CN114796247A

CN114796247A - 亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用

Info

Publication number: CN114796247A
Application number: CN202210569634.3A
Authority: CN
Inventors: 赵文昌; 宋丽军
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2022-05-24
Filing date: 2022-05-24
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2042-05-24
Also published as: CN114796247B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。通过实验证实，亚麻木酚素能够抑制轮状病毒感染，在亚麻木酚素药物浓度为0.5‑4μmol/L时，亚麻木酚素具有明显抗RV生物合成作用，且在亚麻木酚素药物浓度大于5μmol/L时产生轻微的细胞毒性。因此，本发明提出了以亚麻木酚素为主要活性成分，有望研制出安全有效的特异性抗轮状病毒药物，并对抗轮状病毒药物研究提供了指导价值。

Description

亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。

背景技术

轮状病毒(Rotavirus，RV)是导致婴幼儿急性腹泻的主要病原体，每年约有52.5万名婴幼儿因RV感染死亡，目前尚无防治RV感染的特效药物。而有关RV疫苗方面，国内尚处于研究阶段，国外上市RV疫苗价格昂贵，RV毒株的多样性使其预防范围有限。现临床多采用WHO推荐的口服补液以缓解症状。因此，加强对轮状病毒感染机制的研究，开发安全有效的药物防治轮状病毒感染具有非常重要的意义。

亚麻木酚素，又称开环异落叶松酚二葡萄糖苷，其结构式如图1所示，来源于亚麻科植物亚麻(Linum usitatissimum L.)的种子，具有降血脂、抗氧化、抗癌、抗炎以及抗动脉粥样硬化等多种生理功能。其中，亚麻木酚素的抗氧化特性还有助于调节胆固醇和葡萄糖代谢，抑制血栓形成，降低糖尿病的发病风险。此外，亚麻木酚素能够降低局部炎症，通过抑制NF-κB信号传导抑制乳腺肿瘤的生长。然而，目前有关亚麻木酚素对RV是否有作用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足提出了亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。

优选的，所述抗轮状病毒药物为抗轮状病毒感染或预防重症致死性轮状病毒感染药物。

优选的，在所述抗轮状病毒药物中，所述亚麻木酚素的抗轮状病毒的摩尔浓度为0.5～4μmol/L。

优选的，在所述抗轮状病毒药物中，所述亚麻木酚素对细胞产生毒性的摩尔浓度为大于5umol/L。

一种抗轮状病毒药物，所述抗轮状病毒药物的有效成分包括亚麻木酚素。

优选的，所述抗轮状病毒药物为亚麻木酚素的单方或复方制剂。

优选的，所述抗轮状病毒药物的制剂形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射液、半固体制剂、纳米、微乳或脂质体的制剂中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用，揭示了亚麻木酚素能够应用于制备抗轮状病毒药物，该应用能够为开发安全有效的药物以防治轮状病毒感染具有重要价值和意义。

(2)本发明使用MA104细胞感染Wa株轮状病毒模型评价亚麻木酚素对轮状病毒感染的作用，结果显示亚麻木酚素有明显抗RV生物合成作用，当亚麻木酚素的摩尔浓度为2μmol/L时，轮状病毒抑制率能够达到104.85％。本发明结果显示亚麻木酚素的抗轮状病毒的摩尔浓度为0.5-4μmol/L，即在一定药物浓度下，亚麻木酚素能够防治轮状病毒感染，其主要通过抑制RV生物合成而发挥其抗轮状病毒作用；同时，亚麻木酚素对细胞产生毒性的摩尔浓度为大于5μmol/L。因此，本发明提出了以亚麻木酚素为主要活性成分，有望研制出安全有效的特异性抗轮状病毒药物，为防治轮状病毒感染药物临床应用提供了指导价值。

附图说明

图1是亚麻木酚素的结构式。

图2是亚麻木酚素对MA104的细胞毒性作用(n＝3)实验结果图。

图3是亚麻木酚素抗RV吸附作用(n＝3，﹡﹡﹡﹡与利巴韦林阳性药物组相比P＜0.0001)实验结果图。

图4是亚麻木酚素对RV的直接灭活作用(n＝3,﹡﹡﹡与利巴韦林阳性药物组相比P＜0.001)实验结果图。

图5亚麻木酚素抗RV生物合成作用(n＝3)实验结果图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

实施例1

亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。

为了使本发明的目的、技术方案和技术效果更加清楚，本发明提供如下实验步骤和实验结果说明：

一、实验材料

1.实验药品：

亚麻木酚素(北京索莱宝科技有限公司，纯度98％，批号：909D022)。

2.实验试剂：

高糖DMEM培养液、胎牛血清(美国GIBCO公司)；

青霉素-链霉素混合溶液、胰蛋白酶、1×PBS磷酸盐缓冲液、二甲基亚砜(Solarbio公司)；MTT(4,5,二甲基噻唑-2,5,二苯基四唑溴化物)(M1124Amresco公司)。

