CN114796122B - 一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明设计了一种基于聚多巴胺的药物输送系统，将吡非尼酮注入膀胱组织。基于聚多巴胺的药物输送系统促进了吡非尼酮在膀胱组织中的吸附、渗透和滞留。利用大鼠和小鼠脊髓损伤模型，本发明证明了基于聚多巴胺的药物传递系统携带吡非尼酮(PFD@PDA NPs)能明显改善脊髓损伤后膀胱功能，减轻膀胱炎症。PFD@PDA NPs系统有望成为SCI引发的膀胱功能障碍的安全有效的膀胱内治疗方法，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
脊髓损伤(SCI)是一种破坏性的健康损伤状况，每年有多达77 万新的临床病例。大多数SCI患者都伴有永久性残疾，其中尿功能障碍是导致死亡和生活质量下降的主要原因之一。除了尿潴留和膀胱逼尿肌过度活动外，SCI还可能导致严重的膀胱病变，与炎症、纤维化和尿路感染增加有关。慢性肾功能衰竭是SCI患者死亡的主要原因之一。目前SCI的临床治疗策略侧重于初始稳定和早期干预，膀胱功能障碍的治疗选择有限。
SCI患者肾积水和肾功能衰竭的最初原因是膀胱重构，膀胱重构通常由肌肉失神经支配、尿潴留和慢性炎症引起。目前，SCI引起的膀胱功能障碍只有对症治疗选择。抗霉素药物、β-3肾上腺素能激动剂、肉毒杆菌毒素A和神经调节疗法已用于治疗膀胱逼尿肌过度活动。建议对膀胱排空不全或尿潴留的SCI患者进行清洁型间歇导尿。尽管对SCI患者进行了上述这些治疗，一些患者仍然伴有膀胱尿路顺应性低和慢性膀胱炎症等，并最终导致肾功能损伤。因此，迫切需要新的治疗方法来预防SCI后膀胱重构。
用于治疗膀胱疾病的全身性治疗剂不能有效的到达膀胱组织。膀胱内治疗为膀胱疾病的治疗提供了更有价值的选择。膀胱内治疗通过将治疗剂直接暴露于膀胱组织而不经历体内循环，可以最大限度地提高治疗效果并最小化其全身副作用。膀胱内治疗先前已证明在延缓和预防膀胱癌复发方面是有效的。值得注意的是，SCI患者非常适合接受膀胱内治疗，因为他们通常需要间歇性导尿或留置导尿管以排空膀胱，导尿的同时非常方便给予膀胱内给药。然而，由于膀胱壁的独特结构和周期性排尿的冲刷效应，将治疗剂注入膀胱组织并使其有效驻留却并不容易。迄今为止，关于SCI后膀胱功能恢复的研究报道非常有限且有关SCI后膀胱功能障碍的膀胱内治疗尚未见报道。
吡非尼酮(PFD)是一种小分子免疫抑制剂，广泛用于治疗轻中度特发性肺纤维化。吡非尼酮通过调节炎症和细胞外基质结构相关基因的表达，发挥其对肺纤维化的大部分作用。大量研究表明，吡非尼酮具有良好的抗炎和抗纤维化作用，是治疗SCI后慢性膀胱炎症和膀胱重塑的理想选择。然而，吡非尼酮的半衰期很短，给药后会很快被消除，再加上膀胱壁的独特结构和周期性排尿的冲刷效应，使其难以有效扩散到膀胱组织内部。我们的初步实验也证明口服吡非尼酮对膀胱功能障碍的影响有限。因此，探索和开发一种能够使吡非尼酮在膀胱组织局部有效驻留并发挥作用的给药系统对于治疗膀胱炎症和膀胱重塑尤为重要。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒及其制备方法和应用。本发明设计了一种基于聚多巴胺的药物输送系统，将吡非尼酮有效输送至膀胱组织。基于聚多巴胺的药物输送系统促进了吡非尼酮在膀胱组织中的吸附、渗透和滞留。此外，由于脊髓损伤后膀胱内存在慢性炎症，因此给药系统本身应更好地发挥抗炎作用，而聚多巴胺纳米粒的优异性能正好符合这一需求，利用大鼠和小鼠脊髓损伤模型，本发明证明了基于聚多巴胺的药物传递系统携带吡非尼酮(PFD@PDA NPs)能明显改善SCI后膀胱功能障碍，减轻膀胱炎症。PFD@PDA NPs系统有望成为SCI后膀胱功能障碍的安全有效的膀胱内治疗方法，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒，所述纳米粒为聚多巴胺纳米粒，所述聚多巴胺纳米粒负载有吡非尼酮。
其中，所述聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒为球形纳米粒，其平均直径为300～400nm，优选为348.67nm，其zeta电位为15～20mV，优选为16.30mV。
所述纳米粒载药量不小于20％，进一步不小于25％，如26.49％。
本发明的第二个方面，提供上述聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：向盐酸多巴胺溶液中加入吡非尼酮溶液，然后向其中加入碱性溶液，搅拌后即得。
