CN114788837A - 一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用 - Google Patents

一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。本发明提供了酪酸梭菌和沙利度胺联用在治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。经研究表明，酪酸梭菌和沙利度胺联用降低了顺铂导致的CINV情况的发生可近乎完全消除CINV副作用，而且明显增强了顺铂抗癌药物对于肿瘤的药物治疗效果，相比于对照组，肿瘤的数量和大小都明显减少。

Description

一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐 的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。
背景技术
结直肠癌(CRC)是世界上第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的常见原因之一。全世界每年有120多万病人被诊断为结直肠癌(CRC)，其中大约50％的人死于该疾病，成为一个严重的健康问题。晚期结直肠癌的系统治疗通常包括手术治疗、放疗、化疗和生物药物疗法，其中化疗方案应用最为广泛。用于化疗的药物通常可以抑制癌细胞的生长增殖，甚至能够杀死癌细胞，临床上由两种或三种化疗药物组成的一线化疗方案(即氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康)显著提高了晚期疾病患者的生存率。然而化疗药物的作用是非特异性的，其杀死癌细胞的同时，也会对正常的细胞，尤其是快速增殖的胃肠道黏膜上皮细胞造成伤害，从而引起严重的胃肠道毒副反应，其中恶心呕吐、食欲减退、腹泻、便秘及腹痛腹胀等症状最为常见。
化疗导致的恶心呕吐(CINV)是化疗后由神经递质(多巴胺、5-羟色胺、组胺、乙酰胆碱和P物质)刺激呕吐中心或化学受体触发区受体引起的。如果不做任何处理加以预防，CINV的发生率高达70-80％。不受控制的CINV会降低患者的生活质量，并可能导致患者过早停止化疗。当前最常见的治疗方法是四种药物组合治疗，包括NK-1受体拮抗剂、5-HT3受体拮抗剂、地塞米松和奥氮平。然而，60-80％的患者在接受这些药物的同时仍会出现CINV，且目前这些针对CINV治疗的药物价格昂贵，也在一定程度上限制了其临床使用。沙利度胺(THD)是谷氨酸的一种衍生物，最初被用作镇静剂来治疗妊娠呕吐，但由于其对胎儿有严重副作用而引起患者警示。因此，寻找一种高效改善结直肠癌化疗导致的恶心呕吐药物成为一种亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。本发明将酪酸梭菌和沙利度胺联用，能够有效地预防和治疗结直肠癌顺铂化疗导致的恶心呕吐，而且明显增强了顺铂抗癌药物对于肿瘤的药物治疗效果，相比于对照组，肿瘤的数量和大小都明显减少。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的呕吐恶心的药物中的应用。
本发明中，所述肿瘤肿瘤包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、喉癌、食道癌、淋巴癌中的至少一种。一些具体实施例中，所述肿瘤为结直肠癌。
本发明中，所述治疗和/或预防放化疗引起的呕吐恶心包括：抑制神经递质5-HT、SP的表达水平、抑制脑最后区受体5-HT3R和NK-1受体激活、改善肠道炎症、调节肠道菌群中的至少一种。
化疗导致的恶心呕吐和大脑内神经递质的异常上调密切相关。本发明通过ELISA和q-PCR方法检测了各组小鼠大脑内神经递质5-HT和P物质(SP)表达量。结果显示，与空白对照组相比，结直肠癌小鼠大脑内神经递质轻微提高，而在顺铂化疗后5-HT和SP表达量显著升高，沙利度胺和酪酸梭菌预防的小鼠5-HT和SP表达量显著降低，表明沙利度胺和酪酸梭菌通过减少顺铂诱导的大脑神经递质增加而缓解呕吐。
本发明进一步通过免疫组织化学染色检测了小鼠脑部最后区的神经递质受体5-HT3R和NK-1R表达，结果显示，结直肠癌组和对照组小鼠表达量无差异且较少，而顺铂化疗后的小鼠则表达异常增多，沙利度胺联合酪酸梭菌预防能使其表达明显减少，表明沙利度胺联合酪酸梭菌通过减少小鼠最后区5-HT3R和NK-1R异常表达而缓解呕吐的程度。
本发明中，对于酪酸梭菌的具体来源没有特殊限定，可市售获得也可自行分离获得。本发明具体实施例中，采用保藏编号为CGMCC0313.1的酪酸梭菌。
本发明构建了小鼠结直肠癌模型，再用沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合给药预防结直肠癌顺铂化疗导致的恶心呕吐。结果显示：(1)酪酸梭菌和沙利度胺联用显著降低了顺铂导致的CINV情况的发生，降低了神经元反应性；并对肠道菌群有改善效果，增加了菌群丰度，并降低了肠道炎性反应。(2)二者联用增强了顺铂抗癌药物对于肿瘤的药物治疗效果，相比于对照组，肿瘤的数量和大小都有减少。
基于以上结果，本发明还提供了酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备用于增强化疗药物抗肿瘤作用的药物中的应用。
本发明中，所述增强化疗药物抗肿瘤作用包括：减少肿瘤数量、抑制肿瘤大小、下调COX2表达、上调凋亡执行蛋白cleaved-caspase-3、减少DNA修复酶Cleaved-PARP中的至少一种。
本发明中，所述化疗药物为顺铂、依托泊苷、替尼泊苷、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛等的一种或多种。
本发明中，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、喉癌、食道癌、淋巴癌中的至少一种。一些具体实施例中，所述肿瘤为结直肠癌。
本发明提供的酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备用于增强化疗药物抗肿瘤作用的药物中的应用中，对于酪酸梭菌的具体来源没有特殊限定，可市售获得也可自行分离获得。本发明具体实施例中，采用保藏编号为CGMCC0313.1的酪酸梭菌。
