CN117860788A - 柚皮苷联合益生菌制剂及其在制备治疗卵巢癌的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及柚皮苷联合益生菌制剂及其在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。在本发明中，将柚皮苷和益生菌共同应用于制备治疗卵巢癌的药物，利用柚皮苷和益生菌的协同作用逆转卵巢癌细胞对铂类抗肿瘤药物的耐药性，从而提高铂类抗肿瘤药物治疗卵巢癌的效果。

Description

柚皮苷联合益生菌制剂及其在制备治疗卵巢癌的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及柚皮苷联合益生菌制剂及其在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

背景技术

卵巢癌（Ovarian cancer，OC）年发病率居女性生殖系统肿瘤第3位，而病死率位于女性生殖道恶性肿瘤之首，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。卵巢癌可分为四个分子亚型（分化型、增殖型、免疫激活型和间质型）；亚型间不仅肿瘤微环境各不相同，而且在耐药性和预后方面也存在较大的差异。

由于卵巢癌一旦发现就已是中晚期，大部分患者都需辅助化疗，而铂类抗肿瘤药物是不可或缺的化疗药物之一。铂类抗肿瘤药物存在两大局限性，即毒性反应以及肿瘤耐药性的产生。顺铂（cisplatin，DDP）是最好也是最早的基于金属的化疗药物之一，耐顺铂的卵巢癌患者和晚期卵巢癌患者的治疗抑制是个棘手的问题，并且在化疗的过程中其5年生存率<35%，且再次化疗的效果差。通常导致顺铂耐药的机制可分为四类：药物摄取减少、DNA修复增加、凋亡途径缺陷、促生存途径激活或促进细胞死亡的途径抑制。目前对抗癌药物胃肠道毒性的副作用的产生机制并不十分清楚，卵巢癌细胞耐药性问题仍有待进一步研究。

发明内容

基于此，本发明提供柚皮苷联合益生菌制剂及其在制备治疗卵巢癌的药物中的应用，至少解决现有技术中的一个问题。

第一方面，本发明提供一种柚皮苷联合益生菌制剂，其包括注射剂和口服剂，所述注射剂含有柚皮苷和铂类抗卵巢癌药物，所述口服剂含有益生菌。

在一些优选的实施方式中，所述益生菌为动物双歧杆菌。

在一些更优选的实施方式中，所述动物双歧杆菌为Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01。

在一些优选的实施方式中，所述铂类抗卵巢癌药物为顺铂。

在一些优选的实施方式中，所述口服剂还包括药学上可接受的辅料。

在一些更优选的实施方式中，所述药学上可接受的辅料为明胶、生理盐水中的至少一种。例如，所述药学上可接受的辅料为质量浓度为0.01%明胶生理盐水。

在一些优选的实施方式中，所述柚皮苷、顺铂的质量比例为2:2.5。

在一些优选的实施方式中，所述益生菌的浓度为10⁹CFU/mL。

第二方面，本发明提供所述柚皮苷联合益生菌制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

在本发明中，将柚皮苷和益生菌共同应用于制备治疗卵巢癌的药物，利用柚皮苷和益生菌的协同作用逆转卵巢癌细胞对铂类抗肿瘤药物的耐药性，从而提高铂类抗肿瘤药物治疗卵巢癌的效果。

由于采用了以上技术方案，本发明的实施例至少具有以下有益效果：联合使用柚皮苷和益生菌，通过体内p38MAPK信号通路抑制了肿瘤细胞的增殖并且逆转卵巢癌细胞对铂类抗肿瘤药物的耐药性，提高铂类抗肿瘤药物治疗卵巢癌的效果。

