CN114807101A - 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌 - Google Patents

包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌 Download PDF

Info

Publication number
CN114807101A
CN114807101A CN202210697584.7A CN202210697584A CN114807101A CN 114807101 A CN114807101 A CN 114807101A CN 202210697584 A CN202210697584 A CN 202210697584A CN 114807101 A CN114807101 A CN 114807101A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
leu
asp
ala
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210697584.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114807101B (zh
Inventor
曹海燕
林兆生
连婕妮
王惠
刘伟华
徐艳玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd, Beijing Huizhiheng Biological Technology Co Ltd filed Critical Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202210697584.7A priority Critical patent/CN114807101B/zh
Publication of CN114807101A publication Critical patent/CN114807101A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114807101B publication Critical patent/CN114807101B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21009—Enteropeptidase (3.4.21.9), i.e. enterokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，及其表达载体和重组大肠杆菌工程菌。本发明通过对肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白的选择，提高了融合蛋白的表达量和表达稳定性。本发明的牛肠激酶轻链蛋白重组工程菌能够显著提高牛肠激酶轻链蛋白的表达量和活性收率。

Description

包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工 程菌
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组大肠杆菌工程菌。
背景技术
丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守，其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性，且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征，而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用工具酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的工具酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性，使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。
目前，重组基因工程菌表达是制备重组工具酶的主要方法，表达系统包括原核基因表达系统、真核基因表达系统和动物细胞表达系统。而在工具酶制备中，前两者是最为常用的表达系统。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时，大多研究利用融合蛋白表达方式，将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上，形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时，引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外，最后，通过蛋白酶等将引导肽切除去。
但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要能够更优的适应大肠杆菌表达系统，具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，及其表达载体和重组大肠杆菌工程菌。
本发明通过对酶切位点、连接体多肽和伴侣蛋白等的选择，构建得到包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，并将其用于构建重组工程菌以高效表达EK酶或突变的EK酶。
本发明第一方面提出包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，融合蛋白包括牛肠激酶轻链、肠激酶酶切位点多肽和伴侣蛋白。其中，牛肠激酶轻链可以为野生型，也可为突变型。肠激酶酶切位点多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。肠激酶酶切位点多肽和伴侣蛋白之间可以直接相连，并优选通过连接体多肽相连。可用的连接体多肽实例如SEQ ID No:3 ~SEQ ID No:6所示，伴侣蛋白可选自如SEQ ID No:7~ SEQ ID No:11所示氨基酸序列的伴侣蛋白，伴侣蛋白可帮助牛肠激酶轻链蛋白高效表达。
具体的，连接体多肽氨基酸序列如表1所示：
表1
Figure 46941DEST_PATH_IMAGE001
具体的，伴侣蛋白的氨基酸序列如表2所示：
表2
Figure 238888DEST_PATH_IMAGE002
作为本发明一种优选的技术方案，连接体多肽进一步优选如SEQ ID No:4或SEQID No:6所示的连接体多肽，伴侣蛋白进一步优选SEQ ID No:8或SEQID No:11所示的伴侣蛋白。
作为本发明一种优选的技术方案，在上述牛肠激酶轻链蛋白的重组融合蛋白中，连接体多肽选自如SEQ ID No:4氨基酸序列所示的连接体多肽，伴侣蛋白选自如SEQ IDNo:8所示的氨基酸序列；或者连接体多肽选自如SEQ ID No:6氨基酸序列所示的连接体多肽，伴侣蛋白选自如SEQ ID No:11所示的氨基酸序列。经筛选实验发现，SEQ ID No:4所示氨基酸序列的连接体多肽与SEQ ID No:8所示的伴侣蛋白合用的组合方式，SEQ ID No:6所示氨基酸序列的连接体多肽与SEQ ID No:11所示的伴侣蛋白合用的组合方式，可更有效的促进目的蛋白的表达。
作为本发明一种优选的技术方案，在牛肠激酶轻链蛋白的重组融合蛋白中，SEQID No:4氨基酸序列所示的连接体多肽与SEQ ID No:8所示的伴侣蛋白合用时，活性的目的蛋白的表达量更高。如SEQ ID No:8氨基酸序列所示的TrxA伴侣蛋白，可帮助目的蛋白高效表达，同时也可促进二硫键的正确形成，帮助目的蛋白正确折叠，从而进一步提高牛肠激酶轻链蛋白的稳定性。
在本发明中，牛肠激酶轻链可以为野生型，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。作为优选的技术方案，所述牛肠激酶轻链可以为牛肠激酶轻链突变体；其氨基酸序列如SEQID No:12或SEQ ID NO:13所示。
