CN114807140A - 一种肌源性细胞血糖响应型表达sia的启动子、重组载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子、重组载体及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域，本发明使用血糖响应型肌肉特异性启动子pGREMS调控SIA的表达，实现了高活性单链胰岛素类似物SIA3，SIA4，SIA7在骨骼肌部位特异性高效表达并分泌至血液中，可以达到有效降血糖的效果。同时由于设计筛选的启动子具有血糖响应性功能可以在血糖较低时关闭胰岛素表达，避免因胰岛素过量表达产生的低血糖副作用。本发明提供的重组表达载体可应用于制备治疗糖尿病药物中，尤其适用于I型糖尿病，且提供的重组表达载体构建方法简单、操作方便，适用于工业化大规模生产。

Description

一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子、重组载体及其 构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子、重组载体及其构建方法和应用。

背景技术

胰岛素分泌不足是糖尿病的核心发病原因，Ⅰ型糖尿病(T1D)的治疗需要终生使用外源性胰岛素。在过去的100年中，胰岛素治疗的发展取得了很大进展，开发了新的胰岛素制剂与递送方法包括新的胰岛素和胰岛素类似物、不带和带传感器的连续皮下胰岛素输注、预测低血糖悬浮功能以及根据患者连续血糖监测读数持续自动调节的闭环系统。这些技术的发展扩大了产品范围，给临床医生以实现严格的血糖控制的可能。

T1D的治疗主要是每日多次注射短效或者长效的胰岛素，或使用胰岛素泵持续皮下胰岛素输注。然而，即使每天频繁的血糖自我监控与胰岛素注射仍旧难以精准将血糖水平维持在正常范围内。急性的高血糖可能引起糖尿病酮症酸中毒或高渗性非酮症昏迷，严重时会危及生命；长期的高血糖会导致大血管、微血管和神经病变等一系列并发症。而胰岛素过量可引起低血糖，甚至会导致休克、癫痫甚至死亡。

因此下一代胰岛素治疗的选择可能是“智能”(葡萄糖反应性)胰岛素，它能根据内源性葡萄糖感应反馈机制提供胰岛素。这样的系统将像内源性胰腺β细胞一样，提供与患者血糖状态成比例的胰岛素作用。

近年来兴起的合成生物学为“智能(葡萄糖反应性)胰岛素”的治疗提供了新的思路。目前基于合成生物学的胰岛素释放刺激，包括代谢产物控制例如葡萄糖，天然化学物质控制合成基因网络(例如，齐墩果酸，茶多酚)，获许可药物控制基因电路，外部物理信号调节的基因电路(如光，电)，或电子设备控制的遗传电路(如智能手机)等等。但是转化为实际应用还有待解决一些问题：目前研究所采用的主要是人源细胞HEK-293，但对于临床转化来说，将系统整合至病人的原代细胞中才会更加安全。并且细胞植入体内采取的微胶囊包裹技术，细胞生命周期上较短不能达到长期的治疗效果。

因此，目前有必要探究一种智能、便捷、安全、低成本的T1D治疗方法，设计一套体内胰岛素类似物的智能表达调控系统。使得在骨骼肌中胰岛素类似物SIA的产生能够根据体内血糖浓度高低自行启动与关闭，即：血糖浓度高，SIA产生系统启动；血糖浓度低，SIA产生系统关闭，在T1D患者体内实现胰岛素类似物的血糖响应性表达。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子、重组载体及其构建方法和应用，所述重组表达体在骨骼肌部位特异性高效表达，且可以响应血糖以血糖依赖形式表达SIA达到有效降低血糖作用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子，所述肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子为pGREMS，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

制备上述肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子的引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

pGREMS-F：5'-CGACGCGTGCACCAGACAGTGACGTCAGC-3’；SEQ ID NO.2

pGREMS-R：5'-CGGGATCCTAGGGAAACCTGAAGCCGG-3’；SEQ ID NO.3。

一种重组载体，包含上述的肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子。

一种重组载体的构建方法，它包括以下步骤：

S1.扩增CRE片段：从质粒pCRE-SEAP上扩增CRE片段，质粒pCRE-SEAP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2.扩增CRE-EMS片段：以pEMS-SIA-his为模板扩增CRE-EMS片段，质粒pEMS-SIA3-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.5；

