CN114787609A - 用于优化的干涉散射显微镜的方法和设备 - Google Patents

用于优化的干涉散射显微镜的方法和设备 Download PDF

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菲利普·库库拉
李·普利斯特
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Abstract

本申请公开了通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法和设备，该方法包括用至少一个相干光源对样品进行照射，样品被保持在包括界面的样品位置处，界面具有折射率变化，用照射辐射对样品进行照射以产生来自样品的反向传播信号，反向传播信号包括在界面处反射的光以及被样品散射的光，将反向传播信号分成第一信号和第二信号，使用修改元件修改第二信号，使得第二信号不同于第一信号；将第一信号和第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及通过处理器比较第一图像和第二图像以确定样品的一个或多个特征。

Description

用于优化的干涉散射显微镜的方法和设备
技术领域
本发明涉及用于优化的干涉散射显微镜(在此被称为iSCAT)的方法和设备。
背景技术
iSCAT已经成为具有独特的时空分辨率和低至单分子水平的无标记灵敏度的单粒子跟踪的强大方法。
例如在Kukura等人的“单个病毒的位置和方向的高速纳米级观测跟踪，High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus”，自然方法(Nature Methods)2009 6：923-935中和Ortega Arroyo等人的“干涉散射显微镜(iSCAT)：超快超灵敏光学显微镜的新领域，(Interferometric scattering microscopy(iSCAT)：new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy)”，物理化学化学物理(Physical Chemistry Chemical Physics)，201214：15625-15636中公开了iSCAT。
尽管有很大的潜力，但是由于对定制显微镜、非常规相机和复杂样品照射的要求，限制了iSCAT的广泛应用，从而限制了iSCAT对小到单分子的对象进行稳健和准确的检测、成像和表征的能力。
在我们之前的专利WO 2018/011591中，我们公开了一种干涉散射显微镜，该干涉散射显微镜包括新型的、增强对比度的空间掩模，该空间掩模被构造成提高参照光场和散射光场的相对幅度。其中描述的显微镜能够实现与常规iSCAT技术相似的灵敏度，但是复杂性和费用大幅降低，使得通过简单的修改和包括空间掩模可以将常规显微镜构造成起到iSCAT的作用。
然而，对于本申请的发明人而言，使用该方法可获得的测量灵敏度的许多限制已经变得明显。
首先，例如由于激光噪声或其他干扰现象引起的照射中的背景波动通常无法消除，因为这些波动可能带有关于被询问的样品的信息。这种背景特征限制了检测灵敏度。
第二，可以照射被询问的样品的光的强度受到检测器特征的限制，该检测器特征包括满井容量和读出速度。因此，在更高的照射强度下，必须使用更强的空间掩模来减少到达检测器处的的光的量，从而限制质量范围并且使仪器对外部影响因素更敏感。
第三，在同一时刻，利用这种显微镜只能获得样品相互作用或事件的单个测量结果，因此无法通过单个分子事件的粒子检测算法导出相关性。
最后，在设备用于样品质量检测(质量光度测定)的应用中，测量的动态范围受到所选的空间掩模的强度的限制。也就是说，需要对用于高质量检测或低质量检测的设备进行优化。
本发明提供了解决了上述限制中的每一个限制的用于优化的iSCAT技术的方法和设备。在此公开的方法在照射光的一部分已经被样品散射之后通过在设备的检测侧操控图像信号来处理这些限制。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法。
所述方法包括：用至少一个相干光源对样品进行照射，样品被保持在包括界面的样品位置处，界面具有折射率变化，用照射辐射对样品进行照射以产生来自样品的反向传播(backpropagating)信号，反向传播信号包括在界面处反射的光以及被样品散射的光；将反向传播信号分成第一信号和第二信号；使用修改元件修改第二信号，使得第二信号不同于第一信号；将第一信号和第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及通过处理器比较第一图像和第二图像以确定样品的一个或多个特征。
空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大。因此，空间滤波器利用反射的照射光的数值孔径和从在样品位置处的样品中的对象散射的光的数值孔径之间的不匹配，相比于散射光，选择性地降低了照射光的强度。因此，空间滤波器利用了这两个光源的不同的方向性。反射的照射光通常具有相对较小的数值孔径，而样品的表面附近的亚衍射尺寸的对象优先将光散射到高的数值孔径中。因此，在低数值孔径处，空间滤波器引起的强度减小主要影响照射光，并且对散射光的影响最小，从而使成像对比度最大化。