3.试剂的配制和分装：

S1、配制：

(1)含10％胎牛血清的DMEM培养液：超净工作台内将胎牛血清50ml、青霉素双抗5ml加入到450ml的高糖DMEM培养液之中，混匀后封口膜封口，4℃保存；

(2)RV维持液：向不含FBS的DMEM中加入不含EDTA 0.25％胰蛋白酶消化液，使得维持液的浓度为1μg/mL；

(3)MTT的配备:MTT粉末50mg溶于10mlPBS,超声溶解，0.22μm滤膜滤过除菌，分装并放-20℃避光保存；

(4)利巴韦林液配制：无血清的DMEM稀释到1mg/ml作为阳性对照组(现配现用)。

S2、分装：

(1)胎牛血清分装在灭菌的50ml离心管中，-20℃保存；

(2)胰蛋白酶分装在灭菌的15ml离心管中，-20℃保存；

(3)霉素-链霉素混合溶液分装在灭菌的15ml离心管中，-20℃保存。

4.实验器材:

CO₂恒温培养箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱(Thermo Scientific公司)；

普通光学显微镜(苏州安泰空气技术公司SW-CJ-2F型)；

多功能酶标仪(Gene Company Linited公司)；

高压蒸汽灭菌锅(上海博讯有限公司医疗设备厂)；

低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；

96孔细胞培养板、微量移液器、细胞培养瓶、滤器、吸管；

细胞与病毒：MA104(恒河猴胚胎肾细胞)，Wa株轮状病毒。

二、实验方法

1.MA104细胞在含10％胎牛血清，100μ/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养液中培养和传代，感染病毒为适应细胞培养增殖的人Wa株轮状病毒。

2.药物的细胞毒性试验：

(1)亚麻木酚素溶液配制：

称取亚麻木酚素样品4mg，先用DMSO(二甲基亚砜)溶解后加入用适量DMEM溶解，以DMSO终浓度不超过0.5％为标准，并设置溶剂对照组。洁净台内无菌操作用一次性滤头过滤除菌,计算初浓度。各种药物终浓度0.5μmol/L～4μmol/L。

(2)细胞毒性实验：

将MA104细胞以8×10³个/ml的细胞密度，加入在96孔细胞培养板上，每孔100μl。37℃、5％CO₂孵育至细胞生长成单层。吸出培养液，先按照1:1、1:10、1:100、1:1000的比例用不含血清的DMEM培养液进行稀释得到一系列浓度的药液，然后100μl/孔加入到96孔板内，每个浓度重复6孔。正常对照只加入等体积不含血清的DMEM培养液。37℃、5％CO₂孵育，光学显微镜连续观察，48小时之内若药物的第一、第二浓度之间有细胞毒性变化之外的其余三个药物浓度的细胞均正常。这表明有效浓度在1:1与1:100之间。按照1:1，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64的比例得到一系列浓度药液，重复上述操作。

37℃、5％CO₂孵育，光学显微镜连续观察48h后，避光，加入5mg/ml的MTT，10μl/孔，37℃、5％CO₂孵育4h后，弃上清，加入DMSO，100μl/孔，室温下震荡约10min，待结晶溶解后，混匀，在酶标仪上检测490nm波长下每孔的光密度(optical density，OD)值。

按下列公式求出细胞存活率：

细胞存活率％＝药物组平均吸光度值/细胞对照组平均吸光度值×100％。

3.病毒增值和滴度测定：

Wa株RV的增殖和滴度测定在MA104细胞上进行。当细胞在培养瓶中生长至单层时接种RV。接种前，将原始病毒液从-80℃冰箱中取出，4℃溶解，37℃与10μg/ml的胰酶作用30min。将长成单层的MA104细胞先用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7)清洗一次，再用无血清DMEM培养液润洗两次。