附图说明

图1显示了本发明实施例1小鼠粪便中的细菌组成及群落构成。

图2显示了本发明实施例1的小鼠粪便中细菌组成的相似度。

图3为本发明实施例1的Venn图。

图4显示了本发明实施例1的门水平上的微生物群组成。

图5显示了本发明实施例1的门水平上Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia的相对丰度。

图6显示了本发明实施例1的属水平上的微生物群组成。

图7显示了本发明实施例1的属水平上Bacteroides、Parabacteroides的相对丰度。

图8显示了本发明实施例1的属水平上Odoribacter的相对丰度。

图9显示了本发明实施例1的属水平上Akkermansia、Prevotella的相对丰度。

图10为本发明实施例2的实验过程示意图。

图11为本发明实施例2小鼠肿瘤的照片。

图12显示了本发明实施例2的小鼠肿瘤体积大小。

图13显示了本发明实施例2的肿瘤标志物CA125、HE4的表达量。

图14显示了本发明实施例2的肿瘤组织病理学的H&E染色和免疫组化Ki67的表达。

图15显示了本发明实施例2的不同药物对肿瘤组织相关蛋白的表达。

图16显示了本发明实施例2的肿瘤组织中p38、p-p38、ERCC1的相对表达。

图17显示了本发明实施例3的不同药物对结肠组织中炎症相关蛋白的表达。

图18显示了本发明实施例3的结肠组织中TLR4、MyD88、p65、p-p65的相对表达。

图19显示了本发明实施例3的结肠组织病理学的H&E染色。

图20显示了本发明实施例3的结肠组织中肠道通透性相关蛋白的表达。

图21显示了本发明实施例3的结肠组织中ZO-1、Occludin的相对表达。

图22显示了本发明实施例3的小鼠血清中炎症因子的相对表达量。

图23为本发明实施例4的小鼠粪便中Bifidobacterium animalis的相对丰富。

图24显示了本发明实施例4的小鼠粪便中Bacteroides acidifaciens、Parabacteroides gordonii、Parabacteroides distasonis、Odoribacter splanchnicus的相对丰度。

图25显示了本发明实施例4的小鼠粪便中Akkermansia muciniphila的相对丰度。

图26显示了本发明实施例4的小鼠粪便中Prevotella copri、Lactobacillus salivarius、Morganella morganii的相对丰度。

具体实施方式

以下将对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。

中药柚皮苷（Naringin，Nar）是一种双清黄酮类化合物，作为一类天然黄酮类，主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其变种的果皮中。中药柚皮苷可通过调控卵巢癌的多条信号通路，从而发挥抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制自噬降解、降低细胞侵袭迁移能力、逆转铂耐药性等作用。因此，发明人基于之前的研究（参考公开号为CN116999451 A专利文献），考虑到卵巢癌高致死性、铂类化疗药物的耐药作用及其胃肠道毒性反应，为了改善患者的生活质量，延长生存期，发明人对柚皮苷联合益生菌对人卵巢癌铂类化疗药的增敏作用及其机制进行研究，并发现了柚皮苷联合益生菌在逆转卵巢癌细胞对铂类抗肿瘤药物的耐药性中的效果。

实施例1：DDP及Nar对肠道微生物群的影响验证实验

为了验证化疗药物对卵巢癌症异种移植后小鼠肠道微生物的影响，通过收集小鼠的粪便进行16S rRNA高通量测序来分析粪便中的细菌组成及群落构成，具体如下。

1、免疫系统人源化小鼠模型的构建、饲养及鉴定

购买SPF级雌性裸鼠，小鼠体重18±2g，鼠龄4-5周龄，在SPF级屏障设施中饲养。饲养环境的温度维持在23±2 ℃，相对湿度维持在50%~60%，光照12 h/12 h正常明暗交替，小鼠笼盒、垫料、饲料及饮用水经过高温高压蒸汽灭菌处理，小鼠自由饮水、摄食。

采用 Ficoll 密度梯度离心法将人新鲜外周血中的淋巴细胞提取出来，具体步骤如下：

（1）配制所需的溶液：细胞培养基为RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；

（2）将获得的抗凝新鲜外周全血标本10ml转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；

（3）取四支15ml离心管，先加入5ml 人外周血淋巴细胞分离液，然后将稀释的血液轻轻加到四支离心管的分离液上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各5ml稀释血液；离心，2000 rpm，20 min；