本发明提供的酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的呕吐恶心的药物中的应用，以及在制备用于增强化疗药物抗肿瘤作用的药物中的应用中。酪酸梭菌和沙利度胺联用时，二者可以作为混合物同时给药，也可分别以独立的形态先后给药，所述独立的形态可以是相同的剂型，也可以是不同的剂型。先后给药时，对两药的顺序没有特殊限制。本发明中，给药的方式包括灌胃或注射。本发明具体实施例中，酪酸梭菌采用灌胃方式，沙利度胺采用注射方式。本发明中，两药联用时，酪酸梭菌以106CFU计，沙利度胺以mg计，酪酸梭菌和沙利度胺的比例为1:25。
本发明还提供一种治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的组合物，包括酪酸梭菌和沙利度胺。
本发明所述组合物中，酪酸梭菌和沙利度胺可以以混合形态存在，也可以独立地分别以相同的或不同的剂型存在，本发明对此没有特殊要求。所述组合物中，酪酸梭菌和沙利度胺按照本领域常用的剂量混合使用或单独使用，具体剂量也可根据患者病情或医嘱进行适当调整。在本发明具体实施例中，两药联用时，所述组合物中，酪酸梭菌以106CFU计，沙利度胺以mg计，酪酸梭菌和沙利度胺的使用比例为1:25。两药按照该比例可以混合后同时给药，也可单独给药，给药的剂型和顺序均不作具体限定。
一些实施方案中，所述酪酸梭菌为保藏编号为CGMCC0313.1的菌株。
本发明还提供一种抗肿瘤药物，包括本发明所述的组合物和化疗药物。所述化疗药物为顺铂、依托泊苷、替尼泊苷、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛中的一种或多种。
本发明还提供一种治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的呕吐恶心的方法，包括：
同时给予酪酸梭菌和沙利度胺；
或，分别给予酪酸梭菌和沙利度胺。
所述分别给予包括：先给予酪酸梭菌，后给予沙利度胺；先给予沙利度胺，后给予酪酸梭菌。
本发明还提供一种抗肿瘤的方法，包括：给予本发明所述的抗肿瘤药物。
本发明提供了酪酸梭菌和沙利度胺联用在治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。经研究表明，酪酸梭菌和沙利度胺联用降低了顺铂导致的CINV情况的发生可近乎完全消除CINV副作用，而且，两药联用明显增强了顺铂抗癌药物对于肿瘤的药物治疗效果，相比于对照组，肿瘤的数量和大小都明显减少。
附图说明
图1示AOM/DSS诱导小鼠形成结直肠癌；A.结直肠癌造模组小鼠结肠大体标本；B.HE染色检测正常组和造模组结肠上肿瘤组织学结构(200×)；实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；
图2示沙利度胺和酪酸梭菌抑制了结直肠癌顺铂化疗小鼠体重的下降和恶心呕吐的程度；A.各组小鼠每周体重变化；B.各组小鼠摄食的高岭土重量占总摄食量比值。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图3示沙利度胺和酪酸梭菌通过促进凋亡抑制结直肠癌的发生；A.各组小鼠结直肠上肿瘤数；B.通过WB检测肿瘤里环氧合酶2(COX2)和凋亡相关蛋白；C.对B图中灰度值的量化统计；实验分组：M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图4示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药抑制Fos反应神经元；实验分组：M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组；数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图5示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药抑制了小鼠脑和结肠中神经递质5-HT和NK-1；A.通过ELISA检测脑中5-HT，q-PCR检测脑中NK-1；B.通过ELISA检测结肠中5-HT，q-PCR检测结肠中NK-1。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图6示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药抑制了小鼠脑中神经递质受体5-HT3R和NK-1R表达；A.通过免疫组织化学染色检测脑中5-HT3R和NK-1R表达。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组；数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图7示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药平衡了失调的肠道菌群；以下为高通量分析结果：A.shannon指数；B.PCoA分析；C.Venn图；D.门水平物种丰富度；E.属水平物种丰富度。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图8示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药促进益生菌和产抗癌SCFA菌丰度的上调；A.Bacteroidetes；B.Firmicutes；C.Bifidobacteriaceae；D.Ruminococcaceae；E.Lactobacillaceae；F.Clostridium；G.Bifidobacterium；H.Ruminococcus；I.Lactobacillus。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图9示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药改善了DSS和顺铂化疗导致的结肠炎症；A.HE染色观察结肠炎症细胞浸润和形态学；B.q-PCR检测各组小鼠结肠中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组；数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图10示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药通过HDAC1和p65信号通路改善了DSS和顺铂化疗导致的结肠炎症；A.WB检测结肠中p65信号通路上关键蛋白；B.对A图中WB灰度值结果的量化。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组；数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图11示沙利度胺和酪酸梭菌联合给药通过促进结肠Trek1蛋白表达而改善DSS和顺铂化疗导致的结肠屏障损伤；A.WB检测结肠中屏障蛋白occludin和Trek1表达；B.对A图中WB灰度值结果的量化。实验分组：C：正常对照组；M1：结直肠癌模型组；M2：结直肠癌顺铂化疗组；S：沙利度胺给药预防组；L：酪酸梭菌给药预防组；SL：沙利度胺和酪酸梭菌联合给药组。数据以平均值SD表示，*p<0.05，**p<0.01；