S3.扩增pGREMS片段：以CRE片段与CRE-EMS片段为模板，扩增pGREMS片段；

S4.构建载体：将质粒pSC-SIA-his进行MluI和BamHI双酶切，去除sv40 enhancer-CMV片段的部分与扩增后的pGREMS片段进行连接，构建pGREMS-SIA-his载体。

进一步地，所述质粒pSC-SIA-his为pSC-SIA3-his、质粒pSC-SIA4-his和质粒pSC-SIA7-his，构建的载体分别为pGREMS-SIA3-his，pGREMS-SIA4-his，pGREMS-SIA7-his载体；

其中，所述质粒pSC-SIA3-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，质粒pSC-SIA4-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，质粒pSC-SIA7-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；载体pGREMS-SIA3-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，载体pGREMS-SIA4-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，载体pGREMS-SIA7-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步地，所述扩增CRE片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：

CRE-F：5'-CGACGCGTGCACCAGACAGTGACGTCAGC-3’SEQ ID NO.12；

CRE-R：5'-CACTAACGGGACTTTCCAACTTGGCAGTACATCAAGTTCTCCCATTGACGTCAATG-3’SEQ ID NO.13。

进一步地，所述扩增CRE-EMS片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，具体为：

CRE-EMS-F：5'-AAAGTCCCGTTAGTGCCCATTGACGTCAATAATGCACCAGACAGTG ACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACATATGGCGACGGCC-3’SEQ ID NO.14

CRE-EMS-R：5'-TAGGGAAACCTGAAGCCGG-3’SEQ ID NO.15。

上述的重组载体，上述的方法构建的pGREMS-SIA-his载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。

进一步地，所述的糖尿病为Ⅰ型糖尿病。

本发明具有以下优点：

本发明公开了一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子，使用血糖响应型肌肉特异性启动子pGREMS调控SIA的表达，实现了高活性单链胰岛素类似物SIA3，SIA4，SIA7在骨骼肌部位特异性高效表达并分泌至血液中，可以达到有效降血糖的效果。同时由于设计筛选的启动子具有血糖响应性功能可以在血糖较低时关闭胰岛素表达，避免因胰岛素过量表达产生的低血糖副作用。本发明提供的重组表达载体可应用于制备治疗糖尿病药物中，尤其适用于I型糖尿病，且提供的重组表达载体构建方法简单、操作方便，适用于工业化大规模生产。

附图说明

图1为pGREMS启动子血糖响应性响应性检测结果图：将pGREMS-luc，pGREMS-seap质粒瞬时转染至C₂C₁₂细胞中，用不同浓度梯度葡萄糖处理48h后，检测报告基因luc与seap的表达；每组N＝3，图中，A为pGREMS-luc；B为pGREMS-seap。

图2为pGREMS启动子KCl响应性检测结果图：将pGREMS-luc，pGREMS-seap质粒瞬时转染至C₂C₁₂细胞中，用不同浓度梯度KCl处理48h模拟细胞膜去极化，检测报告基因luc与seap的表达；每组N＝3，图中，A为pGREMS-luc kcl响应；B为pGREMS-seap kcl响应。

图3为pGREMS启动子肌源特异性检测结果图：将pGREMS-luc，pCMV-luc质粒瞬时转染至HEK293，NIH3T3，C₂C₁₂细胞中，48h后检测报告基因luc表达。

图4为各组小鼠血糖水平检测图。

图5为各组小鼠的体重检测图。

图6为各组小鼠在不同时间的血清胰岛素含量检测图。

图7为各组小鼠在不同时间的葡萄糖耐量IPGTT检测图；图中，A为治疗后第18天的糖耐实验结果，B为治疗后第27天的糖耐实验结果，C为治疗后第57天的糖耐实验结果。

图8为各组小鼠糖化血红蛋白值。

图9为小鼠血清氧化应激标志物SOD，GSH，T-AOC，MDA表达结果图，图中：A为MDA，B为GSH，C为T-AOC，D为SOD。

图10为小鼠肾脏氧化应激标志物SOD，GSH，T-AOC，MDA表达结果图，图中：A为MDA，B为GSH，C为T-AOC，D为SOD。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例一：pGREMS启动子细胞特异性实验

1.制备试剂

C2C12小鼠成肌细胞(mouse myoblasts)，293T人胚肾细胞(human embryonickidney cells)，HEK-293人胚肾细胞(Human Embryonic Kidney 293)，NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞系(mouse embryo fibroblast cell)均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。所用试剂配方如表1所示。

表1试剂配方

2.构建质粒

设计血糖响应型增强型肌肉特异性启动子pGREMS，利用重叠PCR克隆pGREMS序列并将其克隆到pSC质粒上，测序检验以确保序列完全准确。质粒构建，如表2所示。

表2质粒构建

质粒pGREMS-SIA3-his，pGREMS-SIA4-his，pGREMS-SIA7-his构建：

用MluI/BamHI双酶切pSC-SIA3-his，pSC-SIA4-his，pSC-SIA7-his载体，胶回收大片段，从质粒pGREMS上扩增pGREMS片段，上游酶切位点选用MluI，pGREMS-F:5’-CGACGCGTGCACCAGACAGTGACGTCAGC-3’，下游酶切位点选用BamHI，pGREMS-R::5’-CGGGATCCTAGGGAAACCTGAAGCCGG-3’；将扩增基因片段pGREMS与MluI/BamHI双酶切的pSC-SIA3-his，pSC-SIA4-his，pSC-SIA7-his载体片段进行连接构建pGREMS-SIA3-his，pGREMS-SIA4-his，pGREMS-SIA7-his载体。酶切及连接按照说明书操作。

3.pGREMS-luc，pGREMS-seap葡萄糖响应性检测

将C2C12细胞传代至96孔板中，在其密度达到75％至90％时使用LipofectamineTM3000转染试剂进行转染，所有步骤按照thermo scientific Lipofectamine^TM3000(cat.L3000150)转染试剂说明书进行。

培养6小时后，将孔板中的液体弃去，并且加入葡萄糖浓度为2.5mM的DMEM基础培养基，饥饿处理12h后，向孔板中加入不同浓度葡萄糖2.5mM，5mM，10mM，15mM，25mM，30mM。继续培养48h后，检测luc，seap的表达。

荧光素酶的活性检测

弃掉96孔板中的培养液，预冷的PBS溶液洗涤2次。胰酶消化后每孔加入200μL的1×Lysis Buffer，重悬细胞收集置EP管。冰上裂解30min，反复摇匀，12000rpm离心3min，吸取样品上清20μL置预冷的白色不透光96孔微孔板中，每个样品3个平行重复。设置全波长多功能酶标仪自动进样，每孔加入50μL的反应底物，测定荧光素酶的活性值。

样品蛋白含量的测定

BCA检测按照thermo Scientific^TMPierce^TMBCA Protein Assay Kit cat:23225样品相对荧光素酶活计算：

相对荧光素酶活单位(RLU/mg protein)＝荧光素酶活性值/蛋白含量。

seap活性检测按SEAP Reporter GeneAssay试剂盒(Luminescence)(cat:ab133077)说明书操作。如图1所示，随着葡萄糖浓度增加，luc的相对荧光素酶活增加，seap活性随着葡萄糖浓度增加而上升，表明设计的pGREMS启动子具有葡萄糖响应性。

4.pGREMS-luc，pGREMS-seap KCl响应性检测

pGREMS-luc，pGREMS-seap质粒分别转染C2C12细胞，培养6小时后，弃上清，并且加入新鲜的葡萄糖浓度为2.5mM的DMEM基础培养基，饥饿处理12h后，向孔板中加入含不同浓度KCL的培养液，KCL的浓度为5mM，20mM，40mM，60mM，80mM，100mM。继续培养48h后，检测luc的表达与样品蛋白含量，计算相对荧光素酶活具体步骤如上，不同梯度KCL处理48h后，检测seap活力具体步骤如上。

如图2所示，随着培养液中KCL浓度增加，luc的相对荧光素酶活增加，表明设计的pGREMS启动子能够响应KCL浓度，seap活性随着葡萄糖浓度增加而上升，表明pGREMS能够响应细胞的去极化。

5.pGREMS启动子细胞特异性检测

将C2C12、HEK293和NIH3T3细胞系复苏后进行培养，其密度达到70％至90％传代后接种至96孔板中，其密度达到70％至90％时用lip3000进行pGREMS-luc，pCMV-luc的细胞转染。转染48h后，弃去上清，PBS清洗2次，胰酶消化后每孔加入200μL的1×Lysis Buffer，重悬细胞收集置EP管。检测相对荧光素酶活单位。在每种细胞株中将pCMV-luc的荧光素酶活作为100％，计算相对酶活。

如图3所示，在C2C12、HEK293和NIH3T3细胞中，pGREMS-luc在C2C12表达的luc的相对荧光素酶活单位最高。这表明pGREMS启动子具有肌源细胞特异性。

实施例二：SIA质粒体内实验

C57BL/6J雄性小鼠，6周龄购入，适应性喂养1周。1型糖尿病小鼠模型的建立：建模鼠连续5d空腹腹腔注射STZ溶液(60mg/kg)，注射前禁食12h，不禁水。注射时将STZ溶于柠檬酸缓冲液中(pH 4.5)，避光冰上配制。注射后，禁食6个小时。注射完成后的第三天开始，用剪尾法采集小鼠血液，尾尖剪去1-2mm，弃掉第一滴，用罗氏血糖仪检测血糖，血糖大于16.7mmol/L且持续2周则视为糖尿病模型构建成功。

将建模成功小鼠进行随机分组，分别设置：T1D组(建模，不处理)，Exp1组(建模，注射pGREMS-SIA3)，Exp2组(建模，注射pGREMS-SIA4)及Exp3组(建模，注射pGREMS-SIA7)，另增加WT组(正常小鼠)，每组8只小鼠。每组小鼠进行2次质粒注射，第一次为建模血糖稳定2周后，一次为距第一次治疗后第30天。

将100μg pGREMS-SIA质粒分别与EGCG混匀孵育30min后与10％L64混合最终L64的浓度为0.1％，在每只小鼠左腿胫骨前肌注射，一小时后进行电脉冲处理(5Hz，3min，强度3级)。

1小鼠血糖体重检测

糖尿病患者会出现三多一少症状。糖尿病小鼠禁食不禁水处理12小时，尾尖剪去1-2mm，弃掉第一滴，用第二滴检测血糖；动作轻柔，避免应激性的高血糖，采用罗氏血糖仪对小鼠血糖进行检测。在每次测量血糖的同时，对每只小鼠的体重进行测量。在模型建前一周开始以3天为一间隔检测血糖。检测五组小鼠在接受治疗60天期间的血糖水平变化情况(每组8只)，如图4所示在实验期间正常C57BL/6J小鼠血糖始终在5-10mM范围内波动，T1D造模未治疗组小鼠血糖始终高于16.7mM，使用不同质粒进行治疗后发现，pGREMS-SIA治疗的T1D小鼠血糖得到明显控制，高血糖水平下降接近正常小鼠组。其中pGREMS-SIA3，pGREMS-SIA7，控制血糖效果最为明显，且整个实验过程中未出现明显低血糖事件，这表明在肌源细胞中以血糖响应型肌肉特异性启动子pGREMS调控人源单链胰岛素类似物表达可以在小鼠体内达到长期安全有效控血糖作用。如图5观察过程中发现糖尿病小鼠的体重有显著降低，但是经过pGREMS-SIA治疗后60d与T1D未治疗组相比体重明显增重，这表明该体系可以有效的治疗小鼠糖尿病并且控制小鼠的血糖下降。

2小鼠体内胰岛素水平检测

经过pEMS-SIA3，pEMS-SIA4，pEMS-SIA7治疗的T1D小鼠血糖降低，但是T1D建模小鼠体内胰腺已经被破坏，无法产生胰岛素。因此血糖下降主要是骨骼肌中外源表达的单链胰岛素作用。检测治疗后第0、12、24、36、48、60天各组小鼠体内胰岛素或胰岛素类似物的表达情况。

每次从小鼠眼眶后血管丛取血约200μL，4℃过夜放置后在预冷的4℃离心机中3000rpm离心15min，收集上清-80℃长期保存。胰岛素检测步骤按睿信生物Human inselisa kit说明书操作(Cat.#RXD10493H)提供的方法进行。

如图6所示，经过pGREMS-SIA3，pGREMS-SIA4，pGREMS-SIA7治疗之后，在血清中均有SIA3，SIA4，SIA7表达持续至60天，这与治疗后60天内血糖能控制在正常范围内一致。

3小鼠葡萄糖耐量实验

葡萄糖耐量测试用于评价机体对血糖浓度的调节能力，广泛应用于临床中。正常小鼠在给予葡萄糖注射或灌胃后，血糖升高，刺激胰岛素分泌、肝糖原合成增加，分解受抑制，肝糖原输出减少，体内组织对葡萄糖利用增加，2小时内血糖浓度可恢复至正常空腹水平。服用一定量葡萄糖后，每隔一定时间检测个体血糖，称为耐糖试验。

在治疗后第18天，27天，57天进行糖耐实验，小鼠禁食不禁水处理12h后，每只小鼠腹腔注射剂量为2g/Kg的葡萄糖溶液。配置的葡萄糖浓度为200mg/mL，体重20g的小鼠注射剂量为200μL。注射葡萄糖后0min，15min，30min，60min，90min，120min，150min测定小鼠的血糖。如图7所示，WT组正常小鼠在葡萄糖处理后血糖升高，但是在2h内血糖恢复正常。T1D建模未治疗的糖尿病小鼠注射葡萄糖溶液后血糖浓度急剧升高，并且持续高血糖这表明T1D对葡萄糖几乎无处理能力。pGREMS-SIA3，pGREMS-SIA4，pGREMS-SIA7这3组小鼠的葡萄糖处理能力都得到一定恢复，在150min后血糖下降接近正常水平，其中pGREMS-SIA7葡萄糖处理能力恢复最为显著，数据表明SIA3，SIA4，SIA7能够有效提高葡萄糖处理能力，达到降血糖作用。

4小鼠糖化血红蛋白

糖化血红蛋白(HbA1c)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类(主要指葡萄糖)通过非酶反应相结合的产物。可反映近期2-3个月血糖水平，是评价长期血糖控制“金标准”，也是指导临床调整治疗方案的重要依据。临床上常用作糖尿病控制的监测指标，其浓度用占血红蛋白的百分比表示。

小鼠治疗后的第60天采血后进行小鼠糖化血红蛋白检测。

HbA1c检测步骤按照南京建成生物工程研究所糖化血红蛋白A1c(GHbA1c)试剂盒(Cat:H464-1)说明书操作计算公式：糖化血红蛋白的结果以每10克血红蛋白的吸光度表示：

每10克血红蛋白的吸光度＝(测定OD值-空白OD值)/2ml溶血液中血红蛋白克数

x稀释倍数×10g＝(测定OD值-空白OD值)/血红蛋白克数/毫升溶血液×10

如图8所示，STZ建模后小鼠平均糖化血红蛋白9.35％，健康小鼠平均值为5.31％，经过治疗60d后T1D小鼠的糖化血红蛋白极大改善，接近于正常水平，这表明pEMS-SIA3，pEMS-SIA4，pEMS-SIA7治疗能在60天内有效的控制血糖，改善小鼠健康状况。

5小鼠氧化应激

糖尿病并发症(视网膜病变、神经病变和肾病、足溃疡等)和合并症(糖尿病合并肿瘤、糖尿病合并脂肪肝等)是糖尿病患者致残、致死的首要原因。WHO发布的相关报告显示近10年来，我国因糖尿病导致的经济损失高达3.8万亿元，而这些费用的80％主要用于其并发症/合并症的治疗。这说明无论从健康角度或经济角度，对于这些疾病的预防至关重要。

高血糖引发并发症/合并症的原因众多，如多元醇通路、蛋白激酶C、糖基化终末产物、炎症等，但究其上游均与氧化应激/活性氧自由基(ROS)的过度生成有关。因此，抗氧化可能是对并发症/合并症实行有效干预的途径。

实施例三：氧化应激标志物检测

1小鼠肾脏和血清中还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测

GSH检测按照索莱宝还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒(Cat:BC1175)说明书操作2丙二醛(MDA)含量检测

MDA检测按照索莱宝丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(Cat:BC0025)说明书操作3超氧化物歧化酶(SOD)活性检测

SOD检测按照索莱宝超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(Cat:BC0175)说明书操作4总抗氧化能力(T-AOC)检测

T-AOC检测按照索莱宝总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(Cat:BC1315)说明书操作

检测了治疗后60d检测GSH，T-AOC，MDA，SOD四种氧化应激标志物在各组小鼠血清和肾脏中的含量。如图9，10所示在STZ诱导的T1D小鼠经过pGREMS-SIA3，pGREMS-SIA4，pGREMS-SIA7肌注治疗与T1D组相比血清和肾脏中中氧化应激标志物SOD,GSH,T-AOC水平升高,MDA水平下降。这些结果表明经过pGREMS-SIA3，pGREMS-SIA4，pGREMS-SIA7治疗T1D的小鼠，能够长期调控胰岛素表达与释放改善体内的糖代谢紊乱降低氧化应激水平。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子、重组载体及其构建方法和应用

<130> 2022

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 863

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcaccagaca gtgacgtcag ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag 60

acaccccatt gacgtcaatg ggagaacttg atgtactgcc aagttggaaa gtcccgttag 120

tgcccattga cgtcaataat gcaccagaca gtgacgtcag ctgccagatc ccatggccgt 180

catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg ggagaacata tggcgacggc 240

cgggcccctc cctggggaca gccccggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 300

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccagga ctatataaaa aacctgaccc 360

gatatgcctg gccagccaat agcggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 420

tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccagacac ccaaatatgg cgacgggtga 480

ggaatggtga ccaagtcagc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta 540

tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaccaacac ctgctgcctg cccgctctaa 600

aaataactcc cggcttcagg tttccctagg gcccctccct ggggacagcc ccatatggcg 660

acggcccccc attgacgtca atgggacggt aaatggcccg cctggcgccc attgacgtca 720

ataatccagc caatagcacc cgatatgcct ggggactata taaaaaacct gggacacccg 780

agatgcctgg ttacaaggcc tggggacacg ctctaaaaat aactccccca acacctgctg 840

cctgccggct tcaggtttcc cta 863

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgacgcgtgc accagacagt gacgtcagc 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cgggatccta gggaaacctg aagccgg 27

<210> 4

<211> 4893

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcgcac cagacagtga cgtcagctgc cagatcccat 60

ggccgtcata ctgtgacgtc tttcagacac cccattgacg tcaatgggag aacagatctg 120

ccgccccgac tgcatctgcg tgttcgaatt cgccaatgac aagacgctgg gcggggtttg 180

tgtcatcata gaactaaaga catgcaaata tatttcttcc ggggacaccg ccagcaaacg 240

cgagcaacgg gccacgggga tgaagcagaa gcttcgaatc gcgaattcgc ccaccatgct 300

gctgctgctg ctgctgctgg gcctgaggct acagctctcc ctgggcatca tcccagttga 360

ggaggagaac ccggacttct ggaaccgcga ggcagccgag gccctgggtg ccgccaagaa 420

gctgcagcct gcacagacag ccgccaagaa cctcatcatc ttcctgggcg atgggatggg 480

ggtgtctacg gtgacagctg ccaggatcct aaaagggcag aagaaggaca aactggggcc 540

tgagataccc ctggccatgg accgcttccc atatgtggct ctgtccaaga catacaatgt 600

agacaaacat gtgccagaca gtggagccac agccacggcc tacctgtgcg gggtcaaggg 660

caacttccag accattggct tgagtgcagc cgcccgcttt aaccagtgca acacgacacg 720

cggcaacgag gtcatctccg tgatgaatcg ggccaagaaa gcagggaagt cagtgggagt 780

ggtaaccacc acacgagtgc agcacgcctc gccagccggc acctacgccc acacggtgaa 840

ccgcaactgg tactcggacg ccgacgtgcc tgcctcggcc cgccaggagg ggtgccagga 900

catcgctacg cagctcatct ccaacatgga cattgacgtg atcctaggtg gaggccgaaa 960

gtacatgttt cgcatgggaa ccccagaccc tgagtaccca gatgactaca gccaaggtgg 1020

gaccaggctg gacgggaaga atctggtgca ggaatggctg gcgaagcgcc agggtgcccg 1080

gtatgtgtgg aaccgcactg agctcatgca ggcttccctg gacccgtctg tgacccatct 1140

catgggtctc tttgagcctg gagacatgaa atacgagatc caccgagact ccacactgga 1200

cccctccctg atggagatga cagaggctgc cctgcgcctg ctgagcagga acccccgcgg 1260

cttcttcctc ttcgtggagg gtggtcgcat cgaccatggt catcatgaaa gcagggctta 1320

ccgggcactg actgagacga tcatgttcga cgacgccatt gagagggcgg gccagctcac 1380

cagcgaggag gacacgctga gcctcgtcac tgccgaccac tcccacgtct tctccttcgg 1440

aggctacccc ctgcgaggga gctccatctt cgggctggcc cctggcaagg cccgggacag 1500

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gcccctggac gaagagaccc acgcaggcga ggacgtggcg gtgttcgcgc gcggcccgca 1680

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agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atcgataagg atccgtcgac cgatgccctt 2100

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<210> 5

<211> 5757

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

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<211> 5894

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

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tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 5820

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<210> 8

<211> 5897

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gacggatcgg gagatctcga tggagcggag aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg 60

ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca 120

tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacacct ggttgctgac taattgagat 180

gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac cctaactgac 240

acacattcca cagcacgcgt gcaccagaca gtgacgtcag ctgccagatc ccatggccgt 300

catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg ggagaacttg atgtactgcc 360

aagttggaaa gtcccgttag tgcccattga cgtcaataat gcaccagaca gtgacgtcag 420

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gcatgctttg catacttctg cctgctgggg agcctgggga ctttccacac cctaactgac 240

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<210> 10

<211> 5726

<212> DNA

<213> 人工合成

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tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag 3420

cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 3480

cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 3540

cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 3600

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 3660

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 3720

cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 3780

tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3840

tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3900

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3960

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 4020

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 4080

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 4140

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 4200

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4260

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 4320

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 4380

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc 4440

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4500

ccgctggtag cggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 4560

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 4620

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 4680

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 4740

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 4800

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 4860

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 4920

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 4980

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 5040

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 5100

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 5160

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 5220

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 5280

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 5340

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 5400

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 5460

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 5520

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 5580

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 5640

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 5700

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtc 5729

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cgacgcgtgc accagacagt gacgtcagc 29

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cactaacggg actttccaac ttggcagtac atcaagttct cccattgacg tcaatg 56

<210> 14

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

aaagtcccgt tagtgcccat tgacgtcaat aatgcaccag acagtgacgt cagctgccag 60

atcccatggc cgtcatactg tgacgtcttt cagacacccc attgacgtca atgggagaac 120

atatggcgac ggcc 134

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tagggaaacc tgaagccgg 19

Claims (9)

1.一种肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子，其特征在于，所述肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子为pGREMS，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.制备如权利要求1所述肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子的引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的肌源性细胞血糖响应型表达SIA的启动子。

4.一种重组载体的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 扩增CRE片段：从质粒pCRE-SEAP上扩增CRE片段，质粒pCRE-SEAP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2. 扩增CRE-EMS片段：以pEMS-SIA3-his为模板扩增CRE-EMS片段，质粒pEMS-SIA-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.5；

S3. 扩增pGREMS片段：以CRE片段与CRE-EMS片段为模板，扩增pGREMS片段；

S4. 构建载体：将质粒pSC-SIA-his进行MluI和BamHI双酶切，去除sv40 enhancer-CMV片段的部分与扩增后的pGREMS片段进行连接，构建pGREMS-SIA-his载体。

5.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述质粒pSC-SIA-his为pSC-SIA3-his、质粒pSC-SIA4-his和质粒pSC-SIA7-his，构建的载体分别为pGREMS-SIA3-his，pGREMS-SIA4-his，pGREMS-SIA7-his载体；

其中，所述质粒pSC-SIA3-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，质粒pSC-SIA4-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，质粒pSC-SIA7-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；载体pGREMS-SIA3-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，载体pGREMS-SIA4-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，载体pGREMS-SIA7-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

6.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述扩增CRE片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

7.根据权利要求4所述的一种重组载体的构建方法，其特征在于，所述扩增CRE-EMS片段的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

8.权利要求3所述的重组载体，权利要求4-7中任一所述的方法构建的pGREMS-SIA-his载体在制备治疗糖尿病药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病为Ⅰ型糖尿病。

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