石榴总DNA 2μL
SEQ ID NO:1～10任一条引物(10μmol/L) 1μL
MasterMix 15μL
去离子水 12μL
总计 30μL
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火45s，40个循环；72℃延伸10min。
得到的PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检验证，上样量为8μL/个样品。
其中，以使用UBC880引物和UBC888引物扩增结果为例，结果如图2～3所示，可以发现，其极好的展示了不同样品的扩增条带，且清晰度高，极易于技术人员分辨。
通过使用上述引物组对59份番石榴样品进行扩增，其获得的每条引物多态性扩增结果如表4所示。
表4引物组对59份番石榴样品的扩增结果
引物编号 扩增条带数 多态性条带数 多态性百分率/％
UBC807 14 13 92.86
UBC808 12 10 83.33
UBC809 9 6 66.67
UBC810 10 7 70.00
UBC835 12 11 91.67
UBC841 13 13 100.00
UBC842 14 12 85.71
UBC880 17 17 100.00
UBC881 10 9 90.00
UBC888 15 15 100.00
总计 126 113 89.68
可以发现，10条引物总计的扩增条带数为126条，其中多态性条带113条，测得的多态性百分率为89.68％。平均每条引物扩增得到条带12.60条，平均每条引物扩增得到多态性条带11.30条，每条引物的多态性条带比例均高于60％。上述引物扩增结果表明，在本发明实施例中构建得到的引物组扩增得到的条带信息量适中，多态性丰富，可用于后续的遗传多样性分析及指纹图谱构建工作。
上述ISSR-PCR反应体系在番石榴品种遗传多样性分析中的应用
通过上述ISSR-PCR反应体系的检测结果，可以对番石榴样品进行聚类分析。
具体步骤为：
将获得的电泳图谱上100～5000bp范围内同一位点上清晰且重复出现的条带记为“1”，同一位置上没有条带的记为“0”，分别获得每条引物对不同番石榴品种的0、1数据矩阵。统计每条引物扩增出的总条数和多态性总条数。用NT-SYSpc2.0软件中SimQual程序计算相似性系数矩阵，以Clustering程序中SHNN进行聚类分析；使用Tree Plot模块生成聚类图，以此构建分子进化树。
基于上述ISSR-PCR反应体系测得的ISSR分子标记，利用NTSYSpc2.0软件对该59份番石榴样品进行聚类分析。59份番石榴样品根据亲缘关系远近均被分到不同类群中，其遗传相似系数为0.50～0.96，平均遗传相似系数为0.73，品种间有一定的遗传差异。59份样品中，品种C43‘巴西2号’与C46‘巴西5号’遗传距离最近，遗传系数为0.96。品种C26‘草莓番石榴’和C46‘巴西5号’遗传距离最远，遗传系数为0.50，说明这两个品种遗传分化程度高。在遗传系数阈值0.708处，可将59份种质资源分成4组。第1组包含种质34份，编号为：C1～C9、C11、C16～C20、C22～C25和C27～C41。第2组包含种质6份，编号为C10～C15和C21。第3组包含种质18份，编号为C42～C59。编号C26‘草莓番石榴’样品单独为第4组，说明该样品与其余样品相比，发生了明显的遗传变异。其中，本实施例中具体的UMPGA聚类图如图4～6所示。
构建番石榴DNA指纹图谱：
基于每条引物呈现的条带信息可以进一步建立待测番石榴的DNA指纹图谱，具体步骤如下：
在本实施例中，发明人为了节省工作量，仅从上述10条引物中随机筛选7条条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于番石榴DNA指纹图谱的编写，当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，合理选择不同数量的引物的条带信息作为参考绘制DNA指纹图谱。
在本实施例中，发明人选择的引物为上述10条引物中的UBC808、UBC810、UBC835、UBC841、UBC842、UBC880、UBC888所得到的条带信息。对这7条引物中清晰、典型，多态性丰富的多态性条带进行赋值，引物典型条带赋值信息见表5。
表5 7条ISSR引物扩增典型条带的赋值
Figure BDA0003580045970000091
Figure BDA0003580045970000101
其中，*代表品种特征条带。
根据表5中的多态性条带赋值标准对59份番石榴供试样品进行DNA指纹编码，指纹图谱编码如表6所示。根据扩增得出的0、1数据矩阵在TBtools中生成指纹图谱如图7～9所示。
表6 59份番石榴种质资源指纹图谱编码
Figure BDA0003580045970000102
Figure BDA0003580045970000111
综上所述，可以发现，通过上述ISSR-PCR反应体系能够很好的用于番石榴样品的种质鉴别，从而得到其对应的种质关系和具体的DNA图谱，从而为番石榴样品的种质开发和选育鉴定提供有效的技术支持。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院果树研究所
<120> 一种番石榴ISSR-PCR分子标记组合及其应用
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagagagag agagagt 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagagagag agagagc 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agagagagag agagagg 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
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<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agagagagag agagagyc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagagagaga gagagayc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gagagagaga gagagayg 18
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggagaggaga ggaga 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gggtggggtg gggtg 15
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
bdbcacacac acacaca 17

Claims (10)

1.一组用于鉴别番石榴遗传多样性分析的ISSR引物组，其特征在于，所述引物组由SEQID NO：1～10组成。
2.一种用于鉴别番石榴遗传多样性分析的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中含有权利要求1所述的ISSR引物组。
3.权利要求1所述的ISSR引物组在制备番石榴遗传多样性检测产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂、检测试剂盒、检测芯片。
5.权利要求1所述的ISSR引物组在番石榴种质选育中的应用。
6.一种鉴别番石榴品种遗传多样性的方法，包括如下步骤：
(1)提取番石榴样品DNA，基于SEQ ID NO：1～10中至少一条引物分别独立进行扩增，得到扩增产物；
(2)电泳分离扩增产物，并进行凝胶成像，获得条带信息；
(3)根据条带信息进行聚类分析，并建立DNA指纹图谱，从而鉴别出番石榴品种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增的反应体系为：
Figure FDA0003580045960000011
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增的反应程序为：94～95℃预变性2～5min；94～95℃变性25～30s，50℃退火42～45s，40～45个循环；72℃延伸9～10min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO:2、4～8和10的组合。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物为SEQ ID NO：1～10的组合。
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