（4）离心结束后，可以观察到从离心管底部到管口分为四层，红细胞比重最大，主要分布在离心管底部为第一层；接着是人淋巴细胞分离液层；第三层为淋巴细胞层，最上面一层为血浆层；用吸管将第三层白膜层即淋巴细胞层吸取在另一干净的15ml离心管中；

（5）向白膜层细胞管中加入10ml PBS洗涤白膜层细胞，离心，1500 rpm，10 min，20℃；弃掉上清液，再加入5mL的PBS重悬细胞，离心，1500 rpm，10 min，20 ℃，重复该步骤一次；

（6）弃上清后加入培养基重悬目的细胞，并计数及台盼蓝染色细胞活力检测；

（7）用 100 μL 移液器吸取 90 μL 分离的目的细胞悬液，转移至 1.5 ml 的无菌离心管中，再取 10 μL 0.4%台盼蓝溶液加入管中，吹打混匀，使其终浓度为 0.04 %，室温静置染色 3 - 5 min；

（8）利用细胞计数仪计数并显微镜下观察细胞存活情况，死细胞被台盼蓝染成蓝色，而活细胞不着色具有较强的折光性。

将分离的外周血T淋巴细胞以 8 × 10⁶/200 μL，通过尾静脉注射入裸鼠体内，具体操作步骤如下：

（1）选取 4 - 5 周龄雌性裸鼠，适应性饲养 1 周；

（2）用培养基将新鲜分离的 外周血T淋巴细胞重悬至浓度为 8 × 10⁶/ml，并在注射前短暂放置于冰上保存；

（3）使用 1 ml 无菌注射器吸取 200 μL PBL 悬液，经尾静脉注射入小鼠体内；

（4）监测小鼠各项指标的变化，如小鼠精神状态、饮食、活动力，有无皮疹等，并在整个研究过程中评估 GVHD 的产生。

人免疫系统重建2天后，通过剪鼠尾采集 100 - 200 μL，流式细胞仪检测小鼠外周血中的人源性CD3⁺T细胞，以证实人源化T细胞免疫重建。

2、建立荷耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株人源化小鼠皮下移植瘤模型

随机选取32只人源化小鼠，将200 μl A2780/DDP单细胞悬液缓慢注射至右前肢腋部皮肤下，注射部位可见一皮丘形成，观察注射部位有无细胞漏出确保成功接种瘤细胞。

3、动物实验分组及给药方案

将成瘤的32只人源化小鼠按照随机分配方法分为4组，分组后成瘤小鼠按以下方式进行给药：

（1）对照组（C组，只数=8）：0.9%氯化钠0.2ml，腹腔注射给药，每天给药一次，用药10天；

（2）模型组（M组，只数=8）：0.9%氯化钠0.2ml，腹腔注射给药，每天给药一次，用药10天；

（3）M+DDP治疗组（MD组，只数=8）：DDP 以2.5mg/kg/d腹腔注射给药，每日一次，给药10天；

（4）M+柚皮苷治疗组（MN组，只数=8）：2.0mg/kg/d 柚皮苷生理盐水稀释成终体积0.2ml，腹腔注射给药，每日一次，给药10天；

（5）M+柚皮苷+DDP治疗组（MND组，只数=8）：柚皮苷按2.0mg/kg/d 柚皮苷生理盐水稀释成终体积0.2ml，腹腔注射给药，每日一次，给药10天；DDP按2.5mg/kg/d剂量腹腔注射给药，每日一次，给药10天。

4、给药期间人源化小鼠观察

每天定期观察小鼠精神状态、活动、饮食、大小便等一般情况，查看移植瘤的大小、形态及表面皮肤色泽，是否有皮肤破溃。

按常规间隔两天用电子天平称称取小鼠的体重，用游标卡尺隔两天测量皮下移植瘤的最长径及最短径，并记录相关数据。皮下移植瘤体积（V）的计算公式：V（mm³）=瘤体的最长径（mm）×瘤体最短径²（mm²）×0.5。根据所得到的肿瘤体积绘制移植瘤生长曲线，横坐标为给药时间，纵坐标为肿瘤体积大小。