牛肠激酶轻链突变体的设计方式为：在野生型牛肠激酶轻链基础上，在101、112、177位氨基酸发生突变，具体的突变为：K101P、C112T和A177K。上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。
野生型牛肠激酶轻链（即EK酶）在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化。而EKLm1是一种已商业化EK酶（雅心），其相对于衍生型牛肠激酶轻链第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，该突变使得EKLm1相较于野生型具备更好的复性率，该EK酶的氨基酸序列如SEQID NO:12所示。
虽然上述EKLm1相较于野生型具备更优的复性率，但碍于EK酶特点，其复性收率仍相对较低。为了获得改善的蛋白的体外复性效率，提高蛋白本申的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升，发明人设计了牛肠激酶轻链突变体。本发明结合序列的保守型及三维空间结构分析，在野生型牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，可以减少变性过程中聚集体的产生。在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第101位赖氨酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸，得到突变体EKLm3，其氨基酸序列如SEQ ID No:13所示。
具体的突变体EK酶的氨基酸序列如下：
(1) 突变体EKLm1氨基酸序列SEQ ID No:12：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；
（2）突变体EKLm3氨基酸序列SEQ ID No:13：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMPVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEKGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH。
本发明第二方面提出编码上述融合蛋白的多核苷酸，其中，表达EKLm1的重组表达框的核苷酸序列如SEQ ID No:14所示，表达EKLm3的重组表达框的核苷酸序列如SEQ IDNo:15所示。
本发明第三方面提出有一种用于表达牛肠激酶蛋白的表达载体，其包含上述编码融合蛋白的多核苷酸。将本发明合成的表达框序列克隆到表达载体上，可得到用于表达牛肠激酶蛋白的表达载体。具体的，可将表达框序列克隆到质粒pET-30a(+)的酶切位点之间，获得重组pET-30a(+)表达载体。例如，可采用NdeI和XhoI酶切位点等。
本发明第四方面提出一种包括上述表达载体的重组大肠杆菌工程菌。将上述表达载体转化到宿主细胞中，得到包括上述表达载体的重组大肠杆菌工程菌。本发明的重组工程菌优选大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）。转化的方式可采用热击法。并经过抗性筛选单克隆得到基因工程菌，将获得的基因工程菌冷冻保存。经发酵培养、纯化和活性检测，本发明实施例的重组EK酶工程菌表达目的蛋白的收率和野生型相比，可显著提高牛肠激酶轻链蛋白的收率，并可同时保证蛋白的活性。
本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明的包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白可帮助目的蛋白在本发明重组工程菌发酵过程中高效表达，显著提高目的蛋白的表达量。同时还可以促进二硫键的正确形成，帮助目的蛋白正确折叠，从而提高目的蛋白的稳定性。
在优选的技术方案中，通过牛肠激酶轻链突变体，进一步改善了蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现了产业化应用价值的有效提升。
附图说明
图1为本发明实施例1中的SDS-PAGE凝胶电泳图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
以下实施例所用到的试剂及仪器均为市售。
实施例1：
本实施例用于说明牛肠激酶轻链蛋白表达构建体的筛选：以野生型牛肠激酶轻链SEQ ID No:1进行。
1、合成表达EK酶的重组表达框：重组表达框编码包含野生型牛肠激酶轻链EKL的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白在野生型牛肠激酶轻链（SEQ ID No:1）N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、和/或连接体多肽和伴侣蛋白所得。具体按照表3分别构建重组表达框：
表3
Figure 318839DEST_PATH_IMAGE003
以序号1所示序列组合的重组融合蛋白为例，其完整重组融合蛋白序列如SEQ IDNo:16所示。
2、重组蛋白的表达载体的构建及工程菌的构建
将上述步骤1中构建的表达EKL的表达框序列插入到质粒pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到表达载体，测序验证后，并将上述表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）中，经过抗性筛选单克隆，挑取该阳性克隆接种到含有相关抗性的液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD600值=1 ~ 1.5，菌液在生物安全柜内加入50%甘油（菌液：50%甘油=2：1），即每个2mL的无菌冻存管中加菌液600μL和50%甘油300μL，在离心管内混合均匀（每个克隆至少保存10管），-80℃保存。经测序，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致。基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
3、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
（1）LB培养基配制，按照表4所示配置：
表4
Figure 344564DEST_PATH_IMAGE004
（2）工程菌复苏
取前述得到甘油菌各一支，分别按照千分之一接种量接入到装有20 mL灭菌后培养基的三角瓶中，于37℃、200 rpm的条件下过夜培养，得相应重组工程菌的复苏菌液。
（3）工程菌的诱导表达
取上述复苏菌液分别按照百分之一接种量接入到装有50 mL灭菌后培养基的三角瓶中于37℃，220 rpm的条件下培养至OD 600 = 0.6 ~ 0.8时加入终浓度为0.5 mM的IPTG，并于30℃、220 rpm条件下进行过夜诱导表达。
（4）菌体收集及SDS-PAGE表达检测
菌液于8000 rpm，4℃离心30min，弃上清收获菌体。菌体经超声破碎后获得包涵体，并进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。
（5）重组蛋白菌体制备
将SDS-PAGE检测并确定有目的蛋白的表达的工程菌进行5L摇瓶发酵制备菌体，方法同上述步骤（1）和步骤（2），菌液于8000 rpm，4℃离心30 min，弃上清收获菌体。
（6）菌体破碎及包涵体制备
Buffer1配方：50mMTris + 0.5 mol/L NaCl，pH=8.5；
Buffer2配方：50mMTris + 2M尿素 + 0.5 mol/L NaCl + 1.5%Triton，pH=8.5；