图12示沙利度胺联合其他益生菌对结直肠癌顺铂化疗所引起的恶心呕吐的治疗效果；12-A为各组小鼠高岭土摄食含量变化的比较，12-B为小鼠结肠上肿瘤数量的变化；12-C为小鼠脑部神经递质5-HT的变化；12-D为小鼠脑部神经递质SP的变化。
具体实施方式
本发明提供了一种组合物及其在制备治疗和/或预防化疗引起的恶心呕吐的药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1.材料与方法
1.1材料
表1
Figure BDA0003682071900000071
Figure BDA0003682071900000081
1.2实验方法
1.2.1酪酸梭菌的培养
酪酸梭菌，编号：CGMCC0313-1，由青岛东海药业有限公司提供。在超净工作台中，用无菌接种环蘸取适量于-80℃甘油保存的酪酸梭菌菌液，划线于TSA固体培养基表面，于37℃厌氧培养箱中培养24-36h。挑取平板上的单菌落接种于装有8mLTSB液体培养基的15mL离心管中，37℃厌氧条件下培养12-24h后测定吸光度。分离活化的菌液可置于4℃短期保存或按照1：1的比例加入30％的甘油于-80℃长期保存。
测定菌液浓度：将分光光度仪预热20min，设定OD600模式，用于吸光度测量。吸取进行传代培养后的酪酸梭菌菌液500μL于离心管中，8000rpm离心1min，弃去上清，使用1mLPBS缓冲液将菌体进行重悬。之后准备两个干净比色皿，一个加入PBS缓冲液用于吸光度调零，另一个加入重悬液进行吸光度测定，连续多次加入相应体积PBS缓冲液直至重悬液OD600接近于1(查阅文献及相关资料得知酪酸梭菌OD600＝1时相对应的菌液浓度为1×109CFU/mL)，并记录加入的PBS缓冲液总体积。后续动物实验根据所需菌液总量及总体积，使用PBS缓冲液对菌液进行稀释，现配现用。
1.2.2结直肠癌化疗小鼠模型的建立及药物预防
1.2.2.1结直肠癌化疗小鼠模型的建立
本研究所有操作和规范，均遵循南昌大学关于实验动物相关文件要求。课题已获得南昌乐悠生物科技有限公司伦理审批(编号：RyE2021070902)。
(1)本次实验所用小鼠为7周龄C57BL/6雄性小鼠，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验分为正常组(C组)、结直肠癌模型组(M1组)、结直肠癌顺铂化疗组(M2组)、结直肠癌顺铂化疗+酪酸梭菌预防组(L组)、结直肠癌顺铂化疗+沙利度胺预防组(S组)、结直肠癌顺铂化疗+沙利度胺+酪酸梭菌预防组(SL组)，每组12只。
(2)小鼠适应性饲养1周后，分别在第1天和第19天腹腔注射10mg/kg氧化偶氮甲烷(AOM)。同时将1％葡聚糖硫酸钠(DSS)作为饮用水，于第7天、第19天和第31天给小鼠自由饮用3次，每次为期5天，其余时间给予常规水饮用，约三个月后观察肿瘤形成情况。待核磁共振实验确认结直肠癌模型建立后，再分别给予沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合给药预防，最后连续3天腹腔注射100μL顺铂(2.5mg/kg)建立结直肠癌顺铂化疗小鼠模型。C组小鼠则腹腔注射100μL生理盐水做对照处理。
1.2.2.2结直肠癌化疗小鼠的药物预防
L组和SL组小鼠灌胃100μL由细菌包被液(0.9％的生理盐水中含有0.01％的明胶)重悬的酪酸梭菌进行给药，菌液浓度为107CFU/mL，每天1次，连续21天；S组和SL组小鼠腹腔注射200μL沙利度胺(25mg/kg)，每天1次，连续14天；其余组别灌胃100μL细菌包被液(0.9％的生理盐水中含有0.01％的明胶)，每天1次，连续21天。
1.2.2.3小鼠表型检测及样本处理
(1)异食癖行为：对各组小鼠同时喂食等量正常饲料和高岭土，观察小鼠对高岭土的摄食行为以评价是否发生呕吐，同时根据各组小鼠高岭土摄食量占总摄食量的比例评价恶心呕吐的程度。具体地，将高岭土同1％阿拉伯树胶粉混匀，加入适量去离子水制成团块，再将团块放入特制模具中，挤压成长条状，大小与正常饲料相似，室温晾干(最终确定的高岭土制备配方制备的高岭土饲料，在实验过程中几乎没有明显碎渣，偶而可见较大颗粒，可捡起放回原处保证不会对实验结果产生影响)。从实验当天起，每日定时记录药物干预后小鼠24h内高岭土摄食量，如果有撒落的高岭土碎渣，收集后一起称量。
(2)体重：实验期间，每隔1周称量小鼠体重并记录。
(3)粪便收集：在药物预防结束后收集小鼠粪便50-100mg，放入-80℃冰箱冻存，用于后续高通量测序。
(4)样本处理：待实验结束后安乐死小鼠，取出小鼠全段结肠，记录所在肿瘤数目。之后使用预冷无菌生理盐水将结肠内容物冲洗干净，分为两部分，分别置于-80℃冰箱或4％组织固定液中保存。其他实验所需脏器均按上述步骤进行处理。
1.2.3组织病理学分析
2.2.3.1HE染色
(1)标本固定：剪取目的组织，长度约为1.0-2.0cm，立即置入4％组织固定液中固定，使组织蛋白变性；
(2)脱水透明：通过梯度酒精脱水，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于透明剂二甲苯中，待二甲苯替换出标本中存在的酒精后，即可进行包埋；
(3)石蜡包埋：将上述透明处理后的标本块放入已融化的石蜡中，置于恒温孵箱，待组织完全浸蜡后即进行切片处理；
(4)切片和贴片：将上述包埋完成的蜡块固定于石蜡切片机，切成厚度为5-8μm的薄片。放于热水中展平，之后贴附到载玻片上，置于45℃恒温孵箱中；
(5)脱蜡染色：标本切片放入二甲苯中脱蜡10min，由梯度乙醇逐级水化，最后按如下步骤进行操作：自来水冲洗5min→苏木素染色3min→流水冲洗30s→1％盐酸乙醇分化10-30s→自来水冲洗15s→1％伊红染色1min(乙醇溶解)；
(6)脱水透明：经由梯度乙醇(50％乙醇，75％乙醇，90％乙醇，100％乙醇)逐级脱水，二甲苯透明3-5min；