通过使反向传播信号分开提供了许多优点，这使得能够捕获在同一时刻的样品的两个图像，从而使得能够在没有时间相依性的强度波动(例如由于按顺序的图像获取而导致的照射光源的不一致)的情况下对样品进行研究。
样品的特性(例如在质量光度测定实验中样品的质量)也可以通过在两个分开的信号中的一个信号到达检测器之前独立地修改该信号来进行研究。这样做也可以消除背景噪声特征，提高测量灵敏度。
在一些实施例中，至少一个相干光源包括第一激光器和第二激光器，第一激光器和第二激光器的射束在对样品进行照射之前被组合。提供多个光源导致样品上的光子通量更高，从而使将反射信号分束成两个信号更加可行，这两个信号中的每一个信号包括足够的信息以独立地形成样品的图像。
在一些实施例中，将信号分开包括将反向传播信号分成具有正交偏振的两个信号。将图像通道分成两个正交偏振使得能够研究样品的双折射特性。
在一些实施例中，将信号分开包括将反向传播信号分成具有不同的光学功率的两个信号。将图像通道分成具有不同光学功率的两个信号使得能够实现参照射束和来自样品的散射光之间的不同平衡。
在一些实施例中，使第一信号和第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器包括使第一信号穿过第一空间滤波器，并且修改第二信号使得第二信号不同于第一信号包括使第二信号穿过第二空间滤波器，其中，第一空间滤波器和第二空间滤波器各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大，其中，第一信号具有比第二信号更大的光学功率，并且其中，与第一空间滤波器相比，第二空间滤波器对入射辐射实施更大的强度减小。第一空间滤波器和第二空间滤波器可以各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大。第一信号可以具有比第二信号更大的光学功率，并且与第一空间滤波器相比，第二空间滤波器可以对入射辐射实施更大的强度减小。
使用之前的设置，使用单个的“通吃型(catch-all)”空间滤波器限制了测量的动态范围，迫使设备针对高的质量或低的质量进行优化。高强度掩模优化了具有低的分子量的粒子的图像捕获，而对于具有高的分子量的粒子，弱的掩模或者甚至没有掩模可能就足够了。将反射信号分成不同强度(例如90：10)的两个信号，并且对每个信号施加适当强度(例如，0.1％和1％)的空间滤波器使得能够通过使一个分开臂优化以用于低的质量并且使另一个分开臂优化以用于高的质量来询问更宽的质量光谱。
在一些实施例中，将第一信号和第二信号引导到第一检测器和第二检测器上包括相对于第一信号调整第二信号的相位。相对于第一信号调整第二信号的相位包括使第二信号穿过相移掩模和/使第二信号沿着第二信号的光学路径在适当位置处穿过成像透镜。可以相对于第一信号将第二信号调整照射辐射的半个波长。
在样品照射中的一些波动(例如由于在系统中的反射率变化、缓冲作用、次级反射、激光噪声和其他干扰现象)在之前的设置中无法消除。这种背景特征限制了从设置消除噪声的能力，因为不知道波动是噪声还是由于来自样品的散射光产生的。
通过独立地调整第一信号或第二信号的相位，并且比较两个同时产生的(有利的，如关于权利要求1所述的)图像，能够突出在两个图像中不相关的波动，并且将它们分类为不来自图像平面。
这样做提供了用于单个分子事件的关联图像的第二测量结果，在以前的设置中，只能使用每个瞬间的单个测量结果来处理该图像，这意味着很难或无法推导出相关性。
在一些实施例中，修改第二信号包括使第二信号穿过被构造成沿着第一维度对第二信号实施非对称放大的光学元件，第一维度对应于第一检测器的像素网格的x维度。在一些实施例中，第一信号可以穿过被构造成沿着第二维度对第一信号实施非对称放大的光学元件，第二方向与第一方向正交并且对应于第二检测器的像素网格的y维度。
在之前的设置中可以使用的光的量受到数字相机读出的限制，因此必须使用更强的空间滤波器，这反过来导致对振动的灵敏度增加，并且在质量光度测定中扩大了记录的质量分布。通过将信号分成两个信号并且在x维度和y维度中的每一个维度上对各个信号执行一维放大，相机在相同的或更大数目的像素中接收相同数目的光子，更重要的是，这可以以优化读出速度的方式被布置。这相当于在不增加数字相机读出速度的情况下能够处理更高通量的检测的光子。
在一些实施例中，至少一个相干光源被构造成提供具有至少两个不同的询问波长的照射光；并且将信号分开包括按照波长将信号分开，使得具有第一询问波长的光被引导到第一检测器，具有第二询问波长的光被引导到第二检测器。
用两个不同的探测波长测量同一样品可以帮助识别由光学系统的不完美部件引起的测量变化，或者由于样品在一个波长处吸收而在另一个波长处不吸收(例如，由于会影响散射的添加到样品中的不同染料或荧光标签，或者由于样品承载部上的涂层吸收了一个波长)而引起的测量变化。
在一些实施例中，预定的数值孔径与在反向传播信号中从样品位置反射的照射光的数值孔径相同或相似。这使由空间滤波器提供的图像对比度效果最大化。
在一些实施例中，修改第二信号包括相移、在第一方向上放大、或者以比对第一信号施加的空间滤波更大的强度进行的空间滤波。