其中，所述盐酸多巴胺与吡非尼酮的质量比为0.1～10:1，进一步优选为0.5～2:1，如0.5:1、1:1和2:1；最优选为1:1，此时纳米粒的包封率、载药量以及药物释放率最佳。
本发明的第三个方面，提供上述纳米粒在制备预防和/或治疗膀胱相关疾病药物中的应用。
其中，所述膀胱相关疾病包括但不限于膀胱功能障碍和膀胱炎症，其可以是由脊髓损伤(SCI)引起的膀胱功能障碍和膀胱炎症。
更具体的，所述预防和/或治疗膀胱相关疾病具体表现为：
(a)改善膀胱功能；
(b)抑制炎症；
(c)预防膀胱重塑。
经试验证明，上述纳米粒可以显著改善小鼠SCI模型的尿动力基线压力、排尿间隔和残余尿量，此外还能抑制炎症介质(IL-1β、IL-6、 TNF-α)的表达和促炎巨噬细胞的比例。抑制膀胱尿路上皮增生水平，增加IL-4的表达和抗炎巨噬细胞比例，且无全身副作用。
本发明的第四个方面，提供一种预防和/或治疗膀胱相关疾病的药物，所述药物其活性成分包含上述纳米粒。
所述药物可以为注射剂，具体可以为膀胱灌注的注射剂剂型。更优选的，由于频繁向膀胱内注射治疗药物对患者来说并不方便，也可能引起感染和炎症反应。因此本发明的纳米粒或药物可以在采用清洁间歇导管插入术后同时进行膀胱内灌注给药治疗。
本发明的第五个方面，提供一种治疗膀胱相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米粒或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒，其能够有效缓解膀胱功能障碍和重塑。膀胱灌注后，纳米粒系统能有效穿透膀胱壁，在膀胱组织中保存至少2天。两周内，纳米粒显著改善小鼠SCI 模型的尿动力基线压力、排尿间隔和残余尿量。此外纳米粒抑制炎症介质(IL-1β、IL-6、TNF-α)的表达和促炎巨噬细胞的比例，抑制膀胱尿路上皮增生水平，增加IL-4的表达和抗炎巨噬细胞比例。这些结果为研究人员探索功能化纳米粒在改善膀胱功能、抑制炎症和预防膀胱重塑方面的作用提供了有力证据。上述技术方案的实验结果清楚地证明了膀胱内给药的可行性。上述纳米粒是一种强有力的治疗方法，可减少膀胱炎症，改善膀胱功能，且无任何副作用。
综上，本发明将为开发膀胱内给药平台治疗膀胱功能障碍提供有价值的见解，具有良好的潜在实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中PFD@PDA纳米粒的合成与表征。(A) PFD@PDA NPs系统的合成结构示意图。(B)PFD@PDA纳米粒的释放曲线(pH 7.4 PBS缓冲溶液中)。(C)不同比例PFD比PDA 的PFD@PDA纳米粒Zeta表面电位。(D)PFD@PDA纳米粒粒径分布及其TEM图像，比例尺均为500nm；
图2为本发明实施例中PFD@PDA纳米粒中PFD的含量测定。 (A)高效液相色谱法(HPLC)测定DA、PFD和PFD@PDA NPs 中PFD的特征吸收峰。(B)用HPLC法计算不同浓度PFD对应的吸收峰面积标准曲线。(C)不同比例PFD比PDA的PFD@PDA纳米粒的包封率(EE％)和载药率(DL％)；
图3为本发明实施例中PDA纳米粒的膀胱渗透性。游离荧光素 (FITC)和载荧光素的聚多巴胺纳米粒(FITC@PDA NPs)膀胱灌注给药后24h和48h膀胱组织冷冻切片的共聚焦图像，比例尺均为500 nm；
图4为本发明实施例中游离FITC、PDA和FITC@PDA NPs的细胞摄取行为。使用三种不同浓度的游离FITC、PDA和FITC@PDA NPs (1.0μg/mL、2.5μg/mL和5.0μg/mL)来评估FITC@PDA NPs的剂量依赖性细胞摄取行为。使用Flow Jo软件包处理数据；
图5为本发明实施例中膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒两周后，可有效缓解SCI引起的膀胱功能障碍。(A)SCI后14天，在正常、假手术和SCI大鼠膀胱内持续滴注开放出口的生理盐水，记录其代表性膀胱功能收缩曲线。(B)SCI后膀胱内尿动力基线压力升高(P<0.01)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒系统14天后，可显著降低SCI后膀胱内尿动力基线压力(P<0.001)。