(7)封片：在切片上滴加中性树胶，盖玻片封固；
(8)观察：将封片置于光学显微镜下，分别在200×与400×视野下拍照观察，并作病理生理学分析。
2.2.3.2免疫组化
(1)同HE染色常规脱蜡，脱水处理；
(2)用3％新鲜配置的H2O2水溶液室温处理5-10min，用PBS冲洗3次；
(3)抗原修复。将切片浸入浓度为0.01mol/LpH＝6.0的枸橼酸盐缓冲液中，加热至沸腾后自然冷却5-10min，重复此操作1-2次，冷却后用pH＝7.2-7.6的PBS缓冲液洗涤2-3次；
(4)在室温条件下用5％小牛血清封闭切片20min，除去多余的液体；
(5)加入一抗50μL，4℃孵育过夜，37℃复温45min，使用pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min；
(6)加入二抗50μL，37℃孵育1h，pH＝7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗3次，5min/次；
(7)DAB显色5-10min，显微镜下观察显色程度；
(8)显色完毕后用去离子水充分洗涤以终止反应；
(9)苏木素复染1min，流水冲洗10min，脱水、透明、封片，分别在200倍与400倍镜下拍照观察，并作病理生理学分析。
1.2.4 q-PCR检测目的基因转录水平
(1)称取50-100mg小鼠组织，加入1mLTrizol，使用剪刀将样品组织剪碎，然后用组织匀浆机进行匀浆(该操作全程在冰上进行)，充分匀浆后5000rpm离心10min，转移上清至新的EP管中；
(2)加入0.2mL氯仿溶液，使用涡旋振荡仪充分振荡混匀，于4℃离心机中13000rpm离心15min，离心完毕后吸取最上层水相至新的EP管中；
(3)加入和水相相同体积的异丙醇，枪头轻轻吹打混匀，室温放置10min，4℃离心机中13000rpm离心10min，去掉上清；
(4)向EP管中加入1mL 75％乙醇进行洗涤，充分混匀，4℃离心机中13000rpm离心10min，去掉上清，重复此操作两次；
(5)将沉淀于底部的RNA于室温下自然干燥20min，使酒精充分挥发；
(6)加入适量RNase-free water，55℃水浴15min促进RNA溶解；
(7)紫外吸收法测定RNA的浓度及纯度；
(8)逆转录体系的组成：
步骤1：(去除基因组DNA)
表2
Figure BDA0003682071900000121
42℃，2min，4℃。
步骤2：(逆转录)
表3
Figure BDA0003682071900000122
Step 1：37℃，15min；Step 2：85℃，5s；Step 3：4℃。
使用无核酶水将cDNA进行3倍稀释，立即使用。
(9)以逆转录所得cDNA为模板进行q-PCR反应。
q-PCR的反应体系，如下表：
表4
Figure BDA0003682071900000123
每孔总反应体系为20.0μL。
反应程序：Stage 1：95℃，30s；Stage 2：(95℃，5s；60℃，34s)40个循环；Stage3：(95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s)。整个q-PCR过程历时约71min。
表5引物序列
Figure BDA0003682071900000131
1.2.5酶联免疫吸附试验(ELISA)
(1)将组织样本从-80℃冰箱取出，放到冰上解冻以防样本变质。
(2)组织匀浆：将组织加入适量PBS后用解剖剪剪碎，再用组织匀浆机于冰上充分匀浆，4000rpm离心15min取上清备用。
(3)从铝箔袋中取出所需板条，室温平衡60min备用，剩余板条用自封袋密封放回4℃；
(4)根据实验需求确定标准孔及样本孔，标准孔分别加入不同浓度的标准品溶液50μL；
(5)吸取待测样本溶液10μL加入样本孔中，之后加入样本稀释液40μL；
(6)每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，将封板膜覆盖于反应孔表面以防污染，37℃恒温箱孵育60min；
(7)弃去孔中液体，于吸水纸上将液体拍干，每孔加入350μL预先配置好的洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复此操作5次；
(8)每孔加入底物A、B溶液各50μL，于37℃恒温箱避光孵育15min；
(9)每孔加入终止液50μL，15min内使用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定各孔的OD值。
1.2.6 Western-blot检测目的蛋白表达水平
1.2.6.1小鼠组织蛋白提取
(1)组织用含1mM PMSF的预冷无菌去离子水清洗3次；
(2)按50mg组织加1mL裂解缓冲液的比例加入适量裂解缓冲液RIPA和蛋白酶抑制剂cocktail，在冰上使用匀浆机将组织充分匀浆；
(3)放冰上静置直至无明显泡沫后，将液体全部转移至新的EP管中；
(4)振荡10s，静置15min，此过程重复3-4次；
(5)4℃，13000rpm离心10min；
(6)将上清分装至新的EP管中，-80℃冰箱保存。
1.2.6.2蛋白免疫印迹
(1)配制SDS-PAGE凝胶；
(2)样品处理：提取的蛋白样品按照4：1的比例加入5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，使蛋白充分变性；
(3)电泳：待蛋白样品冷却至室温后，直接加样至凝胶上样孔。所有样品上样完毕后开始电泳，其中浓缩胶使用低电压恒压电泳(40V)，分离胶使用高电压恒压电泳(80V)，电泳时长则根据目标蛋白分子量大小进行调整；
(4)转膜：Western实验中选用PVDF膜。湿转，一般情况下以110V恒定电压转膜，时长70min(具体时间根据目的蛋白的大小而定)。全程冰浴；
(5)封闭：转膜完毕后，剪取所需条带于5％脱脂乳中进行封闭，室温状态下封闭90min；
(6)一抗孵育：在膜上添加稀释的一抗，4℃条件下摇床振荡过夜；
(7)二抗孵育：回收一抗，TBST洗涤3次，每次5-10min，加入稀释的二抗，室温孵育1h。之后使用TBST洗涤3次，每次5-10min；
(8)显影：避光配制显色液，曝光。
1.2.7高通量测序分析肠道菌群变化
1.2.7.1肠道微生物基因组DNA提取
(1)向小鼠粪便中加入3mL无菌PBS，用枪头吹打混匀制成悬液；
(2)室温静置5min，将上清吸取至新的离心管中；