根据本发明的另一个方面，提供了一种干涉散射显微镜，该干涉散射显微镜被构造成执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。该干涉散射显微镜包括：包括反射表面的样品位置；至少一个相干光源，至少一个相干光源被构造成对样品位置进行照射；第一检测器和第二检测器；分束器，该分束器被构造成将来自样品位置的反向传播信号分成第一信号和第二信号；以及修改元件，该修改元件被构造成修改第二信号，使得第二信号不同于第一信号；其中，该系统被构造成将第一信号和第二信号分别引导到第一检测器和第二检测器上。
在一些实施例中，干涉散射显微镜包括至少一个空间滤波器，至少一个空间滤波器被布置成对第一信号和第二信号中的至少一个信号进行滤波，其中，空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，该强度减小在预定的数值孔径内更大。
本发明可以有利地应用于包括对象的样品，该对象相对于照射光的散射横截面为10-15m2或小于10-15m2。典型地，这种对象相对于照射光的散射横截面还可以为10-26m2或大于10-26m2，即在10-15m2至10-26m2的范围内。可以研究的对象的示例包括蛋白质或蛋白质的小聚集体以及金属的、有机的或无机的纳米颗粒。
为了对作为非常弱的散射体的对象进行成像，空间滤波器被布置成使输出光以如下方式通过：在预定的数值孔径内的强度减小到入射强度的10-2或小于10-2。典型地，空间滤波器可以被布置成使输出光以如下方式通过：在预定的数值孔径内的强度减小到入射强度的10-4或大于10-4，例如在入射强度的10-2至10-4的范围内。
附图说明
为了能够更好地理解，现在将通过参照附图的非限制性示例来描述本发明的实施例，在附图中：
图1是现有技术的iSCAT显微镜的示意图；
图2是现有技术的改进的iSCAT显微镜的示意图；
图3a、图3b、图4以及图5示出了根据本发明的iSCAT显微镜的示例性实施例；
图6A、图6B以及图6C示出了使用根据本发明的方法和设备获得的实验结果。
具体实施方式
在本文描述的系统和方法中，使用的光可以是：紫外光(在此紫外光可以被限定为具有在10nm至380nm的范围内的波长)；可见光(在此可见光可以被限定为具有在380nm至740nm的范围内的波长)；红外光(在此红外光可以被限定为具有在740nm至300μm的范围内的波长)。光可以是多种波长的混合。在此，术语“光学的”和“光学”通常用于指应用这些方法的光。
图1和图2示出了在WO 2018/011591中公开的iSCAT显微镜构造，该显微镜构造具有与本发明的设备和方法相同的许多结构特征和功能。
WO 2018/011591的公开内容通过引用并入本文，然而，为了完整性，以下描述将阐述本发明的iSCAT显微镜的与WO 2018/011591的显微镜的部件和功能相同的部件和功能，并且这些部件和功能在图1和图2中示出，然后描述由本公开提供的对所述构造的各种改进并且提供该改进的示例实施例。
因此，参照图1，显微镜1包括用于将样品3保持在样品位置的样品保持部2。样品3可以是包括待成像的对象的液体样品，这将在下面更详细地描述。样品保持部2可以采取适合于保持样品3的任何形式。典型地，样品保持部2将样品3保持在表面上，该表面形成了样品保持部2和样品3之间的界面。例如，样品保持部2可以是盖玻片和/或可以由玻璃制成。样品3可以以简单的方式(例如使用微量移液管)设置在样品保持部2上。
显微镜1进一步包括照射源4和检测器5。照射源4被布置成提供照射光。照射光可以是相干光。例如，照射源4可以是激光器。照射光的波长可以根据样品3的性质和/或待检测的特性来选择。在一个示例中，照射光的波长为405nm。
可选地，照射光可以在空间上被调制，以消除由照射和激光噪声的相干性质引起的斑点图案，例如在Kukura等人的“单个病毒的位置和方向的高速纳米级观测跟踪(High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a singlevirus)”，自然方法(Nature Methods)2009 6：923-935中所详述的。
检测器5接收从样品位置反射的输出光。到达检测器的照射光主要从样品的表面(通常是样品和样品保持部之间的界面)反射，从而提供与样品中的靠近该表面的对象的干涉。
在使用玻璃-水界面的示例中，相对少量(典型地，仅0.5％)的照射光被反射，同时在界面处被纳米级观测(nanoscopic)对象散射的显著较高量(典型地大于90％)的光被朝向照射方向散射回来。与透射类型的几何结构相比，这从本质上将散射光场和反射光场之间的比率提高了1000倍以上，从而产生了更大的干涉对比度。因此，在给定的特定散射体、照射强度以及曝光时间的情况下，为了实现相同的标称信噪比，与针对透射类型的设置相比，需要检测的光子少三个数量级。
通常，显微镜1可以在宽场模式下运行，在这种情况下，检测器5可以是捕获样品3的图像的图像传感器。替代地，显微镜1可以以共焦模式运行，在这种情况下，检测器5可以是图像传感器或者可以是点状检测器，例如光电二极管，在这种情况下，扫描装置可以用于扫描样品3的区域以构建图像。可以用作检测器5的图像传感器的示例包括CMOS(互补金属氧化物半导体，complementary metal-oxide semiconductor)图像传感器或CCD(电荷耦合装置，charge-coupled device)。