(C)SCI后膀胱内最大压力增加 (P<0.05)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后对SCI后膀胱内最大压力无影响。(D)SCI损伤模型动物膀胱收缩间期增加(P<0.01)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后，可显著缩短了膀胱收缩间期 (P<0.01)。(E)SCI损伤模型动物膀胱两次收缩之间的输注量增加 (P<0.01)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后，可显著减少输注量(P<0.01)。(F)SCI损伤模型动物膀胱残余体积增加(P<0.01)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后，可显著减少残余体积 (P<0.01)。(G)SCI损伤模型动物膀胱重量/体重比增加(P<0.01)，膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后，可显著降低膀胱重量/体重比 (P<0.05)；
图6为本发明实施例中膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒14天后， SCI引起的膀胱病理改变和炎症水平。(A)不同处理组膀胱切片的代表性Masson三色染色和HE染色。(B)不同处理组膀胱胶原(蓝色染色)定量分析。(C)不同处理组膀胱逼尿肌厚度(mm)及(D) 炎症评分；
图7为本发明实施例中膀胱内灌注PFD@PDA纳米粒可减轻SCI 后膀胱组织中巨噬细胞的积聚。(A-D)大鼠膀胱中IL-1β、IL-4、IL-6 和TNF-α的mRNA表达。(E)膀胱切片中CD68的免疫组化分析。 (F)小鼠膀胱中促炎性巨噬细胞和抗炎性巨噬细胞的代表性绘图和定量分析。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如前所述，关于脊髓损伤后膀胱功能恢复的研究报道有限。脊髓损伤后膀胱功能障碍的膀胱内治疗尚未见报道。
有鉴于此，本发明设计了一种基于聚多巴胺的药物输送系统，将吡非尼酮注入膀胱组织。基于聚多巴胺的药物输送系统促进了吡非尼酮在膀胱组织中的吸附、渗透和滞留。此外，由于脊髓损伤后膀胱内存在慢性炎症，因此给药系统本身应更好地发挥抗炎作用。本发明证明了基于聚多巴胺的药物传递系统携带吡非尼酮(PFD@PDA NPs)能明显改善脊髓损伤后膀胱功能，减轻膀胱炎症。PFD@PDA NPs系统有望成为SCI后膀胱功能障碍的安全有效的膀胱内治疗方法。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒，所述纳米粒为聚多巴胺纳米粒，所述聚多巴胺纳米粒负载有吡非尼酮。
其中，所述聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒为球形纳米粒，其平均直径为300～400nm，优选为348.67nm，其zeta电位为15～20mV，优选为16.30mV。
所述纳米粒载药量不小于20％，进一步不小于25％，如26.49％。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：向盐酸多巴胺溶液中加入吡非尼酮溶液，然后向其中加入碱性溶液，搅拌后即得。
其中，所述盐酸多巴胺与吡非尼酮的质量比为0.1～10:1，进一步优选为0.5～2:1，如0.5:1、1:1和2:1；最优选为1:1，此时纳米粒的包封率、载药量以及药物释放率最佳。
所述盐酸多巴胺溶液为盐酸多巴胺的水溶液；所述盐酸多巴胺溶液浓度可以为0.01～0.1g/mL，优选为0.03g/mL。
因吡非尼酮不溶于水，因此所述吡非尼酮溶液为吡非尼酮的有机溶液；使用的有机溶剂具体可以为二甲基亚砜，所述吡非尼酮溶液浓度可以为0.1～1g/mL，优选为0.33g/mL。
所述碱性溶液可以为NaOH溶液；
所述搅拌可以是在室温条件下进行，具体搅拌条件可以为在500～800rpm下处理10～20h，优选为600rpm处理12h。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述纳米粒在制备预防和/ 或治疗膀胱相关疾病药物中的应用。
其中，所述膀胱相关疾病包括但不限于膀胱功能障碍和膀胱炎症，其可以是由脊髓损伤(SCI)引起的膀胱功能障碍和膀胱炎症。
更具体的，所述预防和/或治疗膀胱相关疾病具体表现为：
(a)改善膀胱功能；