按照W/V=1:10的比例用Buffer1重悬菌体，高压匀质机进行破碎处理（800 Bar 3次），离心（10000 g，30 min，4℃）处理留沉淀；按照W/V=1：10的比例用Buffer2重悬洗涤，20min后离心处理，同上；最后用UP水按照w/v=1:10重悬洗涤包涵体，离心（10000g，30min，4℃），留沉淀。
（7）包涵体变性和复性
变性液配方：6M尿素+ 50mMTris + 20mMDTT；
复性液配方：2M尿素+ 1%PEG1000 + 2mM还原型半胱氨酸 + 1mM氧化型半胱氨酸+ 50mMTris，pH=8.0；
包涵体变性：按照w/v=1：10比例，用变性液重悬包涵体，室温搅拌2 ~ 3小时；离心（13000g，30 min，4℃）留上清；
包涵体复性：按照v/v=1：20比例将变性液稀释缓慢添加至复性液，室温搅拌过夜进行复性。
（8）目的蛋白纯化和检测
层析柱：QHP柱；
缓冲液：缓冲液A：50 mM Tris，pH=8.0；
缓冲液B：1 mol/L NaCl + 50 mM Tris，pH=8.0；
程序：流速5 mL/min；
5CV 100% 缓冲液A；
20CV 0%~100% 缓冲液B。
纯化蛋白经测序验证，均为本发明设计的重组融合蛋白序列。
（9）SDS-PAGE凝胶电泳检测表达
将纯化的重组融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。结果显示，按照表3中序号1所示的组合（使用GST分子伴侣）构建的重组工程菌，表达结果显示其GST虽然可以促进目的蛋白包涵体的表达，但其表达的可溶蛋白无生物学活性，故在后续研究中，不再对该组合进行考察。其他组合，均能表达有活性的目的蛋白，但其表达量存在较大差异，实验结果如图1所示。
由图1可知，序号2、3、4、5、6均为包涵体表达，从表达量可以看出序号2分子和序号6分子的表达量相对较高，而序号2分子由于其N端融合了伴侣蛋白TrxA，即可帮助目的蛋白高效表达，同时也可促进二硫键的正确形成，帮助目的蛋白正确折叠，从而提高目的蛋白的稳定性。故伴侣蛋白优选伴侣蛋白TrxA（SEQ IN NO:8），连接体多肽优选SEQ IN NO:4所示多肽。
实施例2重组牛肠激酶轻链突变体
本实施例用于说明重组牛肠激酶轻链突变体的筛选，
（1）突变体EKLm1（商业化EK酶，雅心）：
鉴于野生型牛肠激酶在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化，故目前商业化EK酶是将轻链中与重链连接的第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率。突变体EKLm1的氨基酸序列见SEQ ID NO:12。
（2）突变体EKLm3：
结合序列的保守型及三维空间结构分析，在牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，预期以减少变性过程中聚集体的产生，第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，以提高复性率，在第101位氨基酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸。突变体EKLm3的氨基酸序列见SEQ ID No:13。
按照实施例1中的方法，分别构建合成表达EKLm1和EKLm3重组融合蛋白的重组表达框，重组融合蛋白为上述牛肠激酶轻链突变体的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽SEQ IDNo:2、连接体多肽SEQ ID No:4和伴侣蛋白SEQ ID No:8所得。具体的，编码突变体EKLm1的多核苷酸序列如SEQ ID No:14所示，编码突变体EKLm3的多核苷酸序列如SEQ ID No:15所示。其他构建、表达和纯化按照实施例1中进行。
对纯化的EKLm1和EKLm3进行检测，其具体的纯化并复性后的活性蛋白回收率如表5所示，可见，该突变体相较于商业化EK酶目的蛋白回收率显著提升，超过4倍的收率提升：
表5
突变体 EKLm1 EKLm3
目的蛋白收率（每克包涵体） 1% 4%
（3）活性检测
直接使用荧光底物DDDDK-肽底物测量酶活性，在含有100 μL反应缓冲液的Fluorescent 96孔板的每个孔内加入1 μL样品开始反应，混合10秒后，测量荧光（在380 nm激发并在500 nm发射），计算酶活性。相比于商业化EK酶， EKLm3其活性提高接近10%。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 丝氨酸蛋白酶肠激酶(enterokinase)
<400> 1
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 3
<211> 67
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser
1 5 10 15
Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr
20 25 30
Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly
35 40 45
Thr Gly Gly Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Gly Tyr
50 55 60
Arg Gly Ser
65
<210> 4
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe
20 25 30
Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr
35 40
<210> 5
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr
35 40 45
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
1 5 10 15
Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly
20 25
<210> 7
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys
210 215
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala
100 105
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln
1 5 10
<210> 10
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Gln Tyr Glu Asp Gly Lys Gln Tyr Thr Thr Leu Glu
20 25 30
Lys Pro Val Ala Gly Ala Pro Gln Val Leu Glu Phe Phe Ser Phe Phe
35 40 45
Cys Pro His Cys Tyr Gln Phe Glu Glu Val Leu His Ile Ser Asp Asn
50 55 60
Val Lys Lys Lys Leu Pro Glu Gly Val Lys Met Thr Lys Tyr His Val
65 70 75 80
Asn Phe Met Gly Gly Asp Leu Gly Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Ala
85 90 95
Val Ala Met Ala Leu Gly Val Glu Asp Lys Val Thr Val Pro Leu Phe
100 105 110
Glu Gly Val Gln Lys Thr Gln Thr Ile Arg Ser Ala Ser Asp Ile Arg
115 120 125
Asp Val Phe Ile Asn Ala Gly Ile Lys Gly Glu Glu Tyr Asp Ala Ala