显微镜1进一步包括布置在样品保持部2、照射源4以及检测器5之间的光学系统10。光学系统10以如下文所述的方式布置，以将照射光引导到样品位置上以用于对样品3进行照射，并且收集从样品位置反射的输出光并且将输出光引导到检测器5。
光学系统10包括物镜透镜11，物镜透镜是被布置在样品保持部2前方的透镜系统。光学系统10还包括聚光透镜12和镜筒透镜13。聚光透镜12使来自光源11的照射光(在图1中由实线示出)穿过物镜透镜11在样品位置处聚集到样品3上。
物镜透镜11收集输出光，输出光包括(a)从样品位置反射的照射光(在图1中用实线示出)和(b)在样品位置处从样品3散射的光(在图1中用虚线示出)。反射光主要从样品保持部2和样品3之间的界面反射。
通常，这是相对较弱的反射，例如玻璃-水反射。例如，反射的照射光的强度可以是入射的照射光的强度的约0.5％。散射光被样品3中的对象散射。来自在样品表面处的或在样品的表面附近的对象的散射光与反射光发生相长干涉(constructively interfere)，并且因此在由检测器5捕获的图像中可见。
如在图1中所示，反射的照射光和散射光具有不同的方向性。特别地，反射的照射光的数值孔径产生于光学系统6和光源4输出的光的射束的几何形状。散射光在大的角度范围内散射，并且因此比反射的照射光填充更大的数值孔径。镜筒透镜13将来自物镜透镜11的输出光聚焦到检测器5上。
光学系统10还包括分束器14，分束器被布置成将来自光源4的照射光和被引导到检测器5的输出光的光学路径分开。分束器14可以具有提供入射到分束器上的光的部分反射和部分透射的常规构造。
在本公开的示例中，光源4偏离物镜透镜11的光学路径，使得来自光源4的照射光被分束器14反射到物镜透镜11中，相反地，检测器5与物镜透镜11的光学路径对齐，使得来自样品位置的输出光穿过分束器14朝向检测器5透射。
除了以上描述的可以是常规构造的部件之外，显微镜1包括空间掩模或滤波器20。在图1的示例中，空间滤波器20形成在分束器14上，并且因此被布置在物镜透镜11的后孔径的后方，因此直接在物镜透镜11的后焦平面15的后方，然而，空间滤波器20可以放置在沿着iSCAT显微镜的光学路径的其他点上，以实现如下所述的相同效果。
空间滤波器20被定位成对从样品保持部界面传递到检测器5的反向传播的输出光进行滤波。因此，在本公开的检测器5与物镜透镜11的光学路径对齐的示例中，空间滤波器20是透射的。
空间滤波器20是部分透射的，并且因此使输出光穿过，但强度会减小，输出光包括反射的照射光。空间滤波器20还与光学轴对齐，并且具有预定的孔径，使得空间滤波器在预定的数值孔径内提供强度的减小。在此，数值孔径以其常规方式被定义为无量纲量，其表征相对于输出光所源自的样品位置的角度范围。
具体地，数值孔径NA可以通过以下等式定义：NA＝n·sin(θ)，其中，θ是收集半角，n是输出光穿过的材料(例如光学系统10的部件的材料)的折射率。
空间滤波器20可以以任何合适的方式形成，空间滤波器通常包括沉积的材料的层。该材料可能是例如金属，例如银。在一些实施例中，空间滤波器可以包括一个或多个介电涂层。在一些实施例中，空间滤波器可以成形为在给定的角度范围内对入射辐射进行部分反射。沉积可以使用任何合适的技术进行。
由于界面附近的亚衍射尺寸的对象优先将光散射到比反射的照射光更大的数值孔径中，因此相比于散射光，由空间滤波器20提供的强度的减小优先减小了反射的照射光的检测强度。因此，在低数值孔径处，空间滤波器20引起的强度减小主要影响反射的照射光，并且对散射光的影响最小，从而使在捕获的图像中的对比度最大化。增强的成像对比度使得能够对作为弱散射体的对象进行高对比度检测。
对比度增强可以以如下方式理解。当空间滤波器20使在预定的数值孔径中的输出光的部分穿过(即，在该示例中是部分透射的)时，对于充分地相干的照射源，照射光场与散射光场的一部分到达检测器并且干涉。因此，达到检测器的光强度Idet由以下等式给出：
Idet＝|Einc|2{r2t2+|s|2+2rt|s|cosΦ}，
其中，Einc是入射光场，r2是界面的反射率，t2是空间滤波器20的透射率，s是对象的散射幅度，φ是透射的照射光和散射光之间的相位差。
由空间滤波器20提供的附加滤波使得参照场的幅度能够直接通过选择空间滤波器20的透射率t2来调节，而不是如在标准ISCAT中由玻璃-水界面的反射率固定。在空间滤波器20是沉积的材料的层的情况下，透射率t2可以通过选择材料和/或层的厚度来选择。这种调节可以例如根据感兴趣的散射对象、相机满井容量以及放大倍数来进行。
明视场照射确保了通常来自物镜的最强的不期望的背向反射远离检测器5定向，使成像背景最小化，并且使得能够有大的视场，而无需复杂地扫描照射光的射束。
为了对作为相对较弱的散射体的对象成像，空间滤波器20可以被布置成使反射的照射光穿过，使得强度减小，强度在预定的数值孔径内减小到在入射强度(在该背景下为入射到空间滤波器20上的输出光的强度)的10-2至10-4的范围内的强度。