(b)抑制炎症；
(c)预防膀胱重塑。
经试验证明，上述纳米粒可以显著改善小鼠SCI模型的尿动力基线压力、排尿间隔和残余尿量，此外还能抑制炎症介质(IL-1β、IL-6、 TNF-α)的表达和促炎巨噬细胞的比例。抑制膀胱尿路上皮增生水平，增加IL-4的表达和抗炎巨噬细胞比例，且无全身副作用。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种预防和/或治疗膀胱相关疾病的药物，所述药物其活性成分包含上述纳米粒。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还可以包括至少一种药物非活性成分。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织 (如膀胱)中。优选直接采用膀胱灌注(或滴注)的方式给药，从而最大程度的提高药物利用率。同时，由于频繁向膀胱内注射治疗药物对患者来说并不方便，也可能引起感染和炎症反应。因此本发明的纳米粒或药物可以在采用清洁间歇导管插入术后进行膀胱内治疗，即可以采用膀胱内间歇导尿管导尿后以灌注方式注入上述药物。
本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗膀胱相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米粒或药物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的膀胱相关疾病、综合征、病症或障碍的症状。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1、材料和方法
1.1动物与实验设计
雌性Sprague-dawley大鼠(6-8周)和C57BL小鼠(6-8周)购自中国济南山东大学动物实验中心。在24℃和60％湿度条件下，在 12小时的明暗循环条件下喂养动物。收养1周后，将大鼠随机分为5 组：第一组：假手术组；第2组：SCI和PBS大鼠膀胱灌注(0.4ml/ 天)；第3组：SCI和PDA膀胱灌注(0.4ml/天)；第4组：SCI和口服吡非尼酮400mg/kg体重；第5组：脊髓损伤和脊髓损伤PFD@PDA NPs膀胱内滴注(0.4毫升/天)。治疗14天后，麻醉大鼠进行尿动力学测试、组织病理学、RT-qPCR和western印迹。将小鼠随机分为三组：第一组：假手术组；第2组：SCI和PBS膀胱灌注(0.1mL/天)；第3组：脊髓损伤和脊髓损伤PFD@PDA NPs膀胱内滴注(0.1毫升/ 天)。14天后，麻醉三组小鼠，收集膀胱进行流式细胞术。
1.2脊髓损伤的外科治疗
大鼠和小鼠用异氟醚麻醉，麻醉后固定在手术台上。在T10背部取正切口，分离皮下组织、肌肉和暴露的T10(第8胸椎)节段脊柱，分离T8～T10节段的两侧脊椎动物，在T10处用剪刀切断脊髓，并在脊髓断端之间放置无菌海绵。用生理盐水冲洗切口，封闭切口层，局部涂抹瑞霉素软膏以防止感染。术后每天至少两次人工排空膀胱。假手术大鼠暴露T10脊髓，但不切断脊髓。
1.3 PFD@PDA的制备与表征
PFD@PDA纳米粒通过改进的
Figure BDA0003572704910000121
方法制备：在室温搅拌条件下，将1.2g盐酸多巴胺(DA·HCl)溶解在40mL水中。将1.2g吡非尼酮(PFD)溶解于3.6mL二甲基亚砜(DMSO)中，然后与DA·HCl 溶液混合。随后，将180μL 3M氢氧化钠(NaOH)逐滴滴加到上述混合溶液中，室温继续搅拌(600rpm)12h完成纳米颗粒的自聚合反应。获得的PFD@PDA纳米粒通过Zetasizers进行表征，以确定其粒径和表面电位。选择不同比例的DA·HCl与PFD(0.5:1、1:1和2:1) 进行考察表征以选择合适的比例。采用高效液相色谱法(HPLC)测定包封率(EE％)、载药量(DL％)和药物释放率(37℃的PBS缓冲液，pH 7.4)。在没有PFD的情况下，使用同样的方法制备PDA NPs。荧光标记的PDA纳米粒采用相同方法制备，药物被异硫氰酸荧光素 (FITC)代替得FITC@PDA纳米粒。
1.4膀胱灌注
用于膀胱内灌注硬膜外导管和24G静脉留置针经雌性大鼠或小鼠尿道插入膀胱，膀胱内分别给予PBS、PDA NPs或PFD@PDA NPs。
1.5冻结段
用异氟醚麻醉大鼠，膀胱内分别注射FITC或FITC@PDA NPs (0.4mL)，24h和48h后，用PBS冲洗膀胱，收集并包埋于OCT中，准备冰冻切片。染料的荧光分布FITC@PDA通过共聚焦显微镜记录这些切片中的NPs。