治疗10天后收集各组小鼠粪便于1.5ml EP 管中，迅速冻存于-80 ℃冰箱备用。

5、处死小鼠、取组织

于停药后第二天将小鼠称体重后，留取每组4-6只小鼠外周血0.2ml，4000 rpm，20min离心后吸出血清，标记好分组信息及日期，-80℃保存，备用。采用颈部脱臼法处死小鼠，观察腹腔成瘤位置，按照无菌操作摘取移植瘤，将瘤体完整剥离，游标卡尺对瘤体最短径（b）及最长径（a）进行测量，计重器称取瘤体湿重，计算抑瘤率；用无菌的0.9%氯化钠冲洗摘除的瘤体组织，按照实验分组拍照记录，称重各组小鼠皮下移植瘤的重量并记录。称重后，取各组实验组的瘤体组织固定于4%多聚甲醛溶液，做好分组标记并保存在-80 ℃冰箱备用。

收集每组小鼠结肠及结肠内粪便，用生理盐水冲洗将肠段内残留物冲洗干净，将收集的组织分为合适大小的两部分，其中一部分液氮速冻，-80 ℃超低温冰箱保存，用于WB实验和 q-PCR 实验，另一部分浸泡在装有多聚甲醛的离心管中，4℃ 冰箱保存，用于HE染色。

6、指标检测

用ELISA法检测各组小鼠血清中CA125、HE4等肿瘤标志物水平。光学显微镜下观察各移植瘤组织的病理形态学改变及记录结果。用Western Blot 检测各组人上皮性耐顺铂卵巢癌小鼠腹腔移植瘤组织中p38MAPK、p-p38MAPK、ERCC1蛋白的表达水平。

7、肠道菌群分析

各组荷瘤小鼠肠道高通量测序分析：提取的荷瘤小鼠粪便微生物基因组DNA进行测序，进行物种多样性分析及物种群落结构分析。

图1显示了小鼠粪便中的细菌组成及群落构成，Chao 1指数代表群落多样性，Shannon指数代表总物种，Pielou_e指数代表群落的均匀度。使用这些指标来评估Nar及DDP对肠道微生物群的α -和β -多样性的影响，结果显示，与M组相比，DDP降低了微生物的多样性，而Nar和DDP+Nar显著提高了肠道微生物多样性。

图2为群落组成相似度分析图，主坐标（PCoA）用于比较不同组别间的β -多样性，M组和MD组样品相互之间表现出一定程度的接近性，但与MND组仍有明显差异，这表明，化疗药物的使用极大的改变了β -多样性，将小鼠的肠道微生物群转变为与正常小鼠不相似的群落。

当使用Venn图方法进行分析时，发现在这5组中识别出20个公共OTU，C、M、Nar、DDP和DDP+Nar组中唯一的OTU分别为403、43、133、30和87个（图3）。

在门水平上，最占优势的两个门是Bacteroidetes和Firmicutes，与M组相比，MD组的Firmicutes/Bacteroidetes比值显著增高，但在MND组中该比值更接近于M组水平（图4和图5）。

在属水平上，发现OC小鼠包括经药物化疗后的小鼠粪便与C组相比分类组成有显著差异（图6）。

与C组相比，M组、MN组、MD组和MND组Bacteroides和Parabacteroides的相对丰度显著增加，且M组和MD组明显高于MND组（图7）；而在C组中相对丰度较高的Odoribacter在其余四组中都显著降低（图8），对于Akkermansia和Prevotella虽在C组中相对丰度比较低，但在各组小鼠的粪便中相对丰度表达都较少（图9）。