例如，可以对包括质量为5000kDa或小于5000kDa的对象的样品进行成像。通常，所公开的技术可以应用于包括质量为10kDa或大于10kDa的对象的样品，例如质量在10kDa至5000kDa范围内的对象，和/或应用于包括相对于照射光的散射横截面为10-12m2或小于10- 12m2(或优选地散射横截面为10-17m2或小于10-17m2)的对象的样品。通常，这种对象的相对于照射光的散射横截面还可以例如在10-17m2至10-26m2范围内。本公开的技术可以应用于对其进行成像的对象的示例包括蛋白质或蛋白质的小聚集体，或它们的结合配偶体。
为了同时对更强的散射体进行成像，根据期望的检测范围，第二滤波器的透射率可以被设置为介于1至10-2之间的任何数值。
参照图2，示出了显微镜1的第二示例构造。图2的构造也在WO2018/011591中被公开，并且类似地适合于通过应用本发明的技术进行优化。
图2的构造将空间滤波器20布置在物镜透镜11的后焦平面的共轭焦平面21处，而不是在物镜透镜11的后孔径的后方。物镜透镜11的后焦平面15的共轭焦平面21形成在一对望远镜透镜22和23之间，这些望远镜透镜被布置在镜筒透镜13的后方。
声光学偏转器32被布置在光源4之后，以提供照射光的扫描。如以上所提到的，声光学偏转器32可以被操作成扫描样品3的区域以构建图像和/或提供空间调制用以消除由照射和激光噪声的相干性质引起的斑点图案。
聚光透镜12由一对远心透镜30和31代替，这一对远心透镜执行将在声光学偏转器32处对射束路径的任何修改成像到成像物镜的后焦平面中的功能。
相对于图1的构造，光源4和检测器5的位置是相反的，使得来自光源4的照射光通过分束器14透射到物镜透镜11中，相反地，来自样品位置的输出光被分束器14朝向检测器5反射。
分束器14是偏振分束器，四分之一波板33被布置在分束器14和样品3之间，使得分束器14将光分开。镜子34被布置成使由分束器14反射的输出光偏转。
现在，参照图3至图5，以下描述聚焦于本发明提供的对以上描述的iSCAT显微镜1的构造的各种改进。
空间滤波器20的使用不会根本地改变对于给定的对象、入射光强度以及曝光时间可实现的灵敏度极限或SNR(信噪比)，然而，在照射光的一部分已经被对象散射之后，可以通过在设备的检测侧上操控反向传播信号来增加灵敏度。
在图3至图5中示出的示例构造中，通过使该反向传播信号穿过第二分束器36来操控该反向传播信号，第二分束器被构造成将该反向传播信号分成第一信号和第二信号，然后第一信号和第二信号分别被引导到第一检测器5和第二检测器6。以这种方式，对于给定的对象可以在同一时刻捕获两个单独的图像信号，并且两个单独的图像信号通过单独的图像通道进行处理。这进而使得能够通过图像比较来研究被样品散射的光，而不引入光学系统10中的变化或照射源引起的时间相依性的强度波动。
此外，在来自分束器36的两个分开的信号到达检测器之前，通过独立地修改两个分开的信号中的至少一个信号，可以研究样品的附加特性，并且可以增加测量的灵敏度。例如，如在下文中将进行说明的，可以从照射中消除背景噪声特征，并且可以对第一信号和第二信号相对于彼此进行调节，并将第一信号和第二信号组合以提供关于样品的更多信息。
分束器36被构造成以如下方式将反向传播信号分开：根据该方式，样品/反向传播信号的特性处于研究中。
例如，在期望通过光学功率将信号分开的一些实施例中，分束器36可以包括设置有膜的板，膜可以是金属的或电介质的，并且板被布置成与光学路径成45°角。替代地，分束器36可以是由一对匹配的棱镜形成的立方体分束器，并且该立方体分束器在棱镜之间的界面处具有部分反射的膜。
在一些实施例中，分束器36是偏振分束器，该偏振分束器与在分束器36和样品3之间的四分之一波板组合使用，并且被构造成将反向传播信号分成正交地偏振的第一信号和第二信号。这种构造使得能够通过检测器5和6分析样品的双折射特性。
在一些实施例中，照射光包括用于对样品进行照射的至少两个不同的询问波长，并且分束器36被构造成按照波长将反向传播信号分开，使得具有第一询问波长的光被引导到第一检测器5，具有第二询问波长的光被引导到第二检测器6。
用两种不同的探测波长测量同一样品可以帮助识别在光学系统中由波长相关的部件引起的强度变化。这种构造还可以识别由吸收一个波长的光而不吸收其他波长的光(例如由于将影响散射的被添加到样品中的不同染料或荧光标记，或者由于在样品承载部上的涂层上吸收一个波长)的样品引起的强度变化。
在此描述的优化的方法是互补的，并且可以单独使用或彼此组合使用。因此，在一些实施例中，分束器36可以包括多个分束器，每个分束器被构造成以不同或相同的方式将信号分开，使得反向传播信号被分成三个或更多个信号，然后这些信号中的每个信号可以被引导到单独的检测器。
参照图3a，示出了显微镜1的基于图1的光学构造的示例优化构造。
除了图1的光学部件，图3a的构造包括第二检测器6和第二分束器36，该第二分束器沿着镜筒透镜13与检测器5和6之间的反向传播信号的光学路径布置，并且该第二分束器被构造成将反向传播信号分成第一信号和第二信号。
在所示的示例中，第一信号直接传递到检测器5，而第二信号在冲击到第二检测器6之前经由反射元件38被引导穿过信号修改元件40。根据期望的图像信号优化的类型来选择信号修改元件40。
在一个示例优化方法中，分束器36将反向传播信号分成具有相等的光学功率的第一信号和第二信号，并且修改元件40包括延迟掩模，延迟掩模被构造成使由保持在样品位置的对象散射的光在第二信号中产生π/2的相移，而不影响照射光的相位。在这样做时，第二信号中的样品的图像被反转，使得否则会发生相长干涉的散射光发生相消干涉。