(3)将上述溶液600rpm离心3min，若溶液未澄清则继续600rpm离心3min，吸取上清；
(4)使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒进行小鼠粪便基因组DNA提取。并通过分光光度计在230nm(A230)和260nm(A260)处测定DNA的浓度和纯度。
1.2.7.2 q-PCR检测肠道菌群变化
利用2.2.7.1中所提取的基因组DNA为模板，进行q-PCR检测，使用SYBR GreenMaster mix和515F/806R扩增每个样品中16s rDNA基因的V4区域，所用引物为：(515F，5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R，5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3')。PCR程序如下：Stage 1：98℃，2min；Stage 2：(98℃，15s、55℃，30s、72℃，30s)，30个循环。
1.2.7.3肠道菌群高通量测序分析
通过上海派森诺公司的高通量测序平台测定出扩增产物的序列，依据测序序列的相似性，将序列相似(一般采用97％的相似度)的reads划分到同一个OTUs(分类操作单元)中，统计各个样品OTUs分布情况及每个OTU中含有序列的数目。
1.3统计学分析
所有体内外实验重复三次以上，实验结果以均值±标准差表示，组间差异采用Student's t检验进行比较。统计学计算采用GraphPad Prism软件进行，其中P值<0.05表示两组数值之间具有显著差异，P值<0.01表示两组数值之间具有极显著差异。
2、结果与分析
2.1结直肠癌的造模
由湖南斯莱克景达公司购买72只8周龄C57BL/6雄性小鼠，随机将小鼠进行分组，12只为空白对照组，60只为AOM/DSS诱导结直肠癌组。将10mg/kg AOM溶解于无菌生理盐水，在第1天和第19天各给予小鼠腹腔注射一次；配置1％DSS，在第7天、第19天和第31天给小鼠自由饮用，每次为期5天，其余时间则给予常规水饮用，约三个月后随机挑选小鼠解剖后观察肿瘤形成情况，如图1A所示，结肠部位出现疑似肿瘤。同时对样本进行HE染色以检测病理情况，如图1B所示，与正常结肠组织相比，造模小鼠的结肠组织在组织学形态上发生明显变化，具体表现为靠近黏膜下层部位腺体数量的增多，腺体向腔内异型的增生并伴随黏膜层上绒毛的脱离。以上结果均可证明结直肠癌模型的成功建立。
2.2结直肠癌给药预防和顺铂化疗对小鼠体重和呕吐行为的影响
将结直肠癌小鼠随机均分，分别为正常组(C组)、结直肠癌模型组(M1组)、结直肠癌顺铂化疗组(M2组)、结直肠癌顺铂化疗+酪酸梭菌预防组(L组)、结直肠癌顺铂化疗+沙利度胺预防组(S组)、结直肠癌顺铂化疗+沙利度胺+酪酸梭菌预防组(SL组)。给药期间，每隔1周对小鼠称重一次。如图2A所示，对照组、结直肠癌模型组、结直肠癌顺铂化疗组、沙利度胺预防组、酪酸梭菌预防组以及联合给药组的小鼠平均体重为30.9g、28.9g、24.0g、25.9g、24.5g、27.4g。与对照组相比，结直肠癌小鼠和结直肠癌化疗小鼠体重明显下降，而给予沙利度胺和酪酸梭菌预防的小鼠体重下降程度较轻，表明沙利度胺和酪酸梭菌缓解了结直肠癌顺铂化疗小鼠体质量的下降。
小鼠摄食高岭土行为被认为相当于人类的恶心呕吐。我们为了研究沙利度胺、酪酸梭菌以及联合给药对结直肠癌顺铂化疗所引起的恶心呕吐的影响，对化疗24h后各组小鼠高岭土摄食含量进行称重检测，每隔24h检测一次，连续三次(1day、2day、3day)，每组随机选三只小鼠计算相对摄食量(％)，并计算平均值，结果见表6和图2B。
表6各组小鼠的高岭土平均相对摄食量(％)
时间 1day 2day
C 1.22 0.74
M1 1.97 0.91
M2 10.17 6.03
S 3.77 2.41
L 8.72 4.67
SL 1.35 0.78
结果显示，与空白对照组和结直肠癌组相比，顺铂化疗明显诱导小鼠摄食高岭土，摄食占比达到10.17％，而单纯酪酸梭菌(L)、沙利度胺预防(S)和沙利度胺与酪酸梭菌的联合预防再化疗组(SL)小鼠的高岭土摄食比明显下降，分别为8.7％、3.8％和1.3％(p<0.05)，表明沙利度胺和酪酸梭菌缓解了顺铂化疗导致的恶心呕吐。
2.3顺铂、沙利度胺和酪酸梭菌通过促进caspase-3凋亡途径发挥抗肿瘤效应
为检测顺铂、沙利度胺和酪酸梭菌对肿瘤的影响，解剖各组小鼠并观察统计除对照组以外各组小鼠结肠上的肿瘤数量，每组各统计小鼠11只，编号为1～11，结果见表7和图3A。
按照如下公式计算实验组：S、L、SL组三组的相对肿瘤抑制率：
抑制率(％)＝(M2组-实验组)/M2组
表7各组小鼠结肠上的肿瘤数量
Figure BDA0003682071900000171
结果显示，各组小鼠结直肠上肿瘤数平均分别为3.64、2.91、2.36、2.45和1.82个。表明，顺铂能抑制肿瘤的发生，沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合给药增强这种抑制作用，其中两药联用的抑制肿瘤发生的效果最显著。
结直肠癌肿瘤COX2高表达，调控下游凋亡相关蛋白的表达，从而和肿瘤发生发展密切相关。为了研究顺铂、沙利度胺和酪酸梭菌对肿瘤的抑制作用，我们通过Western-blot检测肿瘤相关蛋白的表达水平(图3B,C)，与M2组相比，顺铂降低了COX2表达水平，而增加了凋亡执行蛋白Cleaved-caspase-3，同时减少了DNA修复酶Cleaved-PARP，沙利度胺和酪酸梭菌联用组明显增加了这种效果，证明沙利度胺和酪酸梭菌联用进一步增强凋亡水平、抑制COX2的表达。
2.4沙利度胺和酪酸梭菌联用通过减少小鼠脑和结肠中5-HT和SP而抑制脑最后区Fos蛋白的表达
为了进一步证实小鼠呕吐行为的诱因，对小鼠脑部最后区(AP)，即催吐化学感受区所在位置，进行Fos蛋白免疫组化染色(图4)。结果显示，对照组和结直肠癌组几乎不表达Fos蛋白，而顺铂化疗组小鼠AP区表达Fos蛋白(p<0.05)，表明顺铂诱导结直肠癌呕吐模型建立成功。单独沙利度胺预防以及联合酪酸梭菌预防都能使得Fos蛋白表达减少，但是联合组效果最佳，几乎完全消除Fos蛋白的表达，证实了沙利度胺和酪酸梭菌减少顺铂化疗导致的呕吐。
化疗导致的恶心呕吐和大脑内神经递质的异常上调密切相关。为阐明其改善恶心呕吐具体的机制，我们分别用ELISA和q-PCR方法检测了各组小鼠大脑内神经递质5-HT和P物质(SP)表达量，每组中的编号1、2、3分别代表三只小鼠的检测结果，结果见表8～表9和图5A。
相对抑制效果(抑制率％)＝(M2组-实验组)/M2组
表8脑中神经递质5-HT的相对表达
Figure BDA0003682071900000181
表9脑中神经递质SP的相对表达
Figure BDA0003682071900000182
结果显示，与空白对照组相比，结直肠癌小鼠大脑内神经递质轻微提高，而在顺铂化疗后5-HT和SP表达量显著升高，分别为0.967ng/mg和5.4，沙利度胺和酪酸梭菌预防的小鼠为0.61ng/mg和2.7，表明沙利度胺和酪酸梭菌可能通过减少顺铂诱导的大脑神经递质增加而缓解呕吐。
顺铂会损伤肠道从而分泌大量的神经递质，尤其肠嗜铬细胞受损会大量释放5-HT，通过中枢机制和外周机制导致呕吐的发生。因此为了进一步研究机制，我们也用ELISA和q-PCR方法检测了各组小鼠结肠内相关神经递质表达量，结果见表10～表11和图5B，每组中编号1、2、3分别代表三只小鼠的检测结果。
表10结肠中神经递质5-HT的相对表达量
Figure BDA0003682071900000191
表11结肠中神经递质SP的相对表达量(SP,Fold change of mRNA)
Figure BDA0003682071900000192
结果显示，与空白对照组和结直肠癌组比，顺铂化疗后结肠中5-HT含量明显增多，为1.17ng/mg(p<0.05),沙利度胺和酪酸梭菌联用组为0.62ng/mg，与M2组相比显著降低(p<0.05)。M2组小鼠结肠中SP也比空白对照组显著增加，为它的2.84倍。而SL组是空白对照组的1.09倍，明显比M2组减少(p<0.05)。这些结果表明沙利度胺和酪酸梭菌通过下调结肠中神经递质5-HT和SP的表达量从而减少呕吐的发生。
2.5沙利度胺和酪酸梭菌联用通过减少小鼠脑部最后区的5-HT3R和NK-1R而辅助抑制恶心呕吐
脑部神经递质只有和相应受体结合才引起呕吐的发生。为了进一步研究其机制，也通过免疫组织化学染色检测了小鼠脑部最后区的神经递质受体5-HT3R和NK-1R表达，结果显示(图6)结直肠癌组和对照组小鼠表达量无差异且较少，而顺铂化疗后的小鼠则表达异常增多，沙利度胺联合酪酸梭菌预防能使其表达明显减少，表明沙利度胺联合酪酸梭菌通过减少小鼠最后区5-HT3R和NK-1R异常表达而缓解呕吐的程度。
2.6沙利度胺和酪酸梭菌联用逆转了失调的肠道菌群
肠道菌群和结直肠癌以及顺铂化疗所致呕吐发生发展密切相关。为了进一步明确肠道菌群所起的作用，我们通过16s rRNA高通量测序对小鼠粪便菌群进行分析。结果如图7，与对照组相比，结直肠癌组Shannon指数降低，顺铂化疗后进一步减少，而在沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合预防得到明显上调(图7A)，表明结直肠癌小鼠和结直肠癌顺铂化疗小鼠肠道菌群α多样性降低，而沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合给药逆转了α多样性降低；主成分分析结果显示(图7B)，与空白对照组相比，M1组小鼠β多样性明显改变，顺铂化疗后进一步改变，在沙利度胺、酪酸梭菌以及两者联合预防后减小了这种改变。花瓣图(图7C)显示C、M1、M2、S、L、SL组小鼠肠道菌有304个相同OTU，分别特有1201、994、638、690、1115和871个OTU；门水平物种丰度图(图7D)显示在各组小鼠中丰度数排前4的菌为Firmicutes、Bacteroidetes、Verrucomicrobia、Proteobacteria，分别为C(0.46681091vs.0.33515801vs.0.00829602vs.0.02967895)、M1(0.37355245vs.0.23907689vs.0.30124516vs.0.05527001)、M2(0.31521483vs.0.32368322vs.0.2797991vs.0.04764673)、S(0.47933277vs.0.3078068vs.0.11390111vs.0.0735736)、L(0.55453136vs.0.3566965vs.0.00499472vs.0.06839404)、SL(0.56950269vs.0.35464367vs.0.00287895vs.0.04692346)。属水平物种丰度图也类似(图7E)，表明结直肠癌小鼠和结直肠癌顺铂化疗小鼠肠道菌群结构改变，而沙利度胺和酪酸梭菌联合给药预防减少了它的改变。
为了进一步研究肠道微生物对结直肠癌、顺铂化疗所致呕吐的影响，我们挑出一些和结直肠癌以及顺铂化疗呕吐改善密切相关的益生菌。结果显示，与M2组比，L组和SL组小鼠肠道中酪酸梭菌所隶属的梭菌属、硬壁菌门丰度升高(图8B,F)，暗示可能由于酪酸梭菌提高了它们的丰度。结直肠癌化疗后益生菌科水平和属水平的双歧杆菌、乳酸杆菌丰度明显减少，而沙利度胺和酪酸梭菌联合给药预防乳酸杆菌明显上调，双歧杆菌轻微上调(图8C,E,G,I)，表明沙利度胺和酪酸梭菌联合给药促进了益生菌的上调，恢复了结直肠癌化疗导致的菌群紊乱。与M1组比，酪酸梭菌和沙利度胺联合预防上调了Ruminococcaceae和Ruminococcus；与S组比，酪酸梭菌显著上调了Ruminococcaceae(图8D,H)，这些是能产生抗癌SCFA的菌，表明酪酸梭菌抗癌可能是通过提高Ruminococcaceae和Ruminococcus的丰度。
2.7沙利度胺和酪酸梭菌联用改善了结肠炎症和受损的结肠屏障
结直肠癌顺铂化疗会导致结肠发生炎症和肠屏障的破坏，与疾病进展相关。因此我们对结肠行HE染色检测各组小鼠肠道炎症情况(图9A)，与正常组比，结直肠癌组和顺铂化疗组结肠隐窝消失，有较多炎性细胞浸润，而酪酸梭菌和沙利度胺预防则恢复了正常的结肠结构，隐窝恢复，炎性细胞明显减少，表明酪酸梭菌和沙利度胺减少了结直肠癌顺铂导致的肠道炎症(图9B)。为了进一步证实这点，我们也通过q-PCR对结肠促炎因子进行检测，与正常组相比，M2组TNF-α、IL-6和IL-1β明显提高，分别为7.3、11.2和9.3，而SL组为1.1、2.9和2.3，证实酪酸梭菌和沙利度胺减少了结直肠癌顺铂导致的肠道炎症。
结直肠癌顺铂化疗导致的炎症和p65等炎症相关蛋白上调相关，酪酸梭菌分泌的丁酸能抑制HDAC1活性从而抑制p65信号然后引起炎症的减少，因此为了进一步研究沙利度胺和酪酸梭菌改善炎症的机制，我们通过Westernblot检测了结肠中炎症相关蛋白(图10A,B)，结果显示与M2组比，L组和SL组TLR4、MyD88、p-p65和HDAC1都明显减少，表明酪酸梭菌抑制HDAC1活性从而抑制p65信号然后引起结肠炎症的减少，从而保护了受损的结肠以至改善了化疗所致呕吐。