实施例2：Bifidobacterium animalis subsp. lactisNCU-01改善小鼠的肿瘤生长和病理损伤验证实验

为了评估益生菌对癌症的影响，在人源化卵巢癌裸鼠模型上再次进行实验，整个实验过程如图10所示。

1、建立荷耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株人源化小鼠皮下移植瘤模型

随机选取32只小鼠，将200μl A2780/DDP（人卵巢癌细胞顺铂耐药株）单细胞悬液缓慢注射至小鼠右前肢腋部皮肤下，注射部位可见一皮丘形成，观察注射部位有无细胞漏出确保成功接种瘤细胞，当肿瘤体积达到50mm³时，进行以下处理。

2、动物实验分组及给药

将成瘤的32只小鼠按照随机分配方法分为4组，分组后成瘤小鼠按以下方式进行给药：

（1）对照组（C组，只数=8）：0.01% 明胶生理盐水0.2ml，灌胃，每天给药一次，用药10天；

（2）模型组（M组，只数=8）：0.01% 明胶生理盐水0.2ml，灌胃，每天给药一次，用药10天；

（3）M+动物双歧杆菌治疗组（MP组，只数=8）：动物双歧杆菌 10⁹CFU/mL于0.01%明胶生理盐水中0.2ml，灌胃，每日给菌一次，持续10天；

（4）M+柚皮苷+DDP治疗组（MND组，只数=8）：柚皮苷按2.0mg/kg/d 柚皮苷生理盐水稀释成终体积0.2 ml，腹腔注射给药，每日一次，给药10天；DDP按2.5mg/kg/d剂量腹腔注射给药，每日一次，给药10天；

（5）M+柚皮苷+DDP+动物双歧杆菌治疗组（MNDP组，只数=8）：柚皮苷按2.0mg/kg/d柚皮苷生理盐水稀释成终体积0.2ml，腹腔注射给药，每日一次，给药10天；DDP按2.5mg/kg/d剂量腹腔注射给药，每日一次，给药10天；动物双歧杆菌 10⁹CFU/mL于0.01%明胶生理盐水中 0.2ml灌胃，每日给菌一次，持续10天；

其中，动物双歧杆菌均为Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01，该菌种由南昌大学转化医学实验室从百岁老人粪便中鉴定并分离出，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26494，保藏日期为2023年1月18日。

3、给药期间小鼠观察

每天定期观察小鼠精神状态、活动、饮食、大小便等一般情况，查看移植瘤的大小、形态及表面皮肤色泽，是否有皮肤破溃。

按常规间隔两天用电子天平称称取小鼠的体重，用游标卡尺隔两天测量皮下移植瘤的最长径及最短径，并记录相关数据。皮下移植瘤体积（V）的计算公式：V（mm³）=瘤体的最长径（mm）×瘤体最短径²（mm²）×0.5。根据所得到的肿瘤体积绘制移植瘤生长曲线，横坐标为给药时间，纵坐标为肿瘤体积大小。

治疗10天后收集各组裸鼠粪便于1.5ml EP 管中，迅速冻存于-80℃冰箱备用。

4、处死小鼠、取组织

于停药后第二天将小鼠称体重后，留取每组4-6只小鼠外周血0.2 ml，4000 rpm，20 min离心后吸出血清，标记好分组信息及日期，-80 ℃保存，备用。采用颈部脱臼法处死小鼠，观察腹腔成瘤位置，按照无菌操作摘取移植瘤，将瘤体完整剥离，用无菌的0.9%氯化钠冲洗摘除的瘤体组织，按照实验分组拍照记录，称重各组裸鼠皮下移植瘤的重量并记录。称重后，取各组实验组的瘤体组织固定于4%多聚甲醛溶液，做好分组标记并保存在-80 ℃冰箱备用。

收集每组小鼠移植瘤、结肠及结肠内粪便，用生理盐水冲洗将肠段内残留物冲洗干净，将收集的组织分为合适大小的两部分，其中一部分液氮速冻，-80 ℃超低温冰箱保存，用于 WB 实验和 q-PCR 实验，另一部分浸泡在装有多聚甲醛的离心管中，4 ℃冰箱保存，用于HE染色。