由于第一信号中的散射光没有发生相移，因此如在常规iSCAT中一样，散射光发生相长干涉。因此，当比较由检测器5和6获得的图像时，由来自样品的散射引起的图像中的强度波动将被相互关联，并且两个图像之间不相互关联的强度波动可以被识别并归因于背景特征，例如照射光中的缺陷。
通过对分开的信号中的散射光进行独立的“相位调节”而获得的在iSCAT图像中的这种背景特征的识别使得特征能够被移除，并且因此提高了显微镜1的灵敏度。
在替代的示例中，替代地通过以下方式将散射光的相位反转：使信号修改元件40包括成像透镜，并且沿着在第二分束器36和第二检测器6之间的第二分开的信号的光学路径将所述成像透镜移动到适当的点。这种构造使得能够对散射光的相位产生与相移掩模所提供的相同的“调节”效果。这是由于来自照射源4的照射光的非聚焦特性以及由亚衍射极限尺寸的样品3散射的光的高度聚焦特性。该效果可以按照以下说明的方式理解。
如果准直的光射束被理想透镜/聚焦元件聚焦到空间中的单个的点，那么在焦点的另一侧在等于聚焦元件的焦距的距离处测量的射束的相位将发生π的相移。恰好在焦点处，相移将是π/2。这种相移被称为Guy相移，并且与距焦点的距离近似线性相依。
实际上，没有聚焦元件能够将射束聚焦到空间中的单个的点，并且对于给定的光射束，相位变化的强度与距离的相依性基于射束的聚焦程度。弱聚焦光(例如来自照射源4的照射光)几乎不受Guy相移的影响。相反地，单分子或非常小的样品(例如被本公开的iSCAT显微镜询问的样品)具有在照射光的衍射极限之下的尺寸，因此充当接近理想的聚焦元件。因此，反向传播信号中的散射光沿其光学路径将具有较高的Guy相位相依性，而照射光则不具有Guy相位相依性。
在iSCAT显微镜的情况下，散射光和反射照射光，在穿过分束器36并且成像到检测器5和6上之前，由于样品位置界面/盖玻片处的折射率变化而经受了附加的相位变化。在该光学设置中，改变成像透镜(在该示例中是修改元件40)的位置使得能够对散射光的Guy相移进行调节而不影响弱聚焦的照射光，模拟距焦点的距离的变化。
因此，可以在不改变照射光的相位的情况下改变散射光的相位，并且可以如关于相移掩模所描述的那样使样品的由检测器6接收的图像反转。
图3a示出了有两个激光器4a和4b的布置，这两个激光器经由分束器4c组合以形成功率更大的照射射束。
尽管该实施例被示出和描述为图1的构造的优化，但是该实施例也可以实施为图2的构造的优化。
图3b示出了图3a的替代布置，除了没有空间滤波器20。射束仍然被分开，其中修改元件40被布置在第二分开的信号的路径中。修改元件可以对第二分开的信号进行放大、相移或者甚至空间滤波以增加设备的灵敏度。
参照图4，示出了显微镜1的基于图2的光学构造的示例优化构造。
除了图2的光学部件，图4的构造包括第二检测器6和第二分束器36，该第二分束器沿着镜筒透镜13与检测器5和6之间的反向传播信号的光学路径布置，并且该第二分束器被构造成将反向传播信号分成第一信号和第二信号。在该构造中，一个或多个空间滤波器20被布置在分束器36与检测器5和6之间。
在所示的示例中，分束器36将反向传播信号不对称地分成具有不同的光学功率的第一信号和第二信号。第一信号穿过第一空间滤波器20到达检测器5，第二信号在撞击到第二检测器6之前经由反射元件38被引导穿过信号修改元件40，信号修改元件40是具有与第一空间滤波器不同的强度的第二空间滤波器。
在质量光度测定实验中(在该实验中，iSCAT显微镜用于测量保持在样品位置的亚衍射极限对象的质量)，通常必须针对给定的质量范围对图像信号质量进行优化，因为相比于强散射体，弱散射体在照射中需要更高的光学功率，因此，更多的照射光会被空间滤波器20衰减。
如上所描述的将反向传播信号不对称地分开并且使第一信号和第二信号穿过具有不同强度的空间滤波器使得能够产生第一信号和第二信号，第一信号和第二信号中的每一个信号具有照射光(参照射束)和在图像平面中从样品散射的光(图像信号)之间的不同的平衡。因此，可以由检测器5和6获取第一图像和第二图像，检测器中的每个检测器都被优化，用于高质量对象测量或低质量对象测量中的一项。这增加了用显微镜1可测量的动态质量范围。
例如，分束器36可以被构造成使得第一信号具有比第二信号更大的光学功率，在这种情况下，第二空间滤波器与第一空间滤波器相比对入射辐射施加更大的强度减小。第一信号和第二信号之间的光学功率比率可以是例如90：10，在这种情况下，将使用适当强度(例如分别衰减到0.1％和1％)的空间滤波器。该比率可以根据在任一方向上的期望的检测范围进行调整，例如该比率为99：1，分别衰减到0.01％和10％。理想地，光学功率比率和衰减的组合总是选择成使得在两个成像通道中保持相同的光强度。
图4示出了在照射射束的路径中的可选的声光学偏转器(AOD)27。声光学偏转器被布置在光源之后，以提供照射光的扫描。如以上所描述的，声光学偏转器27可以被操作成扫描样品3的区域以构建图像和/或提供空间调制，用以消除由照射和激光噪声的相干性质引起的斑点图案。
虽然该实施例是参照基于图2的构造的构造示出的，应该理解，这种优化方法同样也可以基于图1的构造实施。