1.6 PDA NPs和PFD@PDA NPs的细胞毒性试验
5637细胞在RPMI-1640并含有10％FBS和1％青霉素/链霉素的完整培养基中培养(37℃和5％CO2)。PDA NPs和PFD@PDA NPs 的细胞毒性试验通过标准细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定。
1.7尿动力学检测
大鼠用异氟醚麻醉，腹部切开暴露膀胱，使用针刺穿膀胱穹顶，将导管(PE-50)(美国SCI)插入膀胱。导管的另一端从皮下穿入背部穿出，缝合腹壁。两天后，膀胱导管连接到压力传感器(澳大利亚 ADINInstruments)和微量注射泵(美国肯特科学公司)，将室温生理盐水缓慢注入膀胱(0.06mL/min)，当排尿周期趋于稳定时，收集40 分钟内连续稳定排尿周期数据。膀胱内压由PowerLab系统(澳大利亚AD仪器公司)记录，记录尿动力学参数，包括膀胱内压的排尿幅度、两次连续排尿事件之间的间隔以及两次连续排尿事件之间的盐水输注量。对40分钟内的参数值取平均值，以确定每只大鼠统计分析的平均值。实验结束时处死动物，处死后，我们测量残余体积和膀胱重量/体重比。
1.8组织病理学
膀胱在甲醛中固定72小时，石蜡包埋，5μm切片。膀胱样本用苏木精和曙红染色。对于免疫组学，切片在4℃下与一级抗体(CD68 或iNOS)孵育过夜；然后与二级抗体孵育并进行二氨基联苯胺 (PDAB)染色。HE染色观察膀胱炎症；masson三色染色法检测胶原沉积，IHC检测巨噬细胞浸润。使用imageJ软件处理流式细胞分析数据并定量组织胶原和巨噬细胞浸润。膀胱炎症程度采用4级量表进行分类：0级与正常对照组相对应；1级为单纯性尿路上皮增生；2 级包括尿路上皮增生、逼尿肌肥大和一些实质性炎症细胞；3级为明显的尿路上皮增生、粘膜下层水肿、大量实质性炎性细胞伴逼尿肌明显肥大；4级包括广泛和严重的尿路上皮增生、粘膜下层水肿和逼尿肌肥大。
1.9 RT-qPCR
TRIZOL法提取膀胱组织总RNA。使用SYBR GREEN I检测系统进行qPCR检测，并构建用于PCR的反应系统。GAPDH被用作管家基因。对所有样品进行了一式两份的分析。采用2-△△Ct方法计算褶皱变化。
1.10蛋白印迹
通过放射免疫沉淀法提取膀胱组织中的蛋白质，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离，分离完成后将膜转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后，在4℃条件下，将膜与一级抗体(包括胶原蛋白2、弹性蛋白、MMP-12和GAPDH)孵育过夜。然后，将膜与二级抗体在室温下孵育1h，并用化学发光HRP底物检测。
1.11流式细胞术
RAW 264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)来自中国科学院。RAW 264.7细胞培养在添加10％灭活胎牛血清(FBS，用56℃水浴预处理灭活)的DMEM(H)培养基中进行；细胞在37℃的培养箱(95％相对湿度和5％CO2)中无菌培养。
游离FITC，PDA NPs和FITC@PDA NPs的细胞摄取行为通过 RAW 264.7细胞在体外用流式细胞术定性和定量分析。RAW 264.7细胞接种在24孔培养板中，密度为200000细胞/mL，12小时后用加入不同浓度的游离FITC，PDA NPs和FITC@PDA NPs(1μg/mL、 2.5μg/mL和5μg/mL)。培养24小时后，PBS缓冲液清洗并分离细胞，然后以100G离心5分钟，使用BD AccuriC6 Plus进行流式细胞术分析，使用FlowJo软件包处理数据。
用异氟醚麻醉小鼠，并在灌注PBS后小心移除膀胱。然后，37℃处理消化膀胱组织30分钟。过滤后得细胞悬浮液，5000rpm离心3 分钟。沉淀物在PBS中重新悬浮，并与CD86-PE和CD206-PE一起孵育。7.然后使用FACS Aria II系统分析细胞。使用FlowJo软件进行数据分析和补偿。
1.12统计分析
实验数据以平均值±SEM表示。使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。P<0.05被认为具有显著性差异。两组之间的统计差异通过双尾学生t检验确定。小于0.05的P值表示具有统计学意义(ns，P ＞0.05；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