随后加入与胰酶孵育后的病毒液，再往细胞中加入病毒维持液。接种病毒后的细胞放37℃、5％CO₂的培养箱中孵育，至病毒感染MA104细胞病变(CPE cytopathic effect)达到+++时，将培养瓶放入-20℃冻存，次日再4℃融解，如此反复冻融三次，低温高速12000r/min离心取上清收获病毒液于新的EP管内，标记后-80℃冰箱内保存。

RV的滴度测定在MA104细胞上进行。对长成单层状态良好的MA104细胞进行常规的胰酶消化，显微镜下计数后将细胞悬液接种于96孔培养板中(微量滴定法)。在用不含血清的DMEM培养液将其按照1:10稀释成10^-1、10^-2、10^-3……10^-6等系列浓度，将培养成单层MA104细胞的96孔板用PBS冲洗一次，再将不同稀释度的病毒加入到96孔细胞培养板中，100μl/孔，每个浓度重复8孔。设置正常对照细胞，37℃、5％CO₂孵育2h后吸出病毒液，加入不含血清的细胞培养液，100μl/孔。37℃、5％CO₂孵育，连续观察。当能够出现细胞病变CPE的最低稀释度的病毒孔中不再继续出现CPE时，计数每个稀释度出现CPE的细胞孔数，同时往细胞内加入10μl的MTT溶液后在37℃、5％CO₂的培养箱放置4h,吸出混合液，每孔加入100μlDMSO，在490nm波长的酶标免疫检测仪上，测定各孔光吸收值(OD值)，最后按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID₅₀(Tissue culture infective dose)。

4.药物抗RV作用：

在实验中首先选择使细胞存活率达到95％以上的药物浓度进行抗RV实验，然后将筛选出的有抗RV作用的药物，用DMEM培养液(不含血清)进行稀释，考察不同浓度抗RV作用。

5.药物抗RV吸附作用：

在生长成单层的MA104细胞的96孔培养板内加入药液，每个药液重复6孔，100μl/孔。设置正常细胞对照组，病毒对照组均只加入等体积DMEM培养液(不含血清)。37℃、5％CO₂孵育2h。将药液吸出，除正常对照组以外加入100TCID₅₀的病毒(病毒与10μg/ml浓度的胰酶37℃作用30min)，100μl/孔，37℃、5％CO₂孵育2h，将病毒液吸出，加入细胞维持液100μl/孔，37℃、5％CO₂孵育连续观察。待细胞出现CPE在++-+++间时加入5mg/ml的MTT 10μl/孔，孵育4h后弃上清。加入DMSO 150μl/孔，室温下震荡混匀约10min。随后490nm下酶联免疫检测仪读取吸光度值。按照下列公式计算药物对病毒抑制率：

病毒抑制率＝(药物组平均吸光度值—病毒对照组平均吸光度值)/(正常细胞对照组平均吸光度值—病毒对照组平均吸光度值)×100％，重复实验三次。

注：在光学显微镜下观察，无CPE，记作：—；25％的细胞出现CPE，记作：+；25％-50％的细胞出现CPE，记作：++；50％-75％的细胞出现CPE，记作：+++；75％-100％的细胞出现CPE，记作：++++。

6.药物对RV的直接灭活作用：

将药物与100TCID₅₀的病毒液(病毒与10μg/ml浓度的胰酶作用30min)等体积混合作用2h。将其加入到生长成单层MA104细胞的96孔培养板内，之前用PBS将细胞冲洗一次。设置正常细胞对照组，病毒对照组均只加入等体积DMEM。37℃、5％CO₂孵育2h，然后将混合液吸出，加入细胞维持液100μl/孔，37℃、5％CO₂孵育连续观察，待细胞出现CPE在++—+++间时同上法做MTT检测，并计算药物对病毒的抑制率。

7.药物抗RV生物合成的作用：

将100TCID₅₀的病毒液(病毒与10μg/ml浓度的胰酶作用30min)加入到生长成单层的MA104细胞96孔培养板内100μl/孔，之前用PBS将细胞冲洗一次。设细胞正常对照，加入等体积DMEM培养液。37℃、5％CO₂孵育2h，然后将病毒液吸出，加入药液100μl/孔，设病毒对照，只加入等体积细胞维持液，100μl/孔，37℃、5％CO₂孵育连续观察。细胞CPE在++—+++间时按照上法做MTT检测，并计算药物对病毒的抑制率。