参照图5，示出了基于图1的光学构造的另一个示例实施例。
在之前的设置中可以使用的光的量受到数字相机读出的限制，因此必须使用更强的空间滤波器20，这反过来导致对振动的灵敏度增加，并且在质量光度测定中扩大了记录的质量分布。
类似于图3的构造，图5包括第二检测器6和第二分束器36，该第二分束器沿着镜筒透镜13与检测器5和6之间的反向传播信号的光学路径布置，并且该第二分束器被构造成将反向传播信号分成第一信号和第二信号。
然而，在该实施例中，第一信号不是直接传递到检测器5，而是穿过第一放大元件42，第一放大元件被构造成沿着第一轴线放大第一信号。
在图5的实施例中，第二信号经由反射元件38被引导穿过信号修改元件，在这种情况下，信号修改元件是第二放大元件43，第二放大元件被构造成沿着垂直于第一轴线的轴线放大第二信号。
检测器5和6相对彼此不同地定向。常规的基于像素的检测器倾向于具有比其他方向更快的一个电子读出方向，这是由于像素激发在网格上被逐列地处理的事实。因此，检测器5和6被定向成使得相机读出电子器件能够最快地处理像素激发所沿的方向与检测器5的第一轴线和检测器6的第二轴线对齐。
使用以上描述的构造，能够在不使用昂贵的专用检测器的情况下通过检测的光子与数字相机读出操作的改进匹配提高从样品散射的光子被处理的速率。例如，检测器5可以仅沿着单个X-轴线列读出，在单个X-轴线列中，第一放大元件42已经放大了来自第一信号的光子通量，而检测器6可以仅沿着单个Y-轴线列读出，沿着该单个Y-轴线列，第二放大元件43已经放大了来自第二信号的光子通量。
因此，检测器5和6的像素可以相互映射，以适当地将X-Y位置分配给两个相机，使得从检测器5和6获取的图像可以混合在一起。在一些情况下，需要针对畸变校正混合图像。然而，总体上，以上描述的方法使得传统的检测器能够将捕获图像的速率增加与第一放大元件和第二放大元件的放大倍数成比例的数字，而图像质量损失很小。
因此，所描述的实施例补偿了由于空间滤波器20导致的第一信号和第二信号中光子总数的减少，通过以上列出的Idet方程可以看出，空间滤波器以检测到的光子总数为代价增强了所获取的图像中的散射对比度。
尽管该实施例被示出和描述为图1的构造的优化，但是该实施例也可以被实施为图2的构造的优化。
另外，在实施例(未示出)的一些实施中，仅第一信号穿过放大元件，而第二图像通道以正常的空间分布被查看。在这种构造中，第二信号可以穿过不同的掩模或常规强度滤波器而不是放大元件。在这种实施中，第二通道保持完整的空间分辨率并且可以用于定位。
上面关于图3至图5描述的优化方法中的每一个方法可以彼此组合地使用，也可以单独地使用。
此外，当反向传播信号被具有较低的光子通量的分束器36分成第一信号和第二信号时，所描述的优化方法中的每一个方法都可以通过提供较高强度的照射源4来促进。如图3所示，在一些实施例中，通过组合第一激光器和第二激光器的射束来提供更高强度的照射源4。
参照图6A，示例实验结果是使用一个芯片的两个通道质量光度测定比率计(ratiometric)图像，该示例实验结果示出了在同一时间点使用分束构造获得的同一样品混合物的两个图像，该分束构造类似于以上描述的图5的iSCAT显微镜的构造，但是没有放大元件。
参照图6B，示出了另一个示例实验结果，该示例实验结果示出了使用类似于图5的包括放大元件的另一个iSCAT显微镜构造获得的图像，该放大元件被构造成沿单个维度拉伸分开的射束中的一个射束。在图6B中可以看到，样品混合物的图像被沿着X维度放大/拉伸。
参照图6c，示出了与在图6B中所示出的相同的实验结果，但是使用1维组合(binning)将拉伸的维度中的像素重新组合成一个像素，证明了图像内容和分辨率不会因该过程而损失，而是简单地将光子分散到多个像素上，之后多个像素可以被重新组合。
显微镜1可以用作用于广泛的应用范围(包括单分子检测)的iSCAT。特别的应用是弱散射体的无标记成像，在该应用中，感兴趣的对象必须在大的背景的顶部上不变地进行检测，这降低了成像对比度。显微镜1可以用于广泛的研究和测量，例如以测量折射率的任何变化，其包括例如：单分子结合/解除结合、相变、聚类、组装/解体、聚集、蛋白质/蛋白质相互作用、蛋白质/小分子相互作用、高灵敏度无标记成像。
因此，显微镜1有许多应用，应用的范围从基础研究到工业应用，例如应用在制药工业中。作为示例，iSCAT是目前世界上最灵敏的无标记单分子成像生物传感器，iSCAT可能例如对表面等离子体共振传感市场有重大的影响。此外，以上所描述的显微镜1可以用于质量测量，用作精确、精密且高分辨的单分子质谱仪的解决方案，在研究和工业中有许多应用。

Claims (17)

1.通过干涉散射显微镜对样品进行成像的方法，所述方法包括：
用至少一个相干光源对样品进行照射，所述样品被保持在包括界面的样品位置处，所述界面具有折射率变化，用照射辐射对所述样品进行照射以产生来自所述样品的反向传播信号，所述反向传播信号包括在所述界面处反射的光以及被所述样品散射的光；
将所述反向传播信号分成第一信号和第二信号；
使用修改元件修改所述第二信号，使得所述第二信号不同于所述第一信号；
将所述第一信号和所述第二信号引导到第一检测器和第二检测器上，以分别产生第一图像和第二图像；以及
