JP2001290078A - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】レーザ走査型蛍光顕微鏡においては、試料から
放出される蛍光又は反射光は、通常、スキャナーの内部
に設けたピンホール上に結像するようになっており、ピ
ンホールと蛍光検出器との間隔が広いほど、ピンホール
通過後の光が発散光となる。そのため、最も効率よく受
光できる波長帯域から外れた光を検出することになり、
蛍光検出器の検出感度が減少し、得られる画像が暗くな
るという問題があった。 【解決手段】光源２３，２４と、前記光源からの光を試
料に集束させる対物レンズ２７と、前記試料からの戻り
光を集束させる結像光学系９，１０，１１，１２，１４
と、前記結像光学系からの集束光を選択的に通過させる
開口１５と、前記開口を通過した光を受光する光電検出
素子２０−２１とを備えた共焦点顕微鏡において、前記
開口を通過した光を前記光電検出素子上に集光する集光
光学系１９ａ−１９ｃ、１９を、前記開口と前記光電検
出素子との間に配置した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は共焦点顕微鏡に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】今日では種々の対象を光学的に観察・測
定等するための様々な光学装置が使用されている。これ
ら光学装置のうち、外部光源から照射された照射光を、
光学装置内部の光学系に取り込むことによって観察等を
行う光学装置が提案されている。このような光学装置の
一つとしては、レーザ走査型蛍光顕微鏡が挙げられる。

【０００３】図５は、レーザ走査型蛍光顕微鏡（共焦点
顕微鏡）の全体構成を概略的に示す図である。この図５
において顕微鏡は、励起レーザ光（照射光）を照射する
励起レーザ光源１００と、励起レーザ光を所定経路に走
査するスキャナー１０１と、レーザ走査型蛍光顕微鏡本
体１０２とを備えて構成されている。そして、励起レー
ザ光源１００から照射された励起レーザ光がスキャナー
１０１にて走査され、この走査された励起レーザ光が顕
微鏡本体１０２に取り込まれ、この励起レーザ光が顕微
鏡本体１０２にセットされた試料（不図示）に照射され
る。

【０００４】具体的には、図６において、顕微鏡本体１
０２にはミラー１０３および対物レンズ１０４が設けら
れており、図５のスキャナー１０１にて走査された励起
レーザ光はまずミラー１０３に入射し、このミラー１０
３で反射されて対物レンズ１０４に導かれる。この試料
からは、励起レーザ光の励起によって蛍光が発せられ、
この蛍光がスキャナー１０１の内部に設けた結像光学系
を介してピンホール上に結像される。このピンホール
は、結像光学系からの集束光を選択的に通過させ、この
光が蛍光検出器（光電子倍増管）にて検出され、試料の
観察が行われる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のような方式で
は、試料から放出される蛍光は、通常、スキャナー１０
１の内部に設けたピンホール上に結像するようになって
いおり、ピンホールと蛍光検出器との間隔が広いほど、
ピンホール通過後の光が発散光となる（本実施形態の図
２参照）。

【０００６】なお、蛍光を使用するタイプの共焦点顕微
鏡について述べたが、試料からの反射光を検出するタイ
プの共焦点顕微鏡も同様な課題がある。そのため、光検
出器（蛍光検出器など）は、その最も効率よく受光でき
る波長帯域から外れた光を検出することになり、光検出
器の検出感度が減少し、得られる画像が暗くなるという
問題があった。特に、複数の蛍光検出器を使用するレー
ザ走査型蛍光顕微鏡では、ピンホールと蛍光検出器との
間隔が狭いものと広いものとが混在し、特に間隔が広い
ものでは、上記問題が顕著である。

【０００７】本発明は、上記課題を解決し、開口（例え
ばピンホール）を通過して光電検出素子に入射する試料
からの光が発散せず、受光効率の良い共焦点顕微鏡を提
供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】請求項１に記載の発明で
は、光源（２３，２４）と、前記光源からの光を試料に
集束させる対物レンズ（２７）と、前記試料からの戻り
光を集束させる結像光学系（９，１０，１１，１２，１
４）と、前記結像光学系からの集束光を選択的に通過さ
せる開口（１５）と、前記開口を通過した光を受光する
光電検出素子（２０−２２，３０）とを備えた共焦点顕
微鏡において、前記開口を通過した光を前記光電検出素
子上に集光する集光光学系（１９ａ−１９ｃ、１９）
を、前記開口と前記光電検出素子との間に配置したこと
を特徴とする。

