CN114778730A - 一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药成分检测技术领域，尤其涉及一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：将含有紫菀的供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量；所述高效液相色谱法检测的条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，以四氢呋喃和甲醇为流动相A，以甲酸溶液为流动相B液，进行梯度洗脱；流动相的流速为0.32～0.38mL/min。本发明提供的检测方法实现了对紫菀药材或紫菀制品中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3‑O‑二咖啡酰奎宁酸和1,5‑O‑二咖啡酰奎宁酸6种有机酸类成分同时进行定量分析，方法准确度高、稳定性良好、重现性较好。

Description

一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法
技术领域
本发明涉及中药成分检测技术领域，尤其涉及一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法。
背景技术
中药紫菀为菊科植物Aster tataricus L.F.的干燥根和根茎。别名：青菀、紫倩、小辫或返魂草。
紫菀在我国有着悠久的应用历史，是中医治疗咳喘的常用中药，现代研究表明，紫菀中化学成分较多，主要含有三萜及其苷类、有机酸、甾醇类、蒽醌类、肽类及黄酮等。
相近似的现有方案如下：
1、中国药典2020版本含检测三萜类中的紫菀酮，紫菀酮的检测波长200nm，末端吸收，在紫菀中医药临床应用中，煎煮汤剂的质量把控中很难检测。
2、文献：UPLC法同时测定紫菀中三种绿原酸类物质的含量，仅仅只能同时检测出绿原酸、异绿原酸A和异绿原酸B。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法。
本发明提供了一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：
将含有紫菀的供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量；
所述高效液相色谱法检测的条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，以四氢呋喃和甲醇为流动相A，以甲酸溶液为流动相B液，进行梯度洗脱；
流动相的流速为0.32～0.38mL/min。
优选的，所述流动相A和流动相B的体积比为9～38：62～91；
所述流动相A中，四氢呋喃和甲醇的体积比为1：4；
所述流动相B中，甲酸溶液的质量浓度为0.08％～0.12％。
优选的，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比为：
Figure BDA0003607814610000021
优选的，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃，检测波长为325～330nm。
优选的，所述高效液相色谱法的柱温为35℃，检测波长为327nm，流动相的流速为0.35mL/min。
优选的，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18；
所述高效液相色谱法采用的检测器为DAD检测器。
优选的，所述6种有机酸包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸。
优选的，所述含有紫菀的供试品溶液按照以下方法进行制备：
将紫菀样品粉末与溶剂混合，称重，进行超声提取或回流提取，冷却后，称重，用所述溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，得到含有紫菀的供试品溶液。
优选的，所述溶剂包括甲醇、乙醇和水中的至少一种；
所述甲醇的质量浓度为50％～100％；
所述溶剂与所述紫菀样品粉末的用量比为10～50mL：0.8～1.2g。
优选的，所述超声提取或回流提取的时间为15～45min。
本发明提供了一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：将含有紫菀的供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量；所述高效液相色谱法检测的条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，以四氢呋喃和甲醇为流动相A，以甲酸溶液为流动相B液，进行梯度洗脱；流动相的流速为0.32～0.38mL/min。本发明提供的检测方法实现了对紫菀药材或紫菀制品中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸6种有机酸类成分同时进行定量分析，方法准确度高、稳定性良好、重现性较好。
附图说明
图1为本发明含有紫菀的供试品溶液的专属性UPLC图谱；
图2为新绿原酸的标准曲线图；
图3为隐绿原酸的标准曲线图；
图4为绿原酸的标准曲线图；
图5为咖啡酸的标准曲线图；
图6为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线图；
图7为1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：
将含有紫菀的供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量；
所述高效液相色谱法检测的条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，以四氢呋喃和甲醇为流动相A，以甲酸溶液为流动相B液，进行梯度洗脱；
流动相的流速为0.32～0.38mL/min。
在本发明的某些实施例中，所述流动相A中，四氢呋喃和甲醇的体积比为1：4。
在本发明的某些实施例中，所述流动相B中，甲酸溶液的质量浓度为0.08％～0.12％；甲酸溶液中的溶剂为水，具体为超纯水。
在本发明的某些实施例中，所述流动相A和流动相B的体积比为9～38：62～91。
在本发明的某些实施例中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比为：
Figure BDA0003607814610000041
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。在某些实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30℃、35℃或40℃。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法的检测波长为325～330nm。在某些实施例中，所述高效液相色谱法的检测波长为327nm。