130 135 140
Trp Asn Ser Phe Val Val Lys Ser Leu Val Ala Gln Gln Glu Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Asp Val Gln Leu Arg Gly Val Pro Ala Met Phe Val Asn Gly
165 170 175
Lys Tyr Gln Leu Asn Pro Gln Gly Met Asp Thr Ser Asn Met Asp Val
180 185 190
Phe Val Gln Gln Tyr Ala Asp Thr Val Lys Tyr Leu Ser Glu Lys Lys
195 200 205
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Phe Lys Phe Glu Phe Lys Phe Glu
1 5
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 13
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile
65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Pro Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Thr
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Lys Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 14
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcacatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgaaagtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aagcgggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179
<210> 15
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360
catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420
ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg atgacgatga taaaattgtg 480
ggcggcagcg atagccgcga aggcgcgtgg ccgtgggtgg tggcgctgta ttttgatgat 540
cagcaagtgt gcggcgcgag cctggtgagc cgcgattggc tggtgagcgc ggcgcattgc 600
gtgtatggcc gcaacatgga accgagcaaa tggaaagcgg tgctgggcct gcatatggcg 660
agcaacctga cgagcccgca gattgaaacc cgcctgattg atcagattgt gattaacccg 720
cattataaca aacgccgcaa aaacaacgat attgcgatga tgcatctgga aatgccggtg 780
aactataccg attatattca gccgattacc ctgccggaag aaaaccaagt gtttccgccg 840
ggccgcattt gcagcattgc gggctggggc gcgctgattt atcaaggcag caccgcggat 900
gtgctgcaag aagcggatgt gccgctgctg agcaacgaaa aatgtcagca acagatgccg 960
gaatataaca ttaccgaaaa catggtgtgc gcgggctatg aaaaaggcgg cgtggatagc 1020
tgccaaggcg atagcggcgg cccgctgatg tgccaagaaa acaaccgctg gctgctggcg 1080
ggcgtgacga gctttggcta tcagtgcgcg ctgccgaacc gcccgggcgt gtatgcgcgc 1140
gtgccgcgct ttaccgaatg gattcagagc tttctgcat 1179
<210> 16
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Gly Ser Thr Ser
210 215 220
Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
225 230 235 240
Gly Ser Thr Ala Ile Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu
245 250 255
Arg Gln His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Asp Asp Asp Asp Lys Ser Pro Met Gly Tyr Arg Gly Ser Asp Asp Asp
275 280 285
Asp Lys Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp
290 295 300
Val Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu
305 310 315 320
Val Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg
325 330 335
Asn Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala
340 345 350
Ser Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile
355 360 365
Val Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala
370 375 380
Met Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro
385 390 395 400
Ile Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys
405 410 415
Ser Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp
420 425 430
Val Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln
435 440 445
Gln Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly
450 455 460
Tyr Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro
465 470 475 480
Leu Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser
485 490 495
Phe Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg
500 505 510
Val Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
515 520 525