【０００９】請求項２に記載の発明では、請求項１に記
載の共焦点顕微鏡において、前記光電検出素子（２０−
２２，３０）は、検出する波長帯域の異なるものが複数
配置されており、それぞれの前記光電検出素子の前には
前記波長帯域を選択する波長選択素子（１６、１７）が
配置され、前記集光光学系（１９ａ−１９ｃ）は前記光
電検出素子と前記波長選択素子との間にそれぞれ配置さ
れていることを特徴とする。

【００１０】請求項３に記載の発明では、請求項１に記
載の共焦点顕微鏡において、前記光電検出素子は、検出
する波長帯域の異なるものが複数配置されており、それ
ぞれの前記光電検出素子の前には前記波長帯域を選択す
る波長選択素子（１６，１７）が配置され、前記集光光
学系（１９）は前記開口（１５）と前記開口に最も近い
前記波長選択素子（１６）との間に一つ配置されている
ことを特徴とする。

【００１１】請求項４に記載の発明では、請求項３に記
載の共焦点顕微鏡において、複数の前記光電検出素子
は、前記集光光学系との間の距離がそれぞれ等しい位置
に配置されていることを特徴とする。

【００１２】

【実施の形態の説明】（第一実施形態）図１乃至図３は
本発明の第一実施形態を説明する図である。図１はレー
ザー走査型蛍光顕微鏡（共焦点顕微鏡）の構成図であ
る。なお、図１では主要な部材のみを記載し、各種光学
部材及び顕微鏡本体は省略している。図２は、図１のス
キャナユニット２５、リレーユニット２６の光路図であ
る。図３は、図１の蛍光検出器（光電検出素子である光
電子倍増管）２０の断面図である。

【００１３】本発明の第一実施形態の共焦点顕微鏡は、
基本的には従来技術（図５，図６）の欄で説明したよう
に構成されている。図１において、共焦点顕微鏡は、励
起レーザ光源（図５の１００と同様）と、スキャナユニ
ット２５と、リレーユニット２６（リレーレンズ１２を
含む）と、顕微鏡本体１０２（対物レンズ２７，全反射
ミラー１３等からなる）とから構成されている。

【００１４】この励起レーザ光源からは、可視光レーザ
２３と赤外光レーザ２４が出射され、スキャナユニット
２５内部に入る。この各レーザ光２３、２４はNDフィル
タ1、２で調光される。そして、可視光レーザ２３は励
起フィルタ３を通過し、ダイクロイックミラー5で全反
射され、また赤外光レーザ２４は全反射ミラー4で反射
され、ダイクロイックミラー5を通過する。これら２つ
のレーザ光は、ダイクロイックミラー5を介して、ビー
ムエキスパンダ6に入射し、全反射ミラー７，ダイクロ
ックミラー８，ガルバノミラー９，レゾナントミラー１
０，スキャナレンズ１１，リレーレンズ１２，全反射ミ
ラー１３，対物レンズ２７を介して試料２８に照射され
る。

【００１５】このビームエキスパンダ6では、以降の光
路中にある瞳（例えば、スキャナユニット２５のスキャ
ナミラー９，１０の反射面、あるいは２つのスキャナミ
ラーの中間にある）を満たす大きさにレーザビーム径を
拡大させ、対物レンズ２７の瞳を満たす大きさにする。
しかし、本実施形態の共焦点顕微鏡では、可視光レーザ
２３と赤外光レーザ２４とを使い分けているため（試料
２８の染色物質に応じて使い分ける）、このビームエキ
スパンダ６を各レーザ波長（色収差等）に応じてレンズ
間隔を変化させなければならない。さらに、ビームエキ
スパンダ６以降の光学系（７−１３、２７）の色収差補
正が十分でない場合など、対物レンズ２７で励起光が集
光する位置（対物レンズの焦点位置）が波長ごとに変化
してしまうと云った問題もあるため、それら問題を解消
するためにビームエキスパンダ６のレンズ間隔を変化さ
せなければならない。