2、结果和讨论
由脊髓损伤(SCI)引起的进行性膀胱功能障碍和不可逆的膀胱功能缺损是临床医生面临的主要挑战。SCI患者常伴有膀胱重塑、局部慢性炎症、尿路感染、上皮损伤等复杂的临床副作用，严重影响患者的生活质量。目前，SCI后膀胱功能障碍的治疗仍十分有限。由于膀胱壁的独特结构和周期性排尿的冲刷效应，大多数治疗剂注入膀胱组织并局部驻留十分不容易。因此，本研究的策略是构建一种功能性给药系统，有效改善SCI引起的膀胱组织炎症和膀胱功能重塑。我们选择了两种生物相容性好、生物可降解、粘附力高的纳米颗粒：壳聚糖纳米颗粒和聚多巴胺纳米颗粒，通过膀胱灌注给药分别评估其对膀胱壁的穿透能力。与此同时，我们选择具有良好抗炎和抗纤维化作用的吡非尼酮作为模型药物进行研究。为了进一步减少不必要的免疫刺激，达到良好的抗炎和抗纤维化效果，我们最终确认了安全性和稳定性均更符合课题需求的聚多巴胺载吡菲尼酮纳米粒(PFD@PDA NPs) 进行后续研究。
PFD@PDA NPs由一种改进的
Figure BDA0003572704910000161
方法制备，纳米颗粒氧化自聚过程如图1A所示。为了选择合适的纳米颗粒合成比例，选择了三种不同的DA·HCl与PFD比例(0.5:1、1:1、2:1)进行反应。采用高效液相色谱法(HPLC)测定包封率(EE％)、载药量(DL％)和药物释放率(图1B和图2)。获得的PFD@PDA纳米粒通过Zetasizers进行表征，以确定其粒径和表面电位(图1C、1D)。基于以上结果，我们最终选择了1:1比例的DA·HCl与PFD制备PFD@PDA NPs用于后续实验(EE％为36.04％，DL％为26.49％，球形直径为348.67±9.87 nm，zeta表面电位为16.30±0.26mV)。同时，采用相同的方法制备不含PFD的PDA纳米粒。使用TEM观察其球形形态(图1D)，CCK8 法研究PDA纳米粒对5637细胞和RAW264.7巨噬细胞的体外细胞毒性。结果表明PDA纳米粒对5637细胞和RAW264.7巨噬细胞的细胞毒性可忽略不计，因此膀胱内灌注PDA纳米粒对膀胱组织是安全无毒的。与此同时，在本发明试验浓度范围内，PFD@PDA NPs对5637 细胞显示出剂量依赖性细胞毒性作用。采用流式细胞术对体外培养的 RAW264.7细胞对PDA NPs的摄取行为进行定性和定量评价，结果显示RAW264.7细胞对游离FITC和FITC@PDA NPs呈剂量依赖性摄取行为(1μg/mL、2.5μg/mL和5μg/mL)(图4)。此外，我们还利用2 个更高浓度(2.5μg/mL和5μg/mL)的FITC@PDA NPs以评估其时间依赖性细胞摄取行为。对于游离FITC和FITC@PDA NPs，12小时和24小时的细胞摄取行为没有显著差异，表明培养12小时后，细胞对游离FITC和FITC@PDA NPs的摄取已达到饱和状态。同时， FITC@PDA NPs的24小时摄取百分比比12小时高出约6倍，表现出剂量依赖性和时间依赖性细胞摄取行为。
为了研究PDA NPs在膀胱组织内的渗透和滞留能力，我们用 FITC标记PDA NPs获得FITC@PDA NPs。大鼠膀胱内灌注游离FITC 和FITC@PDA NPs，分别在24小时和48小时后采集膀胱组织进行成像分析，在膀胱壁组织观察FITC的荧光分布(图3)。结果表明FITC@PDANPs能有效穿透膀胱上皮，在膀胱组织中滞留至少2天。
多巴胺是分布最广泛的儿茶酚胺化合物。聚多巴胺(PDA)是一种仿生聚合物，受贻贝粘附蛋白的启发，由多巴胺自聚合合成。其结构和化学性质与天然黑色素非常相似。由于其不同的官能团，如胺、邻苯二酚和亚胺，PDA具有两性离子性质，易于进行表面改性。我们推测，这就是为什么PDA能有效吸附在膀胱壁上，并在穿透膀胱组织后保持至少2天而不被膀胱屏障和尿流冲刷的原因。目前，PDA 的制备方法主要有电聚合法、酶氧化法和溶液氧化法。其中，溶液氧化法因其反应条件简单、成本低、易于放大而成为应用最广泛的方法。自2007年首次报道PDA纳米粒以来，它已被广泛用于构建药物递送系统。溶剂、温度、pH、氧化剂、DA浓度、反应时间和反应速率等因素都会影响PDA纳米粒的形貌和理化性质。因此，通过改变这些条件，可以得到性能理想的PDA纳米粒子。PDA纳米载体可在水和细胞培养基中稳定储存数月而不结块，并具有良好的胶体稳定性。因此，在本研究中PFD和DA混合后氧化自聚的得到的PDA纳米粒，制备工艺简单、安全、高效。
在本发明研究中，我们观察并评估了SCI模型大鼠的排尿功能和药物治疗效果。对于这部分实验，0.4mL PBS(pH 7.4)或PFD@PDA NPs从SCI手术后第一天开始每天一次膀胱内灌注给药，持续2周。 SCI手术导致显著的排尿功能障碍(图5B、C、D、E)：尿动力基线压力升高(正常大鼠为0.83±0.16毫米汞柱；SCI模型大鼠为5.02±1.85 mm汞柱)；最大压力升高(正常大鼠为11.64±5.00毫米汞柱；SCI 模型大鼠为20.89±5.25mm汞柱)，收缩间期延长(正常大鼠为 5.29±0.41分钟；SCI模型大鼠为12.40±3.14分钟)和输注量增加(正常大鼠为317.4±24.74μL；SCI模型大鼠为744.51±188.55μL)。除尿动力学参数外，我们还发现SCI模型大鼠的膀胱残余容量增加 (1.63±0.72mL)，膀胱重量/体重比增加(21.72±9.19)(图5F，5G)。 SCI模型大鼠的药物治疗组PFD@PDA NPs显示尿动力基线压力降低 (0.726±1.65mm汞柱)、收缩间期缩短(8.41±1.78分钟)、输注量减少(504.66±106.97μL)(图5B、5C、5D、5E)。我们还发现，PFD@PDA NPs处理组大鼠的残余容量(0.86±0.33mL)和膀胱重量/体重比 (14.30±3.26)均降低(图5F，5G)，表明PFD@PDA NPs对SCI引起的膀胱功能障碍具有保护作用。本研究还评估了口服PFD(400 mg/kg，每天一次)对SCI引发的膀胱功能障碍的影响，与正常对照组相比，基线压力(3.28±2.14mm汞柱)、最大压力(21.55±5.56mm 汞柱)、收缩间期(11.05±2.92分钟)、输注容量(663.66±175.64μL)、残余容量(1.05±0.56mL)和膀胱重量/体重比(16.79±2.17)均无显著性差异(图5B-G)。我们还同时检测了SCI大鼠膀胱内灌注PDA NPs 的尿动力学参数，与正常对照组相比也没有明显差异：基线压力 (2.51±3.18mm汞柱)、最大压力(25.85±10.20mm汞柱)、收缩间期(10.88±3.13分钟)、输注量(653.3±188.29μL)、残余容量(1.4±0.82 mL)和膀胱重量/体重比(21.15±8.01)(图5B-G)。以上结果表明，在本发明研究中，口服PFD不能改善SCI引发的膀胱功能障碍，膀胱内灌注给予PFD@PDA NPs可有效改善SCI引发的膀胱功能障碍。
SCI可引发膀胱局部及全身促炎细胞因子和炎症环境的显著增加。SCI术后10天膀胱内出现明显的尿路上皮增生和逼尿肌肥大，膀胱表面尿路上皮和平滑肌组织破坏，可引发慢性膀胱炎症与膀胱重塑。目前的研究还表明SCI术后早期膀胱组织中即存在高水平炎症反应和逼尿肌肥大现象，提示SCI早期膀胱组织的主要病理改变即为炎症表达。在本发明研究中，SCI手术后2周，大鼠出现严重的膀胱水肿和尿路上皮增生，经膀胱内灌注给予PFD@PDA NPs治疗后，症状明显减轻(图6A、C)，膀胱大小趋于正常。此外，经膀胱内灌注给予PFD@PDA NPs治疗2周后，膀胱组织中与炎性相关的细胞因子如 IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著降低，IL-4的表达上调(图7)。与假手术组大鼠相比，SCI模型大鼠膀胱中的总SOD活性降低，而经膀胱内灌注给予PFD@PDA NPs治疗2周后，膀胱中总SOD活性显著增加，可减轻SCI引起的膀胱氧化应激水平升高，并显著降低膀胱组织中iNOS的表达。PFD以其抗纤维化功能和防止进行性纤维化疾病的能力而闻名。据报道，PFD可通过抑制IPF患者和大鼠肺纤维化模型中的TGF-β1而有效降低肺纤维化水平，可以有效控制细胞外基质结构和胶原沉积。在本发明研究中，masson三色染色未发现膀胱组织中胶原沉积的明显差异(正常大鼠为33.26±6.29％；SCI模型大鼠为31.10±5.30％；SCI模型治疗组大鼠为36.92±6.09％)(图6B)。针对膀胱免疫微环境，免疫组化和流式细胞术分析显示PFD@PDA NPs可影响膀胱巨噬细胞抗炎-抑炎分型比例，显著减少膀胱组织中 CD68+巨噬细胞的浸润(图7E)，与SCI模型组相比，PFD@PDA NPs 治疗可降低促炎性巨噬细胞(CD86+CD206-)的比例，增加抗炎性巨噬细胞(CD86-CD206+)的比例(图7F)，即通过调节巨噬细胞抗炎-抑炎浸润比例来恢复SCI术后的膀胱重塑，为SCI引发的膀胱重塑和膀胱功能障碍提供了一种十分有前景的治疗策略。