Claims (10)

1.一种包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由牛肠激酶轻链蛋白的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白而成；
其中，（1）所述肠激酶酶切位点多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
（2）所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:6所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQ ID No:8或SEQ ID No:11所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ IDNo:4所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；
或所述连接体多肽氨基酸序列如SEQ ID No:6所示，所述伴侣蛋白氨基酸序列如SEQID No:11所示。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述牛肠激酶轻链蛋白选自氨基酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13所示的牛肠激酶轻链蛋白。
4.一种用于编码权利要求1~ 3任一项所述融合蛋白的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID No:14或SEQ ID No:15所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4~5任一项所述的多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组pET-30a(+)表达载体。
8.一种重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌包含权利要求6或7所述的表达载体，所述大肠杆菌选自BL21（DE3）。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌工程菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌工程菌的构建方法至少包括以下步骤：
（1）合成如权利要求4或5所述的多核苷酸；
（2）将所述多核苷酸克隆到质粒pET-30a(+)中，构建得到表达载体；
（3）将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。
10.一种制备权利要求8所述的重组大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）合成如权利要求4或5所述的多核苷酸；
（2）将所述多核苷酸克隆到质粒pET-30a(+)，构建得到表达载体；
（3）将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述重组大肠杆菌工程菌。
CN202210697584.7A 2022-06-20 2022-06-20 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌 Active CN114807101B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210697584.7A CN114807101B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210697584.7A CN114807101B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114807101A true CN114807101A (zh) 2022-07-29
CN114807101B CN114807101B (zh) 2022-09-16