【００１６】そのため、このビームエキスパンダ6では
可視光レーザ２３と赤外光レーザ２４との切換信号に応
じて、自動的に（モータ等で）エキスパンダ内のレンズ
間隔を変化させ、エキスパンダから出射されるビームの
拡がり角を変化させることで、全ての波長で同一焦点位
置となるようにしている。ビームエキスパンダ６により
ビーム径を拡大されたレーザ光は、ガルバノミラー９と
レゾナントミラー１０とによって２次元的に走査され、
スキャナレンズ１１およびリレーレンズ１２を介して顕
微鏡本体に導入され、対物レンズ２７で集光され試料２
８上に照射される。これにより、試料２８は蛍光を発す
る。

【００１７】試料２８から放出される蛍光は、リレーユ
ニット２６を介してスキャナユニット２５に入り、ガル
バノミラー９とレゾナントミラー１０とで反射されるこ
とによってデスキャニングされる。その蛍光は後方にあ
るピンホール１５上に、集光レンズ１４によって集束光
となる。次に、図２を用いてピンホール１５以降の光学
系の構成を説明する。

【００１８】ピンホール１５を通過した蛍光は、ダイク
ロイックキューブ（波長選択素子）１６により選択され
た第１の波長帯域の蛍光のみが反射され、集光レンズ室
２９ｃ（集光レンズ１９ｃを含む）により蛍光検出器２
０の受光面３０に集光される。そして、ダイクロイック
キューブ１６を通過した蛍光（第１の波長帯域を除く）
は、ダイクロイックキューブ１７により選択された第２
の波長帯域の蛍光のみが反射され、集光レンズ室２９ｂ
（集光レンズ１９ｂを含む）により蛍光検出器２１の受
光面３０に集光される。また、ダイクロイックキューブ
１７を通過した第３の波長帯域の蛍光（第１、第２の波
長帯域を除く）は、全反射ミラー１８により反射され、
集光レンズ室２９ａ（集光レンズ１９ａを含む）により
蛍光検出器２２の受光面３０に集光される。なお、図
１，図２では３重染色における検出系の構成を示してい
る。

【００１９】図３に示すように集光レンズ１９ａ−１９
ｃは、蛍光がピンホール１５通過後、各蛍光検出器２０
−２２の受光面３０上にその焦点を結ぶような焦点距離
と、その配置が決められており、集光レンズ室２９ａ−
２９ｃによってスキャナユニット２５にビスなどで取り
付けられる。即ち、各蛍光検出器２０，２１，２２と、
ダイクロイックキューブ１６、１７、全反射ミラー１８
との間には、それぞれ集光光学系である集光レンズ室２
９ｃ、２９ｂ、２９ａが設けられている。そのため、集
光レンズ１９ａ−１９ｃに光を導く光学系（９−１２，
１４，１５等）の取り付け精度や、蛍光検出器２０−２
２の取り付け精度などが多少悪くても、ピンホール１５
通過後の蛍光は各検出器の受光面３０のほぼ中央に集光
される。そして、スキャナユニット２５の製造、組立が
容易となり、受光効率も低下させることがない。特に、
ピンホール１５から最も遠い位置にある蛍光検出器２２
は、ピンホール１５を通過した蛍光が発散光となり、一
般的には受光効率が低下してしまうが、集光レンズ室２
９ａが配置されているため、受光効率の低下を抑制でき
る。

【００２０】このように、本実施形態ではピンホール１
５と蛍光検出器２０−２２との間に集光レンズ１９ａ−
１９ｃを設ける（検出器が複数ある場合は各検出器毎に
設ける）ことによって、ピンホール通過後に発散する蛍
光又は反射光を集束光として検出器に入射させることに
よって、限られた感度幅を持つ受光素子に対して最も効
率よく蛍光又は反射光を入射させることで検出感度低下
を最小限に抑えることが出来、明るい画像を取得するこ
とが期待できる。 （第二実施形態）図４は本発明の第二実施形態のスキャ
ナユニット２５内部の構成図である。第二実施形態は、
第一実施形態の変形例であるので、第一実施形態の構成
と相違する部分のみ示し、同様な構成は省略してある。