8.统计分析：

所有数据采用SPSS13.0软件，选择One-Way ANOVA法，将用药组OD值与模型组OD值进行均数比较。选择PROBIT回归法，将药物浓度与细胞存活率，药物浓度与药物对病毒的抑制率进行回归分析。得到药物的细胞半数存活浓度CC50，药物对病毒感染细胞半数的抑制浓度IC50，并按照治疗指数TI＝细胞半数存活药物浓度/抑制半数病毒药物浓度，计算治疗指数。

三、实验结果

1.亚麻木酚素细胞毒性：

亚麻木酚素对MA104的细胞毒性作用(n＝3)如图2所示，图2中横坐标为亚麻木酚素的浓度(μmol/L)，纵坐标为细胞存活率(％)。结果表明，亚麻木酚素在浓度小于4μmol/L时对细胞无毒性作用，细胞的存活率为95％以上。当浓度大于5umol/L出现轻微的细胞毒性。

2.亚麻木酚素体外抗RV作用

2.1亚麻木酚素抗RV吸附作用：

亚麻木酚素抗RV吸附作用(n＝3，﹡﹡﹡﹡与利巴韦林阳性药物组相比P＜0.0001)如图3所示，图3中横坐标为亚麻木酚素的浓度(μmol/L)，纵坐标为病毒抑制率(％)。结果表明，亚麻木酚素在0.5～4μmol/L时，各药物浓度组抑制率与利巴韦林阳性药物组相比，统计学有显著性差异(P＜0.0001)，且抑制率较低，表明亚麻木酚素无抗RV吸附作用。

2.2亚麻木酚素对RV的直接灭活作用：

亚麻木酚素对RV的直接灭活作用(n＝3,﹡﹡﹡与利巴韦林阳性药物组相比P＜0.001)如图4所示，图4中横坐标为亚麻木酚素的浓度(μmol/L)，纵坐标为病毒抑制率(％)。结果表明，亚麻木酚素浓度为2μmol/L时，病毒抑制率最高，为37.68％，但与利巴韦林组相比，有显著性统计学差异(P＜0.001)，表明亚麻木酚素无直接灭活RV作用。

2.3亚麻木酚素抗RV生物合成作用：

亚麻木酚素抗RV生物合成作用(n＝3)如图5所示，图5中横坐标为亚麻木酚素的浓度(μmol/L)，纵坐标为病毒抑制率(％)。结果表明，亚麻木酚素各药物组抑制率与利巴韦林组相比，无明显差异(P＞0.05)，当药物浓度为2μmol/L时，其病毒抑制率达到最大值104.85％，表明亚麻木酚素有明显抗RV生物合成作用。

由上述结构可以判定，亚麻木酚素能够抑制轮状病毒感染MA104细胞，亚麻木酚素具有明显的抗轮状病毒生物合成作用，同时亚麻木酚素在摩尔浓度大于5umol/L时产生轻微的细胞毒性。上述结果表明，亚麻木酚素能够作为活性成分，单独应用或与其它活性组分组成复方，采用药学上可接受的辅料和制剂常规方法，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射液、半固体制剂、纳米、微乳或脂质体的制剂等各种剂型的预防重症致死性轮状病毒药物，供临床使用。

上述的具体实施例是对本发明技术方案和有益效果的进一步说明，并非对实施方式的限定。对本领域技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用。

2.根据权利要求1所述的亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用，其特征在于：所述抗轮状病毒药物为抗轮状病毒感染或预防重症致死性轮状病毒感染药物。

3.根据权利要求1所述的亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用，其特征在于：在所述抗轮状病毒药物中，所述亚麻木酚素的抗轮状病毒的摩尔浓度为0.5～4μmol/L。

4.根据权利要求1所述的亚麻木酚素在制备抗轮状病毒药物的应用，其特征在于：在所述抗轮状病毒药物中，所述亚麻木酚素对细胞产生毒性的摩尔浓度为大于5umol/L。

5.一种抗轮状病毒药物，其特征在于：所述抗轮状病毒药物的有效成分包括亚麻木酚素。

6.根据权利要求5所述的抗轮状病毒药物，其特征在于：所述抗轮状病毒药物为亚麻木酚素的单方或复方制剂。

7.根据权利要求5所述的抗轮状病毒药物，其特征在于：所述抗轮状病毒药物的制剂形式选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、注射液、半固体制剂、纳米、微乳或脂质体的制剂中的任意一种。