Family

ID=82520765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210697584.7A Active CN114807101B (zh) 2022-06-20 2022-06-20 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114807101B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101386847A (zh) * 2007-05-11 2009-03-18 上海张江生物技术有限公司 重组牛肠激酶、其制备方法及用途
CN103998606A (zh) * 2011-12-23 2014-08-20 诺沃—诺迪斯克有限公司 修饰的肠激酶轻链
US20150064744A1 (en) * 2011-12-23 2015-03-05 Novo Nordisk A/S Modified enterokinase light chain
WO2017118752A1 (en) * 2016-01-07 2017-07-13 Novo Nordisk A/S Modified enterokinase light chain and its preparation method
CN109136209A (zh) * 2018-07-18 2019-01-04 上海雅心生物技术有限公司 肠激酶轻链突变体及其应用
CN113502296A (zh) * 2021-09-10 2021-10-15 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高表达司美鲁肽前体重组工程菌及其构建方法
CN114621339A (zh) * 2021-12-28 2022-06-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效glp-1衍生物

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101386847A (zh) * 2007-05-11 2009-03-18 上海张江生物技术有限公司 重组牛肠激酶、其制备方法及用途
CN103998606A (zh) * 2011-12-23 2014-08-20 诺沃—诺迪斯克有限公司 修饰的肠激酶轻链
US20150064744A1 (en) * 2011-12-23 2015-03-05 Novo Nordisk A/S Modified enterokinase light chain
WO2017118752A1 (en) * 2016-01-07 2017-07-13 Novo Nordisk A/S Modified enterokinase light chain and its preparation method
CN109136209A (zh) * 2018-07-18 2019-01-04 上海雅心生物技术有限公司 肠激酶轻链突变体及其应用
CN113502296A (zh) * 2021-09-10 2021-10-15 北京惠之衡生物科技有限公司 一种高表达司美鲁肽前体重组工程菌及其构建方法
CN114621339A (zh) * 2021-12-28 2022-06-14 北京惠之衡生物科技有限公司 一种长效glp-1衍生物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐进: "分子改造提高人肠激酶复性得率、热稳定性和特异性的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 工程科技Ⅰ辑》 *
马霞等: "《生物化学》", 31 August 2020, 中国轻工业出版社 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114807101B (zh) 2022-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2513978B2 (ja) チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合
CN110128521B (zh) 用于生产重组融合蛋白的辅助蛋白、编码基因、重组融合蛋白、重组表达载体及制备方法
JP2528232B2 (ja) 組換え蛋白質を活性化する方法
CN114790474B (zh) 一种索马鲁肽的制备方法
CN108865962B (zh) 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌
KR101026526B1 (ko) 대장균에서 외래단백질을 분비 생산하는 방법
EP3027645A2 (en) Process for production of insulin and insulin analogues
CN113801240B (zh) 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性聚集体及其制备方法与应用
CN110616227A (zh) 一种来源于黄粉虫的抗冻蛋白的基因、重组表达载体、工程菌株和应用
US6664386B1 (en) System for efficient secretion of recombinant proteins
CN114807101B (zh) 包含牛肠激酶轻链蛋白的融合蛋白及其表达载体和重组工程菌
CN110835366B (zh) 促进蛋白质可溶性表达的标签多肽及其用途
US20030153049A1 (en) Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
CN109136209B (zh) 肠激酶轻链突变体及其应用
CN113249288B9 (zh) 一种表达glp-1类似物的重组菌及其应用
CN114774397B (zh) 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白
CN111172143B (zh) D-木糖酸脱水酶及其应用
CN110540601B (zh) 重组PLB-hEGF融合蛋白及其应用
US20090239262A1 (en) Affinity Polypeptide for Purification of Recombinant Proteins
US20090035815A1 (en) Synthetic Gene for Enhanced Expression in E. Coli
CN114774398B (zh) 一种重组ek酶工程菌的高密度发酵方法
CN114807205B (zh) 表达利拉鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法和应用
CN106749605B (zh) 一种人神经生长因子类似物及其制备方法
US7354994B2 (en) Recombinant IGF expression systems
CN114381471A (zh) 一种辅助蛋白在重组蛋白生产中的应用及融合表达系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 100025 1703, 14th floor, No.97 Sili, Balizhuang, Chaoyang District, Beijing

Patentee after: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: Jilin Huisheng Biopharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 100025 1703, 14th floor, No.97 Sili, Balizhuang, Chaoyang District, Beijing

Patentee before: Beijing huizhiheng Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee before: Jilin Huisheng biopharmaceutical Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder