CN114790177A - 新型Hedgehog信号通路抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种新型Hedgehog信号通路抑制剂及其制备方法，本公开的Hedgehog信号通路抑制剂能有效地抑制SMO受体活性，阻滞SHH信号通路，具有良好的阻滞肿瘤细胞增殖的作用，作为肿瘤治疗候选药物具有良好应用前景。

Description

新型Hedgehog信号通路抑制剂
技术领域
本公开涉及生物医药领域，特别涉及一种新型Hedgehog信号通路抑制剂。
背景技术
Hedgehog(HH)是一个进化上高度保守的基因家族，在哺乳动物中包含3种同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Desert Hedgehog(DHH)以及Indian Hedgehog(IHH)。其中，SHH信号通路在胚胎发育以及组织器官形成过程中起非常重要的作用，主要包括：SHH配体、跨膜蛋白Patched(PTCH1)、跨膜蛋白Smoothened(Smo)、Suppressor of Fused(SUFU)、G蛋白偶联受体激酶(GRKs)、β-arrestins以及下游的GLI转录因子[Gorojankina,T.,Cell MolLife Sci,2016.73(7):p.1317-32；Ruch,J.M.and E.J.Kim,Drugs,2013.73(7):p.613-23；Chen,W.,et al.,Science,2004.306(5705):p.2257-60]。Hedgehog信号通路的转导主要是由跨膜蛋白PTCH1和Smo介导。当不存在SHH配体时，PTCH1与Smo结合，抑制Smo活性，导致GLI在细胞质中与SUFU形成复合物，从而被蛋白酶体水解，抑制目的基因的转录。反之，当存在SHH配体时，SHH配体与PTCH1结合，解除其对Smo的抑制作用；激活的Smo使SUFU-GLI复合物分离，从而使GLI转录因子入核，促进目的基因的转录[Arensdorf,Trends Pharmacol Sci,2016.37(1):p.62-72；Robbins,D.J.,D.L.Fei,and N.A.Riobo,Science Signaling,2012.5(246):p.re6-re6；Kieran,M.W.,Neuro Oncol,2014.16(8):p.1037-47]。
Hedgehog(HH)信号通路控制着多细胞生物中细胞胚胎的发育，生长和组织修复等多方面的作用，这条通路存在与许多脊椎动物的结构单元中，如神经元，骨骼，皮肤，头发。而在人的组织中，HH信号通路的异常激活与多种癌症相关。尽管目前已经有很多Smo抑制剂运用于肿瘤治疗的临床试验中，但其大多表现出耐药性以及肌肉震颤、味觉障碍等各种不良反应。例如，GDC-0449/vismodegib在2012年获得FDA批准，用于治疗SHH信号通路异常激活的基底细胞癌，但是由于分子靶点Smo D473H突变引发耐药性，在治疗髓母细胞瘤中并未取得成功。高效新型HH信号通路药物的研发仍是当前急需解决的一个难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型Hedgehog信号通路抑制剂及其制备方法，其能有效地抑制Smo受体活性，阻滞SHH信号通路，从而降低GLI转录水平，具有良好的阻滞肿瘤细胞增殖的作用。本发明的另一目的是提供含有上述Hedgehog信号通路抑制剂的药物组合物。本发明的Hedgehog信号通路抑制剂可作为肿瘤治疗候选药物，具有良好应用前景。
具体地，本发明提供了：
式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure BDA0002916743320000021
其中X1，X2独立地选自H、Cl、F、Br中的任一种，且X1，X2不同时为H；
其中R1选自直链或支链的C1-C4的烷基中的任一种；
其中R2为—C(O)(CR3R4)mR5，其中R5选自H，羟基，或被取代或未被取代的氨基、直链或支链或环状的C1-C6的烷基、烷氧基，或—S(O)2R6；
其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
优选地，本发明提供一种上述式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，
其中X1，X2独立地选自Cl或F；
其中R2为—C(O)(CR3R4)m S(O)2R6，其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
更优选的，本发明提供一种如下的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure BDA0002916743320000022
本发明的另一方面，如前所述的任一化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)由式II经过与邻苯二胺发生缩合、环合反应得到式III化合物；
Figure BDA0002916743320000031
2)式III化合物经过烷基化反应得到式IV；
Figure BDA0002916743320000032
3)式IV与1-Boc-哌嗪反应得到式V化合物；
Figure BDA0002916743320000033
4)式V化合物经过还原、加成反应得到式(I)化合物；
Figure BDA0002916743320000034
其中，X1，X2，R1，R2定义如前所述。
本发明的另一方面，提供如前所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，在制备用于抑制Hedgehog信号通路的药物中的应用；优选其在制备用于抑制SHH信号通路药物中的应用。
本发明的另一方面，提供如前所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，在制备靶向SMO的药物中的应用；优选地，在制备靶向D473H突变的SMO的药物中的应用。
本发明的另一方面，提供如前所述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的另一方面，如前所述肿瘤选自小脑颗粒前体细胞增殖有关的肿瘤；优选地，所述肿瘤为具有SMO D473H突变的肿瘤。
本发明的另一方面，如前所述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自髓母细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌、消化道肿瘤、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或肉瘤中的一种或多种；其中所述肿瘤优选髓母细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌、消化道肿瘤、胰腺癌、乳腺癌中的一种或多种。
本发明的另一方面，提供如前所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备调节毛囊形态的药物中的应用。
本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其包含如前所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，以及药学可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一方面，如前所述任一种药物组合物，所述药物组合物的制剂选自口服制剂、静脉注射剂、皮下注射剂、透皮贴剂中的一种或多种。
本发明的另一方面，如前所述任一种药物组合物，其在制备抗肿瘤药物中的应用；所述药物组合物还可以包括另一种或多种抗肿瘤药物。
本发明的化合物具有低清除率和高代谢稳定性的特点，并以剂量依赖性的方式抑制靶基因Gli1的表达和SHH信号通路。本公开的化合物可以与cyclopamine竞争性与野生型Smo和Smo-D473H受体结合，且不易产生耐药性。另外，本公开化合物相比于GDC-0449能更有效地阻止小脑颗粒前体细胞的增殖。本公开的Hedgehog信号通路抑制剂具有良好的应用前景以及重大临床意义。
附图说明
图1示出了本发明化合物0025A的结构和1HNMR谱图；
图2示出了0025A能够抑制βarr2-GFP在细胞内的聚集；
图3示出了GDC-0449和0025A抑制βarr2-GFP在细胞内聚集作用的对比，0025A能够更加有效地阻滞SHH信号通路；
图4(A，左图)示出了0025A与GDC-0449都能有效地降低GLI的转录水平；(B，右图)示出了0025A相比于GDC-0449能更有效地阻止小脑颗粒前体细胞的增殖；
图5示出了0025A剂量依赖性地降低了Gli1 mRNA和蛋白水平；
图6示出了0025A抑制由SAG诱导的Gli1表达；
图7(A)示出了不同浓度的0025A、GDC-0449(GDC)、cyclopamine(Cyc)与bodipy-cyclopamine竞争性结合野生型Smo；图7(B)示出了10-6M(1μM)0025A、GDC、Cyc与bodipy-cyclopamine竞争性结合突变型Smo；
图8示出了0025A抑制SHH依赖的毛发生长和脱毛后毛囊形态形成；(A，上图)示出了对照试剂(vehicle组：95％丙酮/5％DMSO)或5mM的0025A处理背侧下半部分，分别于处理后第0天、第10天和第14天拍照，虚线框代表试剂处理区域；(B，下图)示出将试剂对照组和实验组背侧皮肤切片后，进行苏木精和伊红染色，观察色素形成和毛囊形态发生。
具体实施方式
根据本公开的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本公开上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
I.定义
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有，与合理利益/风险比相称的，过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
术语“治疗”包括抑制、缓解、预防或消除与所治疗的疾病、病症或失调相关的一种或多种症状或副作用。
术语“减少”、“抑制”、“减轻”或“减小”的使用是相对于对照的。本领域技术人员将容易地确定用于每个实验的适当对照。例如，将用化合物处理的受试者或细胞中的降低了的反应与未用化合物处理的受试者或细胞中的反应进行比较。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻被治疗的疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供期望的药理学和/或生理学作用的剂量。精确的剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病，以及所施用的治疗。有效量的效果可以相对于对照。这些对照在本领域中是已知的并且在本文中讨论，并且可以是例如在药物或药物组合施用之前或没有施用时的受试者的状况，或在药物组合的情况下，可以将组合效果与仅施用一种药物的效果进行比较。
术语“载体”“赋形剂”在本文中用于包括可以包含在微粒中或其上的不是治疗或生物活性化合物的任何其它化合物。因此，赋形剂应当是药学上或生物学上可接受的或相关的，例如辅料通常对受试者无毒性。“赋形剂”包括单一的这种化合物，并且还旨在包括多种化合物。
术语“药物组合物”意指包含本公开化合物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括但不限于：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂、分散剂、温敏材料、温度调节剂、黏附剂、稳定剂、助悬剂等。
术语“SHH”是指Sonic Hedgehog，Hedgehog(HH)是一个进化上高度保守的基因家族，在哺乳动物中包含3种同源基因：Sonic Hedgehog(SHH)、Desert Hedgehog(DHH)以及Indian Hedgehog(IHH)。其中，SHH信号通路在胚胎发育以及组织器官形成过程中起非常重要的作用。
术语“Gli”是指Hedgehog信号途径的转录因子Ci(Cubitus interruptus，在脊椎动物中为Gli)；Gli1是SHH信号的下游靶基因，它是SHH信号通路是否激活的标志。
术语“SMO”是指Smoothened；Hedgehog(HH)信号传递受靶细胞膜上两种受体Patched(Ptc)和Smoothened(Smo)的控制。受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码，是由12个跨膜区的单一肽链构成，能与配体直接结合，对HH信号起负调控作用。受体Smo由原癌基因Smothened编码，与G蛋白偶联受体同源，由7个跨膜区的单一肽链构成，N端位于细胞外，C端位于细胞内，跨膜区氨基酸序列高度保守，C末端的丝氨酸与苏氨酸残基为磷酸化部位，蛋白激酶催化时结合磷酸基团。
如本文所用，术语“肿瘤”系指或描述了哺乳动物尤其是人的生理状况，其典型特点是细胞无调控地生长。肿瘤的实例包括但不限于神经肿瘤、脑部肿瘤、实体瘤、癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病等。
如本文所用，术语“调节毛囊形态”系指调节SHH依赖的毛发生长和脱毛后毛囊形态形成。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本公开的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本公开上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本公开上述内容所实现的技术均属于本公开的范围.
II.具体实施方式
本公开的一个方面，涉及式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure BDA0002916743320000071
在一个实施例中，X1，X2独立地选自H、Cl、F、Br中的任一种，且X1，X2不同时为H；优选地，X1，X2独立地选自Cl、F中的任一种。
在一个具体实施例中，X1为F，X2为Cl；在另一个具体实施例中，X1为Cl，X2为F。
在一个实施例中，R1选自直链或支链的C1-C4的烷基中的任一种；在一个具体实施例中，R1可以为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基中的任一种；优选地，R1可以为甲基。
在一个实施例中，R2为—C(O)(CR3R4)mR5，其中R5选自H，羟基，或被取代或未被取代的氨基、直链或支链或环状的C1-C6的烷基、烷氧基，或—S(O)2R6；其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
在一个具体实施例中R2为—C(O)(CR3R4)m S(O)2R6，其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
在一个具体实施例中，R2为—C(O)(CR3R4)m S(O)2CH3，其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自1-3的整数；优选地，R3，R4独立地选自H，m选自1或2。
在另一个具体实施例中，R2为—C(O)(CR3R4)mR5，其中R3，R4独立地选自H，m选自0-2的整数，R5选自羟基、或被取代或未被取代的氨基、直链或支链或环状的C1-C6的烷基、烷氧基；优选地，R5选自-OH、-NH-CH3、-N(CH3)2、-O-CH3、-C(CH3)2OH、
Figure BDA0002916743320000072
中的任一种。
本公开的另一个方面，涉及如前所述任一式(I)化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
a)由式II经过与邻苯二胺发生缩合、环合反应得到式III化合物；
b)式III化合物经过烷基化反应得到式IV；
c)式IV与1-Boc-哌嗪反应得到式V化合物；
d)式V化合物经过还原、加成反应得到式(I)化合物；
其中，X1，X2，R1，R2定义如前所述；具体可参照如下反应式进行：
Figure BDA0002916743320000081
在一个具体实施例中，更优选的，本发明提供一种如下式0025A的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure BDA0002916743320000082
在一个具体实施例中，涉及如前所述式0025A的化合物的制备方法；具体包括如下步骤：
a)由式1经过邻苯二胺发生缩合、环合反应得到式4化合物；
b)式4化合物经过甲基化得到式5化合物；
c)式5化合物经过与1-Boc-哌嗪反应得到式7化合物；
d)式7化合物经过还原及与3-(甲基磺酰基)丙酸反应得到式0025A化合物；
具体可参照如下反应式进行：
Figure BDA0002916743320000091
需要说明的是，合成式(I)化合物的具体方法不受特别限制，本领域技术人员可以根据式(I)化合物具体结构，选择适当的反应底物、中间体、反应条件等方法合成式(I)化合物。
本公开的另一方面，涉及前述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备抑制Hedgehog信号通路的药物中的应用。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，能够抑制SHH信号通路。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，能够抑制能够抑制βarr2-GFP在细胞内的聚集，对SMO起抑制作用。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，可以与cyclopamine竞争性与野生型SMO和SMO-D473H突变受体结合。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，能够能有效地降低GLI的转录水平，可剂量依赖性地降低Gli1mRNA和蛋白水平。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，可以用于制备SHH信号通路抑制剂。
在一个实施例中，如前所述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，可以用于制备靶向SMO的药物，优选地，用于制备靶向SMOD473H突变体的药物。
本公开的另一方面，涉及如前所述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备抗肿瘤的药物中的应用。
在一个实施例中，如前所述制备抗肿瘤的药物中的应用，其中肿瘤选自Hedgehog信号通路相关的肿瘤；优选地，所述肿瘤选自SHH信号通路相关的肿瘤；优选地，所述肿瘤选自SMO相关的肿瘤，更优选地所述肿瘤选自具有SMO D473H突变的肿瘤。
前述任一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物的应用，其中所述肿瘤选自髓母细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、淋巴瘤、脑胶质瘤、白血病或肉瘤中的一种或多种。
在一个实施例中，如前所述任一化合物在制备抗肿瘤的药物中的应用，其中所述肿瘤优选髓母细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌、消化道肿瘤、胰腺癌、乳腺癌中的一种或多种。
在本公开的一个具体实施例中，前述任一化合物可抑制小脑颗粒前体细胞增殖有关的肿瘤；优选地，所述肿瘤为髓母细胞瘤。
本公开的另一个方面，涉及前述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，在制备调节毛囊形态的药物中的应用。
在本公开的一个具体实施例中，如前所述任一化合物可抑制皮肤色素形成和毛发再生。
本公开的另一个方面，涉及一种药物组合物，其包含前述化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，和药学上可接受的载体或赋形剂。
在一个实施例中，如前所述任一种药物组合物，所述药物组合物的制剂选自口服制剂、静脉注射剂、皮下注射剂、透皮贴剂中的一种或多种。
在一个实施例中，如前所述药物组合物的制剂形式包括但不限于片剂、胶囊剂、冻干粉剂、注射剂溶液剂、注射剂、颗粒剂、乳状剂、混悬剂、油剂、纳米制剂中的一种或多种。
本公开的另一个方面，涉及前述任一种药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本公开的另一个方面，涉及前述任一种药物组合物在制备调节毛囊形态药物中的应用。
在一个实施例中，所述药物组合物还包括另一种或多种抗肿瘤药物，或者另一种调节毛囊形态药物。
III.实施例
下面参照实施例进一步阐释本发明。对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据本申请说明书的教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：化合物1-(4-(6-氯-2-氟-3-(1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2基]苯基)哌嗪-1-基)-3-(甲基磺酰基)丙-1-酮(0025A)的合成
Figure BDA0002916743320000111
合成方法：
步骤1)：N-(2-氨基苯基)-3-溴-4-氯-2氟苯甲酰胺的合成
Figure BDA0002916743320000112
将化合物1(6.5g,25.9mmol)，化合物2(邻苯二胺，5.6g,51.8mmol)溶于50ml DMF中，加入EDCI(5.9g,31.07mmol,),HOBT(4.19g,31.07mmol)DMAP(316mg,2.59mmol)，室温搅拌，反应完全后，加入150ml水，乙酸乙酯萃取三次(150mL X 3)，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化得到5.2g产品化合物3(N-(2-氨基苯基)-3-溴-4-氯-2氟苯甲酰胺)，黄色固体，收率58.8％。
化合物1结构表征：
LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝343.0
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.53-7.48(m,1H),7.39-7.22(m,3H),7.12-7.05(m,2H),6.82-6.78(m,3H).
化合物3结构表征：
LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝324.9
1HNMR(400MHz,MeOD):δ7.88-7.84(m,1H),7.75-7.60(m,2H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),7.36-7.32(m,3H).
步骤2)：2-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-1H-苯并[d]咪唑的合成
Figure BDA0002916743320000121
将化合物3(4.7g,13.8mmol)溶于100ml醋酸中，加热到100度反应过夜。HPLC显示反应完全，冷却到室温，浓缩，加入50ml水，用二氯甲烷萃取三次(50mL*3)，，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱层析纯化(PE:EA＝1:1)得到2.4g产品化合物4(2-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-1H-苯并[d]咪唑)，红色固体，收率51.9％。
化合物4结构表征：
LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝338.9
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.80(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(t,J＝7.6Hz,1H),7.39-7.34(m,1H),7.32-7.19(m,3H),3.62(s,3H).
步骤3)：2-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-1甲基-苯并[d]咪唑的合成
Figure BDA0002916743320000122
将化合物4(2.4g,4.32mmol)溶于20ml四氢呋喃中，冷却到零度，加入60％钠氢(345.6mg,8.64mmol)，室温搅拌10分钟。然后加入碘甲烷(920mg,6.48mmol)，室温搅拌1小时。HPLC显示反应完全，加入30ml水，用乙酸乙酯萃取三次(30mL X 3)，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到2g产品化合物5(2-(3-溴-4-氯-2-氟苯基)-1甲基-苯并[d]咪唑)，红色固体，收率79.6％。
化合物5结构表征：
LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝445.2
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.81(d,J＝6.8Hz,1H),7.39-7.19(m,4H),6.97(t,J＝8.8Hz,1H),3.62(s,3H),3.60-3.48(m,4H),3.15-3.03(m,2H),2.97-2.85(m,2H),1.43(s,9H).
步骤4)1-叔丁氧羰基-4-(6-氯-2-氟-3-(1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基)哌嗪的合成
Figure BDA0002916743320000131
将化合物5(2g,5.92mmol)溶于20ml甲苯中，加入化合物6(1.1g,5.92mmol),Pd2(dba)3(254mg,0.296mmol,),Cs2CO3(5.77g,17.76mmol,)and BINAP(360mg,0.592mmol).氮气保护下100度反应过夜。HPLC显示反应完全，冷却到室温，加入25ml水，用乙酸乙酯萃取三次(25mL*3)，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱纯化(PE:EA＝1:1)，得到1.7g产品化合物7(1-叔丁氧羰基-4-(6-氯-2-氟-3-(1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2-基)苯基)哌嗪)，黄色固体，收率64.7％。
化合物7结构表征：LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝345.1
步骤5)：1-(4-(6-氯-2-氟-3-(1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-2基]苯基)哌嗪-1-基)-3-(甲基磺酰基)丙-1-酮(0025A)的合成
Figure BDA0002916743320000132
将化合物7(1.7g,3.82mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入4M盐酸二氧六环溶液17ml。室温搅拌。反应完全后过滤，滤饼用石油醚洗，干燥得到1.2g化合物8，白色固体，收率91.1％。
将化合物8(1.2g,3.47mmol)溶于DMF(15mL)中，加入3-(甲基磺酰基)丙酸(529mg,3.47mmol),DIEA(895mg,6.94mmol),HATU(1.98g,5.21mmol)。室温反应完全后，加入45ml水，用乙酸乙酯萃取三次(50mL*3)，有机相用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，浓缩，制备纯化得到380mg产品0025A，白色固体，收率22.8％。
0025A结构表征：
LCMS(ESI-MS):[M+H]+＝479.1
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)(图1):δ7.73-7.66(m,2H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),7.37-7.27(m,3H),3.78-3.64(m,7H),3.36-3.30(m,2H),3.21-3.02(m,4H),3.02(s,3H),2.86(t,J＝7.6Hz,2H).
实施例2：0025A的体外药代动力学检测
利用人的肝脏微粒体，在体外检测了0025A的代谢稳定性，发现同阳性对照化合物(睾酮、普萘洛尔)和阴性对照化合物(华法令)比较，0025A表现出了低清除率和高代谢稳定性的特点(表1)。
表1示出0025A的体外药代动力学分析：
Figure BDA0002916743320000141
K，清除系数；T1/2，半衰期；Clint，内在消除率；Clapp，表观半衰率；Clh，肝消除率；Eh，摄取率。
实施例3：βarr2-GFP细胞内聚集实验
1)U2OS细胞中Smo抑制剂的鉴定
将稳定过表达βarr2-GFP和Smo-633的U2OS细胞分别加入(A)DMSO、(B)1μMcyclopamine(Cyc)、(C)100nM 0025A或(D)100nM 0025A和1μM SAG，于37℃下培养24h，荧光显微镜观察。箭头显示βarr2-GFP在细胞内的聚集。(E)统计发生βarr2-GFP聚集的U2OS细胞的百分率。
以Cyc(Smo抑制剂)和SAG(Smo激动剂)为对照，通过Smo/βarr2-GFP聚集实验验证了0025A能够抑制βarr2-GFP在细胞内的聚集，对SHH信号通路起抑制作用(图2)。
2)0025A抑制βarr2-GFP在细胞内聚集
(A)将不同浓度的0025A(10-12-10-6M)加入稳定过表达βarr2-GFP和Smo-633的U2OS细胞中，于37℃下培养24h，荧光显微镜观察。(B)统计不同浓度0025A与GDC-0449处理细胞后，发生βarr2-GFP聚集的细胞的百分率。
实验发现0025A和罗氏已上市药物Smo抑制剂GDC-0449的IC50分别为1.7nM和28nM(图3)，说明相较GDC-0449，0025A能够更加有效地阻滞SHH信号通路。
实施例4：GLI-荧光素酶报告实验
将50ng/mL SHH与不同浓度的0025A、GDC-0449加入稳定表达报告基因的NIH3T3细胞中，作用30h后，利用GLI-luciferase reporter assay发现0025A与GDC-0449都能有效地降低GLI的转录水平，两者之间没有差别(图4A)。
将50ng/mL SHH与不同浓度的0025A、GDC-0449加入小脑颗粒前体细胞中，作用48h；然后，用3H-胸腺嘧啶核苷标记16h，同位素检测仪检测其掺入量，发现0025A相比于GDC-0449能更有效地阻止小脑颗粒前体细胞的增殖(图4B)。
结论：通过GLI-luciferase reporter assay，观察到0025A与GDC-0449都能有效地降低GLI的转录水平，两者之间没有差别(图4A)。但是，通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入法实验检测小脑颗粒前体细胞的增殖，发现相比于GDC-0449(IC50＝23.1±4.2nM)，0025A(IC50＝12.3±2.9nM)能更有效地阻止小脑颗粒前体细胞的增殖(图4B)，证实0025A能有效地抑制SHH信号通路.
实施例5：Gli1表达实验
1)0025A抑制由SHH配基诱导的Gli1表达。
(a)用20％SHH配基处理血清饥饿的NIH3T3细胞24小时，分析细胞中Gli1的mRNA水平。将血清饥饿的NIH3T3细胞分别用20％SHH-CM和不同浓度的抑制剂(0.01、0.1、1、10μM0025A或1μM GDC-0449)处理24h，分析细胞中Gli1 mRNA水平(b)和蛋白水平(c,d)。(图5)
2)0025A抑制由SAG诱导的Gli1表达。
(A)用100nM SAG处理血清饥饿的NIH3T3细胞24小时，分析细胞中Gli1的mRNA水平。将血清饥饿的NIH3T3细胞分别用100nMSAG和不同浓度的抑制剂(0.01、0.1、1、10μM0025A或1μM GDC-0449)处理24h，分析细胞中Gli1 mRNA水平(B)和蛋白水平(C,D)。(图6)
结论：我们使用SHH配基或已知的Smo激动剂SAG来增强Gli1的表达。使用20％SHH-CM或100nM SAG刺激血清饥饿的NIH3T3细胞，发现Gli1 mRNA水平分别增加了4倍和3倍(图5a，6A)，说明二者可以激活SHH信号通路。为了检测0025A对SHH通路的抑制作用，用20％的SHH-CM和0025A(0.01、0.1、1、10μM)或GDC-0449(1μM)分别处理NIH3T3细胞24h，观察到0025A剂量依赖性地降低了Gli1 mRNA和蛋白水平(图5，b-d)。此外，与SHH-CM类似，0025A可以抑制由SAG激活的SHH信号(图6，B-D)。这些结果表明，0025A可以作为一种有效的抑制剂，并以剂量依赖性的方式抑制靶基因Gli1的表达和SHH信号通路。
实施例6：0025A与Smo受体竞争性结合
为了进一步验证0025A与Smo受体的结合，我们进行了bodipy-cyclopamine竞争结合实验。我们发现，已知的Smo拮抗剂(cyclopamine，GDC-0449)和0025A能够以相似的亲和力将5nM的bodipy-cyclopamine从Smo中取代，从而降低细胞中的绿色荧光(图7A)。
为了检验0025A是否能与发生D473H突变的Smo结合，我们在HEK293细胞中过表达Smo-D473H并进行竞争结合实验，结果表明0025A能有效竞争Smo-D473H中5nM bodipy-cyclopamine。而GDC-0449在低浓度时无法与突变体Smo-D473H结合，高浓度时表现出部分效应(图7B)。这些结果表明，0025A可以与cyclopamine竞争性与野生型Smo和Smo-D473H受体结合，不易产生耐药性。
实施例7：0025A抑制小鼠皮肤色素形成和毛发再生
研究表明SHH信号通路与调节毛囊形态发生密切相关。为了验证0025A在体内对SHH信号的抑制作用，我们对8周龄雌性C57BL/6小鼠进行了背毛剃除和脱毛膏脱毛，这可以诱导毛囊发育进入生长期。脱毛后，我们用对照试剂(95％丙酮/5％DMSO)和实验试剂(95％丙酮/5％DMSO+5mM 0025A)处理脱毛后的皮肤区域，每天一次，连续14天，观察色素形成和毛发再生情况。我们发现，对照组小鼠在10天后的皮肤变灰(色素积累)更多。14天后大部分毛发重新长回。然而，0025A实验组的小鼠毛发生长受阻(图8A)。组织学分析显示，0025A实验组的色素形成和毛囊形态发生受阻(图8B)。

Claims (10)

1.式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure FDA0002916743310000011
其中X1，X2独立地选自H、Cl、F、Br中的任一种，且X1，X2不同时为H；R1选自直链或支链的C1-C4的烷基中的任一种；
R2为—C(O)(CR3R4)mR5，其中R5选自H，羟基，或被取代或未被取代的氨基、直链或支链或环状的C1-C6的烷基、烷氧基，或—S(O)2R6；
其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，
其中X1，X2独立地选自Cl或F；
其中R2为—C(O)(CR3R4)mS(O)2R6，其中R3，R4独立地选自H、被取代或未被取代的C1-C6的烷基，m选自0-6的整数；R6选自直链或支链或环状的C1-C6的烷基。
3.如下的化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物：
Figure FDA0002916743310000012
4.权利要求1-3所述的化合物的制备方法，所述化合物制备方法包括如下步骤：
1)由式II经过与邻苯二胺发生缩合、环合反应得到式III化合物；
Figure FDA0002916743310000021
2)式III化合物经过烷基化反应得到式IV；
Figure FDA0002916743310000022
3)式IV与1-Boc-哌嗪反应得到式V化合物；
Figure FDA0002916743310000023
4)式V化合物经过还原、加成反应得到式(I)化合物；
Figure FDA0002916743310000024
其中，X1，X2，R1，R2定义如权利要求1所述。
5.根据权利要求1-3所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备用于抑制Hedgehog信号通路的药物中的应用；优选其在制备用于抑制SHH信号通路药物中的应用。
6.根据权利要求1-3所述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，所述肿瘤选自髓母细胞瘤、基底细胞癌、神经胶质瘤、肝癌、肺癌、消化道肿瘤、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病或肉瘤中的一种或多种；其中所述肿瘤优选具有SMO D473H突变的肿瘤。
8.根据权利要求6所述应用，所述肿瘤选自小脑颗粒前体细胞增殖有关的肿瘤；优选地，所述肿瘤为具有SMO D473H突变的肿瘤。
9.根据权利要求1-3所述的任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，其在制备调节毛囊形态的药物中的应用。
10.药物组合物，其包含根据权利要求1-3所述任一化合物或其药学上可接受的盐、或其异构体、或药学上可接受的溶剂合物或水合物，以及药学可接受的载体。
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