肠道炎症和肠道屏障破坏经常伴随发生，因此我们进一步通过Western blot对肠道屏障相关蛋白进行检测(图11A,B)，结果显示与C组比，M2组Occludin表达明显减少，而SL组则明显逆转了这一过程，表明沙利度胺和酪酸梭菌改善了结直肠癌造模以及顺铂化疗导致的肠道屏障破坏。Trek1蛋白具有保护肠道屏障作用，我们也通过Westernblot对各组小鼠结肠检测了Trek1表达，结果与屏障蛋白Occludin趋势一致，表明沙利度胺和酪酸梭菌通过上调Trek1表达改善了结直肠癌造模以及顺铂化疗导致的肠道屏障破坏，从而对化疗导致的呕吐起保护作用。
综上所述，沙利度胺和酪酸梭菌联用比单独使用沙利度胺预防更好改善顺铂导致的恶心呕吐行为，减少脑部Fos表达，可能是通过调节肠道菌群，增加益生菌和产抗癌SCFA菌丰度，通过上调Trek1修复肠黏膜，通过下调p-p65改善结肠炎症，减少结肠和脑部最后区神经递质5-HT和SP以及脑部最后区相应受体表达所致。
2.8沙利度胺联合其他益生菌对结直肠癌顺铂化疗所引起的恶心呕吐的治疗效果的研究
2.8.1各组小鼠高岭土摄食含量变化的比较
如图12-A中显示，与空白对照组和结直肠癌组相比，顺铂化疗明显诱导小鼠摄食高岭土，而单纯酪酸梭菌、沙利度胺预防和沙利度胺与酪酸梭菌的联合预防再化疗组小鼠的高岭土摄食比明显下降，但下降程度有较大差别，可以看出，沙利度胺联合酪酸梭菌CGMCC0313.1组(SL组)小鼠的高岭土摄食含量相比结直肠癌化疗组(M2组)有明显的下降，且两组有显著性差异(P＜0.01)；而沙利度胺联合其他益生菌组的小鼠高岭土摄食含量相比模型组(M2)虽然有下降，但无差异性。此外，其余各益生菌联合沙利度胺组的小鼠高岭土摄食含量下降程度也比SL组要低，表明沙利度胺联合酪酸梭菌CGMCC0313.1是最有效的一种缓解顺铂化疗导致的恶心呕吐的联合治疗方案。
2.8.2小鼠结肠上肿瘤数量的变化
解剖小鼠并观察统计除对照组以外各组小鼠结肠上的肿瘤数量，如图12-B所示，沙利度胺联合酪酸梭菌(SL)组小鼠结肠上肿瘤数量相比结直肠癌小鼠及放化疗的结直肠癌小鼠组，都有显著的减少(P＜0.01)；而沙利度胺联合其他益生菌组小鼠的结肠上肿瘤数量相比模型组或没有减少(SS组)或减少程度无差异性(SZ、SQ组)，且SZ、SQ组减少的程度远不如SL组。从以上结果可以看出，顺铂能抑制肿瘤的发生，而沙利度胺、酪酸梭菌CGMCC0313.1、以及两者联合给药及沙利度胺联和植物乳杆菌ATCC 8014和青春双歧杆菌ATCC15703均能增强这种抑制作用，而沙利度胺联合嗜酸乳杆菌CICC 6074对肿瘤不能增强这种抑制作用。进一步说明，沙利度胺并不是联合任何一种一种益生菌都能增强对肿瘤的抑制作用，不同益生菌与沙利度胺的联合效果不同，其中沙利度胺联合酪酸梭菌CGMCc0313.1这种联合给药的方式抑制肿瘤发生效果最显著。
2.8.3小鼠脑部神经递质5-HT的变化
如图12-C说所示，相比正常小鼠，结直肠癌小鼠及放化疗后小鼠脑部神经递质5-HT的含量均会上升，而给予不同干预措施后，小鼠脑部5-HT有不同程度的降低，经比较可以看出，沙利度胺联合酪酸梭菌组(SL)相比结直肠癌放化疗组小鼠(M2)脑部5-HT有显著降低(P＜0.01)，且相比于单纯用沙利度胺治疗的小鼠，联合酪酸梭菌后(SL)的小鼠脑部5-HT下降的程度有差异性(p＜0.05)；此外，相比于沙利度胺联合植物乳杆菌组(SZ)，沙利度胺联合酪酸梭菌组(SL)小鼠脑部5-HT下降程度也有一定的差异性(p＜0.01)。以上结果均说明，不同益生菌与沙利度胺联合后对结直肠癌放化疗后小鼠脑部5-HT的干预程度不同，其中，沙利度胺联合酪酸梭菌CGMCC0313.1的干预效果最佳。
2.8.4小鼠脑部神经递质SP的变化
如图12-D所示，相比正常小鼠，结直肠癌小鼠及放化疗后小鼠脑部神经递质SP的含量均会上升，而给予不同干预措施后，小鼠脑部SP有不同程度的降低，经比较可以看出，沙利度胺联合酪酸梭菌组(SL)相比结直肠癌放化疗组小鼠(M2)脑部SP有显著降低(P＜0.01)，且相比于单纯用沙利度胺治疗的小鼠，联合酪酸梭菌后(SL)的小鼠脑部SP下降的程度有差异性(p＜0.05)；此外，相比于沙利度胺联合青春双歧杆菌组(SQ)，沙利度胺联合酪酸梭菌组(SL)小鼠脑部SP下降程度也有一定的差异性(p＜0.01)。以上结果均说明，不同益生菌与沙利度胺联合后对结直肠癌放化疗后小鼠脑部SP的干预程度不同，且沙利度胺联合酪酸梭菌CGMCC0313.1的干预效果最佳。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的呕吐恶心的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、喉癌、食道癌、淋巴癌中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗和/或预防放化疗引起的呕吐恶心包括：抑制神经递质5-HT、SP的表达水平、抑制脑最后区受体5-HT3R和NK-1受体激活、改善肠道炎症、调节肠道菌群中的至少一种。
4.酪酸梭菌和沙利度胺联用在制备用于增强化疗药物抗肿瘤作用的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述增强化疗药物抗肿瘤作用包括：减少肿瘤数量、抑制肿瘤大小、下调COX2表达、上调凋亡执行蛋白cleaved-caspase-3、减少DNA修复酶Cleaved-PARP中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述化疗药物为顺铂、依托泊苷、替尼泊苷、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、喉癌、食道癌、淋巴癌中的一种或几种。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述酪酸梭菌为保藏编号为CGMCC0313.1的菌株。
9.一种治疗和/或预防肿瘤放化疗引起的呕吐恶心的组合物，其特征在于，包括酪酸梭菌和沙利度胺。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述酪酸梭菌为保藏编号为CGMCC0313.1的菌株。
11.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包括权利要求9或10所述的组合物和化疗药物。