一般来说，频繁向膀胱内注射治疗药物对患者来说十分不便，同时还可能引起感染和相关炎症反应。清洁间歇导尿被认为是SCI患者最合适和最安全的膀胱管理手段，在导尿管插入并导尿后进行膀胱内灌注给药将有效提高患者顺应性。因此，PFD@PDA NPs作为一种生物相容性良好且可降解的膀胱灌注给药平台，在治疗SCI引发的膀胱炎症、膀胱重塑和膀胱功能障碍方面具有广阔的应用前景。
综上，根据SCI所致膀胱功能障碍特性，本发明设计并构建了一种PFD@PDA NPs给药系统，经膀胱内灌注给药治疗，可有效地吸附并穿透膀胱壁，在膀胱内层起效，缓解膀胱功能障碍。通过小鼠SCI 模型，进一步证实PFD@PDA NPs系统通过清除氧自由基，抑制炎症介质的表达，减少炎症细胞的聚集，从而发挥抗炎作用，阻止或减缓膀胱功能的纤维化程度，有效改善/恢复膀胱功能。针对SCI患者的临床用药需求，可以通过膀胱内间歇导尿后灌注给予PFD@PDA NPs 体系，提高患者生活质量和生存期。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种聚多巴胺载吡非尼酮纳米粒，其特征在于，所述纳米粒为聚多巴胺纳米粒，所述聚多巴胺纳米粒负载有吡非尼酮；
所述聚多巴胺载吡非尼酮纳米粒为球形纳米粒，其平均直径为300~400 nm，其zeta电位为15~20 mV。
2.如权利要求1所述的聚多巴胺载吡非尼酮纳米粒，其特征在于，所述纳米粒载药量不小于20%。
3.如权利要求2所述的聚多巴胺载吡非尼酮纳米粒，其特征在于，所述纳米粒载药量不小于25%。
4.权利要求1-3任一所述的聚多巴胺载吡非尼酮纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：向盐酸多巴胺溶液中加入吡非尼酮溶液，然后向其中加入碱性溶液，搅拌后即得。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺与吡非尼酮的质量比为0.1~10:1。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺与吡非尼酮的质量比为0.5~2:1。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺与吡非尼酮的质量比为1:1。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺溶液为盐酸多巴胺的水溶液；所述盐酸多巴胺溶液浓度为0.01~0.1 g/mL；所述吡非尼酮溶液为吡非尼酮的有机溶液；使用的有机溶剂为二甲基亚砜，所述吡非尼酮溶液浓度为0.1~1 g/mL。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺溶液浓度为0.03 g/mL；所述吡非尼酮溶液浓度为0.33 g/mL。
10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为NaOH溶液。
11.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌是在室温条件下进行，具体搅拌条件为在500~800 rpm下处理10~20 h。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，具体搅拌条件为600 rpm处理12 h。
13.权利要求1或2所述纳米粒在制备预防和/或治疗膀胱相关疾病药物中的应用；
所述膀胱相关疾病为膀胱功能障碍和膀胱炎症；
所述膀胱功能障碍和膀胱炎症是由脊髓损伤引起的膀胱功能障碍和膀胱炎症。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗膀胱相关疾病具体表现为：
（a）改善膀胱功能；
（b）抑制炎症；
（c）预防膀胱重塑。
15.一种预防和/或治疗膀胱相关疾病的药物，其特征在于，所述药物其活性成分包含权利要求1或2所述纳米粒；
所述膀胱相关疾病为膀胱功能障碍和膀胱炎症；
所述膀胱功能障碍和膀胱炎症是由脊髓损伤引起的膀胱功能障碍和膀胱炎症；
所述药物为注射剂，为膀胱灌注的注射剂剂型；所述纳米粒或药物在采用清洁间歇导管插入术同时进行膀胱内灌注给药治疗。
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