【００２１】第一実施形態では、蛍光検出器２０−２２
の直前に、それぞれ集光レンズ１９ａ−１９ｃを設ける
構成にしていたが、第二実施形態では、この集光レンズ
を１つのみ配置する構成にした点が第一実施形態と相違
している。図４に示すように、集光レンズ１９は、ピン
ホール１５の直後に１つのみ配置され、ピンホール１５
を通過した光は、この集光レンズ１９により集光され、
各蛍光検出器２０−２２にダイクロイックキューブ１
６、１７、全反射ミラー１８を介して入射する。すなわ
ち、集光レンズ１９はピンホール１５と、ピンホール１
５に最も近いダイクロイックキューブ１６との間に一つ
配置されている。

【００２２】この各蛍光検出器２０−２２は、集光レン
ズ１９の後側焦点距離の位置に配置されており、集光レ
ンズ１９から同一距離上にある。このように構成すれ
ば、１つの集光レンズ１９により第一実施形態とほぼ同
様な効果を奏するし、コスト低減にも寄与する。なお、
上述した実施形態では、蛍光を検出するタイプの共焦点
顕微鏡について述べたが、これに限られることなく試料
からの反射光を検出するタイプの共焦点顕微鏡などで
も、ピンホール通過後の光を検出する際の課題は同じで
あり、同様に本発明を適用できる。

【００２３】

【発明の効果】請求項１に係る発明では、開口と光電検
出素子との間に集光光学系を設け、開口を通過した試料
からの蛍光又は反射光を集束光として光電検出素子に入
射させることができる。これにより、試料から放出され
る蛍光又は反射光を光電検出素子で検出する際に、開口
通過後の光を集束光とでき、検出感度の低下を最小限に
し、明るい画像を取得出来る。

【００２４】また、請求項２に係る発明では、各光電検
出素子の前に各々集光光学系を設けることにより、集光
光学系に光を導く結像光学系等の取り付け精度や、光電
検出素子の取り付け精度が多少悪くても、検出光を光電
検出素子の中央へ集光でき、検出感度等の低下を抑制で
き、明るい画像を取得できる。また、請求項３、４に係
る発明では、さらに光電検出素子の配置を工夫して、一
つの集光光学系を用いる構成とすれば、コストが低減で
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はレーザー走査型蛍光顕微鏡（共焦点顕微
鏡）の構成図である。

【図２】図２は、図１のスキャナユニット２５、リレー
ユニット２６の光路図である。

【図３】図３は、図１の蛍光検出器（光電子倍増管）２
０の断面図である。

【図４】図４は本発明の第二実施形態のスキャナユニッ
ト２５内部の構成図である。

【図５】図５はレーザ走査型蛍光顕微鏡の全体構成を示
す構成図である。

【図６】図６は図５の顕微鏡本体を示す構成図である。

【主要部品の符号の説明】

１５: ピンホール（開口） １６，１７: ダイクロイックキューブ（波長選択素
子） １８: 全反射ミラー ２５，１０１: スキャナユニット 2０，２１，２２: 蛍光検出器（光電検出素子） １９ａ，１９ｂ，１９ｃ: 集光レンズ（集光光学系） ２９ａ，２９ｂ，２９ｃ: 集光レンズ室（集光光学
系） ２７: 対物レンズ ２３，２４，１００: 励起レーザ光源

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】光源と前記光源からの光を試料に集束させ
   る対物レンズと、 前記試料からの戻り光を集束させる結像光学系と、 前記結像光学系からの集束光を選択的に通過させる開口
   と、 前記開口を通過した光を受光する光電検出素子とを備え
   た共焦点顕微鏡において、 前記開口を通過した光を前記光電検出素子上に集光する
   集光光学系を、前記開口と前記光電検出素子との間に配
   置したことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 【請求項２】前記光電検出素子は、検出する波長帯域の
   異なるものが複数配置されており、それぞれの前記光電
   検出素子の前には前記波長帯域を選択する波長選択素子
   が配置され、 前記集光光学系は前記光電検出素子と前記波長選択素子
   との間にそれぞれ配置されていることを特徴とする請求
   項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 【請求項３】前記光電検出素子は、検出する波長帯域の
   異なるものが複数配置されており、それぞれの前記光電
   検出素子の前には前記波長帯域を選択する波長選択素子
   が配置され、 前記集光光学系は前記開口と前記開口に最も近い前記波
   長選択素子との間に一つ配置されていることを特徴とす
   る請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
4. 【請求項４】複数の前記光電検出素子は、前記集光光学
   系との間の距離がそれぞれ等しい位置に配置されている
   ことを特徴とする請求項３に記載の共焦点顕微鏡。