12.根据权利要求11所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述化疗药物为顺铂、依托泊苷、替尼泊苷、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、阿克拉霉素、高三尖杉酯碱、甲氨蝶呤、长春新碱、长春地辛中的一种或多种。
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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070208057A1 (en) * 2003-11-06 2007-09-06 Zeldis Jerome B Methods And Compositions Using Thalidomide For The Treatment And Management Of Cancers And Other Diseases
CN107613993A (zh) * 2015-03-27 2018-01-19 南克维斯特公司 与癌症药物的联合治疗中的nk‑92细胞
CN107771083A (zh) * 2015-04-23 2018-03-06 卡莱多生物科技有限公司 聚糖治疗剂和治疗方法
CN108378370A (zh) * 2018-02-02 2018-08-10 云南中京国建投资有限公司 一种合生元组合物及其制剂与应用
CN109771445A (zh) * 2019-03-20 2019-05-21 青岛东海药业有限公司 酪酸梭菌在制备诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏制剂中的应用
US20190358288A1 (en) * 2017-02-10 2019-11-28 Innovate Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing environmental enteropathy
CN111991566A (zh) * 2020-08-25 2020-11-27 山西白求恩医院(山西医学科学院) 基于pep-t节拍的非霍奇金b细胞淋巴瘤的评价方法
CN112203669A (zh) * 2018-02-23 2021-01-08 克雷斯顿沃控股公司 微生物组相关的免疫疗法
CN114366790A (zh) * 2022-01-27 2022-04-19 冯利 防治肿瘤及治疗后食欲减退和胃肠道反应的中药组合物
WO2022115646A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Seres Therapeutics, Inc. Designed bacterial compositions for treating graft-versus-host-disease

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070208057A1 (en) * 2003-11-06 2007-09-06 Zeldis Jerome B Methods And Compositions Using Thalidomide For The Treatment And Management Of Cancers And Other Diseases
CN107613993A (zh) * 2015-03-27 2018-01-19 南克维斯特公司 与癌症药物的联合治疗中的nk‑92细胞
CN107771083A (zh) * 2015-04-23 2018-03-06 卡莱多生物科技有限公司 聚糖治疗剂和治疗方法
US20190358288A1 (en) * 2017-02-10 2019-11-28 Innovate Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing environmental enteropathy
CN108378370A (zh) * 2018-02-02 2018-08-10 云南中京国建投资有限公司 一种合生元组合物及其制剂与应用
CN112203669A (zh) * 2018-02-23 2021-01-08 克雷斯顿沃控股公司 微生物组相关的免疫疗法
CN109771445A (zh) * 2019-03-20 2019-05-21 青岛东海药业有限公司 酪酸梭菌在制备诱导抗肿瘤免疫及免疫检查点抑制剂增敏制剂中的应用
CN111991566A (zh) * 2020-08-25 2020-11-27 山西白求恩医院(山西医学科学院) 基于pep-t节拍的非霍奇金b细胞淋巴瘤的评价方法
WO2022115646A1 (en) * 2020-11-25 2022-06-02 Seres Therapeutics, Inc. Designed bacterial compositions for treating graft-versus-host-disease
CN114366790A (zh) * 2022-01-27 2022-04-19 冯利 防治肿瘤及治疗后食欲减退和胃肠道反应的中药组合物

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NAN WANG ET AL.: "Efficacy and Safety of Thalidomide for Chemotherapy-induced Nausea and Vomiting", 《JOURNAL OF CANCER》, vol. 11, pages 4560 - 4570 *
XUANQI ZHAO ET AL.: "Combination of thalidomide and Clostridium butyricum relieves chemotherapy-induced nausea and vomiting via gut microbiota and vagus nerve activity modulation", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》, vol. 14, pages 1 - 13 *
李杨: "沙利度胺联合常规化疗方案治疗晚期胃癌患者 肿瘤学效果及不良反应观察", 《医药论坛杂志》, vol. 41, no. 6, pages 133 - 136 *

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