5、指标检测

各组小鼠血清中炎症因子（IL-1β、IL-6及TNF-α），用ELISA法检测各组裸鼠血清中CA125、HE4等肿瘤标志物水平。光学显微镜下观察各移植瘤组织的病理形态学改变，观察各组小鼠肠粘膜损伤情况。Western-blot检测荷瘤小鼠肠道炎症相关蛋白（TLR4、MyD88、NF-kB及p-NF-kB）及肠粘膜屏障蛋白（claudin-1, occludin以及ZO-1）的表达。

6、肠道菌群分析

各组荷瘤小鼠肠道微生物DNA基因组的提取：

（1）向粪便样本中添加3 ml 无菌PBS，吹打震荡混匀；

（2）放置室温静置5 min，弃上清，添加2 ml无菌PBS至沉淀中，静置取上清；600rpm 离心上清 3-5 min，至溶液不再浑浊时吸取上清1 ml；

（3）8000 rpm 离心上清 2 min，弃上清，加200 μL GA，震荡悬浮菌体，添加20μL的蛋白酶K，继续混匀；

（4）在上述悬浮液中加入0.2 g玻璃珠与200 μL GB，震荡混匀，水浴10min；

（5）继续添加200μL的无水乙醇，震荡混匀，小心吸取上清液至吸附柱中，不要吸到玻璃珠，25 ℃条件下10000 rpm 离心1 min，弃去废液；

（6）加600μL PW，25℃条件下 10000 rpm离心1 min，弃去废液；

（7）重复上一步；

（8）25℃条件下10000 rpm 离心2 min，取出吸附柱置新1.5ml EP中敞口风干15-20 min；

（9）滴加40μL洗脱液在吸附柱中的吸附膜中央，25℃条件下放置2 min，随后25℃条件下10000 rpm 离心2 min；

（10）将收集到的溶液重新吸入到吸附膜中间位置，25℃条件下10000 rpm 离心2min，以获得高浓度基因组DNA。

7、各组荷瘤小鼠肠道菌群分析

提取的荷瘤小鼠粪便微生物基因组DNA进行Q-PCR，测定每组小鼠中肠道微生物的组成及变化。

肿瘤大小如图11和图12所示，表明Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01灌胃改善了肿瘤生长，与其他两个单用化疗药物及益生菌治疗组相比，肿瘤体积明显减小。

在接受DDP、Nar和NCU-01联合治疗（MNDP）组的血清CA125和HE4水平比仅接受DDP和Nar（MND）治疗的组有所降低，与M组相比，单一益生菌治疗（MP）组的血清CA125和HE4没有表现出显著变化（图13）。

肿瘤组织病理学的H&E染色和免疫组化Ki-67的表达进一步表明，联合Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01的处理可以更好的抑制肿瘤细胞的增殖（图14）。

此外，与仅接受化疗药物治疗的组相比，使用化疗药物联合NCU-01的组中p-p38/p38比率和ERCC1蛋白表达水平都有所降低（图15和图16）。

这些结果表明，Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01在经常规化疗药物治疗基础上对肿瘤的生长也有一定的抑制作用，能缓解卵巢癌症对顺铂的耐药从而提高治疗效果。

实施例3：Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01缓解化疗药物诱导的肠道炎症进而抑制胃肠道毒性验证实验

为了研究Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01及Nar能否减轻DDP化疗诱导的胃肠道毒副作用，首先利用Western blotting来检测实施例2中小鼠结肠组织中参与TLR4/NF-ƙB炎症通路的关键蛋白，包括TLR4、MyD88、NF-ƙB（p65）、磷酸化NF-ƙB（图17）。

与M组相比，MND组的TLR4蛋白水平（2.030±0.132 vs 1.127±0.089，p<0.001）、MyD88蛋白水平（1.890±0.152 vs 1.460±0.104，p<0.01）和p-p65/p65蛋白比率（0.965±0.055 vs 0.752±0.063，p<0.01）显著增高。同时，与MND组相比，MNDP组的TLR4蛋白（p<0.001）、MyD88蛋白（p<0.01）和p-p65/p65蛋白（p<0.05）比率显著降低，p65蛋白水平在所有组中是相似的（图18）。