通过处理器比较所述第一图像和所述第二图像以确定所述样品的一个或多个特征。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述第一信号和所述第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器，所述空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，所述强度减小在预定的数值孔径内更大。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述至少一个相干光源包括第一激光器和第二激光器，所述第一激光器和所述第二激光器的射束在对所述样品进行照射之前被组合。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述信号分开包括将所述反向传播信号分成具有正交偏振的两个信号。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述信号分开包括将所述反向传播信号分成具有不同的光学功率的两个信号。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，使所述第一信号和所述第二信号中的至少一个信号穿过空间滤波器包括使所述第一信号穿过第一空间滤波器，并且修改所述第二信号使得所述第二信号不同于所述第一信号包括使所述第二信号穿过第二空间滤波器，其中，所述第一空间滤波器和所述第二空间滤波器各自被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，所述强度减小在预定的数值孔径内更大，其中，所述第一信号具有比所述第二信号更大的光学功率，并且其中，与所述第一空间滤波器相比，所述第二空间滤波器对入射辐射实施更大的强度减小。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，修改所述第二信号包括相对于所述第一信号调整所述第二信号的相位。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，相对于所述第一信号调整所述第二信号的相位包括使所述第二信号穿过相移掩模。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中，调整所述第二信号包括使所述第二信号沿着所述第一信号的光学路径在适当位置处穿过成像透镜。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，相对于所述第一信号调整所述第二信号的相位包括相对于所述第一信号将所述第二信号的相位调整所述照射辐射的半个波长。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，修改所述第二信号包括：
使所述第二信号穿过被构造成沿着第一维度对所述第二信号实施非对称放大的光学元件，所述第一维度对应于所述第二检测器的像素网格的x维度。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述方法还包括：
使所述第一信号穿过被构造成沿着第二维度对所述第一信号实施非对称放大的光学元件，所述第二方向与所述第一方向正交并且对应于所述第二检测器的像素网格的y维度。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述至少一个相干光源被构造成提供具有至少两个不同的询问波长的照射光；并且
其中，将所述信号分开包括按照波长将所述信号分开，使得具有第一询问波长的光被引导到所述第一检测器，并且具有第二询问波长的光被引导到所述第二检测器。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述预定的数值孔径与从所述样品位置反射的照射光的数值孔径相同或相似。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，修改所述第二信号包括相移、在第一方向上放大、或者以比对所述第一信号施加的空间滤波更大的强度进行的空间滤波。
16.一种干涉散射显微镜，所述干涉散射显微镜被构造成执行根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述干涉散射显微镜包括：
包括反射表面的样品位置；
至少一个相干光源，所述至少一个相干光源被构造成对所述样品位置进行照射；
第一检测器和第二检测器；
分束器，所述分束器被构造成将来自所述样品位置的反向传播信号分成第一信号和第二信号；以及
修改元件，所述修改元件被构造成修改所述第二信号，使得所述第二信号不同于所述第一信号；
其中，所述系统被构造成将所述第一信号和所述第二信号分别引导到所述第一检测器和所述第二检测器上。
17.根据权利要求16所述的干涉散射显微镜，所述干涉散射显微镜还包括至少一个空间滤波器，所述至少一个空间滤波器被设置成对所述第一信号和所述第二信号中的至少一个信号进行滤波，其中，所述空间滤波器被构造成对入射辐射产生强度减小的作用，所述强度减小在预定的数值孔径内更大。
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