H&E染色显示，与M组相比，MND组结肠组织粘膜上皮表面受损，腺体减少，粘膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，MNDP组的这种组织病理学损伤有较显著的改善（图19）。

随后，继续使用Western blotting来量化结肠组织中维持紧密连接完整性及屏障功能的ZO-1和Occludin蛋白表达（图20）。如图21所示，与M组相比，MND组的ZO-1蛋白水平（0.110±0.029 vs 0.590±0.086，p<0.001）和Occludin蛋白水平（0.182±0.037 vs0.607±0.063，p<0.001）显著下调，然而MP组没有观察到显著变化。值得注意的是，联合使用Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01（MNDP）与单用化疗药物（MND）组相比可以恢复ZO-1（0.342±0.076 vs 0.110±0.029，p<0.001）和Occludin蛋白的丰度（0.342±0.076 vs 0.182±0.037，p<0.01）。

为了证实益生菌是如何通过缓解肠道炎症作用于肿瘤组织的，通过对血清中炎症因子IL-6、TNF-ɑ、IL-1β的转录表达水平进行测定，与C组相比，MND组的IL-6（129.075±16.662 vs 26.137±5.281，p<0.001）、TNF-ɑ（81.200±13.492 vs 10.237±1.571，p<0.001）、IL-1β（107.950±23.918 vs 22.387±5.464，p<0.001）的转录水平显著增高，同样的，化疗药物与 NCU-01的联合使用（MNDP）组与单用化疗药物（MND）组相比，IL-6（p<0.01）、TNF-ɑ（p<0.05）、IL-1β（p<0.05）水平显著降低（图22）。

上述结果表明，化疗药物会引起肠道炎症并破坏生物屏障，同时炎症经血液循环限制化疗效果，而Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01有助于缓解炎症和维持肠道生物屏障，提高治疗效果。

实施例4：Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01有效地改变肠道微生物组成验证实验

为了确定NCU-01对小鼠肠道微生态失调的影响，收集实施例2中小鼠的粪便样本并进行检测以确定肠道微生物的改变。结果显示，MP组和MNDP组双歧杆菌的相对丰度明显高于M组和MND组，但MP组的丰度高于MNDP组（图23）。

与M组和MND组相比，使用Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01后MP组和MNDP组Bacteroides acidifaciens、Parabacteroides gordonii、Parabacteroides distasonis和Odoribacter splanchnicus的相对丰度显著增加，且在MP组和MNDP组中的相对丰度接近于C组（图24）。

对于Akkermansia mucinphila虽在五组粪便中无明显统计学差异，但相比于MND组，MNDP组中的相对丰度还是有所增加的（图25）。

此外，在C组中相对丰度表达较高的Prevotella copri、Lactobacillus salivarius和Morganella morganii在MP组和MNDP组中表达也相对提高，且明显高于M组和MND组（图26）。

上述数据表明，Bifidobacterium animalissubsp.lactisNCU-01可以增加有益菌的存在，改善肠道内微生态的失调，缓解肠道炎症。

以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同或等同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内，其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (10)

1.一种柚皮苷联合益生菌制剂，包括注射剂和口服剂，所述注射剂含有柚皮苷和铂类抗卵巢癌药物，所述口服剂含有益生菌。

2.根据权利要求1所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌为动物双歧杆菌。

3.根据权利要求2所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述动物双歧杆菌为Bifidobacterium animalis subsp. lactis NCU-01。

4.根据权利要求1所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述铂类抗卵巢癌药物为顺铂。

5.根据权利要求1所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述口服剂还包括药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为明胶、生理盐水中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为质量浓度为0.01%明胶生理盐水。

8.根据权利要求7所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述柚皮苷、顺铂的质量比例为2:2.5。

9.根据权利要求7所述的柚皮苷联合益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌的浓度为10⁹CFU/mL。

10.根据权利要求1所述的柚皮苷联合益生菌制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。