本发明中，流动相的流速为0.32～0.38mL/min。在本发明的某些实施例中，流动相的流速为0.35mL/min。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相。在某些实施例中，固定相的柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为ACQUITY UPLCHSS T3 C18、ZORBAX SB-C18、ZORBAX Extend-C18或ZORBAX SB-Aq C18；具体的可以为Agilent ZORBAX SB-Aq C18。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的检测器为二极管阵列检测器(又称DAD检测器)。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的高效液相色谱仪包括Waters ACQUITY UPLC H-CLASS型超高效液相色谱仪或Agilent 1290Infinity II型超高效液相色谱仪。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的进样量为1～2.5μL；优选为1～2μL。在某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的进样量为1μL、1.5μL、2μL或2.5μL。
在本发明的某些实施例中，所述6种有机酸包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸。
在本发明的某些实施例中，所述同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：
将含有紫菀的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量。
所述高效液相色谱法检测的条件同上，在此不再赘述。
在本发明的某些实施例中，所述含有紫菀的供试品溶液按照以下方法进行制备：
将紫菀样品粉末与溶剂混合，称重，进行超声提取或回流提取，冷却后，称重，用所述溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，得到含有紫菀的供试品溶液。
在本发明的某些实施例中，所述过滤后，还包括：取续滤液。
在本发明的某些实施例中，所述紫菀样品粉末包括紫菀药材粉末或紫菀制品粉末。在本发明的某些实施例中，所述紫菀样品粉末过三号筛。
在本发明的某些实施例中，所述溶剂包括甲醇、乙醇和水中的至少一种。在某些实施例中，所述甲醇的质量浓度为30％～100％；优选为50％～100％。在某些实施例中，所述甲醇的质量浓度为30％、50％、70％或100％。在某些实施例中，所述乙醇的质量浓度为100％。在某些实施例中，所述水为超纯水。
在本发明的某些实施例中，溶剂与所述紫菀样品粉末的用量比为10～50mL：0.8～1.2g。在某些实施例中，溶剂与所述紫菀样品粉末的用量比为10mL：1g、25mL：1g或50mL：1g；优选为50mL：1g。
在本发明的某些实施例中，将紫菀样品粉末与溶剂在具塞锥形瓶中混合。
在本发明的某些实施例中，所述超声提取或回流提取的时间为15～45min。在某些实施例中，所述超声提取或回流提取的时间为15min、30min或45min；优选为30min。
在本发明的某些实施例中，所述对照品溶液包括所述6种有机酸中的至少一种的溶液；具体的，可以为所述6种有机酸中的任意一种的溶液。在本发明的某些实施例中，所述对照品溶液为绿原酸溶液。
在本发明的某些实施例中，所述绿原酸溶液的溶剂与所述含有紫菀的供试品溶液中的溶剂相同。
在本发明的某些实施例中，所述绿原酸溶液的浓度为18～22μg/mL。在某些实施例中，所述绿原酸溶液的浓度为20μg/mL。
在本发明的某些实施例中，所述高效液相色谱法采用的理论塔板数按绿原酸计不低于3000。
本发明用绿原酸对照品溶液一测多评检测其他有机酸类化合物，准确度高、稳定性良好、重现性较好，并在煎煮汤剂的质量把控中得到了很好的应用。
本发明对上文采用的原料来源并无特殊的限制，可以为一般市售。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
仪器：
高效液相色谱仪：Waters ACQUITY UPLC H-CLASS型超高效液相色谱仪、Agilent1290Infinity II型超高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E、MS205DΜ、XPE26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 C18 2.1*100mm 1.8μm、ZORBAX SB-C18 2.1*100mm 1.8μm、ZORBAX Extend-C18 2.1*100mm 1.8μm、Agilent ZORBAXSB-Aq C18 2.1*100mm 1.8μm；实施例1～9选用ZORBAXSB-Aq C18 2.1*100mm 1.8μm；
试药：
绿原酸(中国食品药品检定研究院，110753-201717，含量以96.8％计)；
新绿原酸(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq18030107，含量以98.0％计)；
隐绿原酸(四川省维克奇生物科技有限公司，wkq19011612，含量以98.0％计)；
咖啡酸(中国食品药品检定研究院，110885-201703，含量以99.7％计)；
1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(中国食品药品检定研究院，111717-201402，含量以94.5％计)
1,5-O-二咖啡酰奎宁酸(成都曼思特生物科技有限公司，MUST-19040105，含量以99.29％计)
四氢呋喃、甲酸、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
紫菀药材(来源于原药库，批号：010556-1901002)
对照品溶液的制备：
取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇(质量浓度为100％)制成每1mL含20μg的对照品溶液。
含有紫菀的供试品溶液的制备：
取紫菀药材粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇(质量浓度为100％)50mL，密塞，称定重量，加热回流提取30min，取出，冷却后，再称定重量，用甲醇(质量浓度为100％)补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，得到含有紫菀的供试品溶液。
色谱条件选择：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，以四氢呋喃和甲醇(体积比1：4)为流动相A，以质量浓度为0.1％的甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比为：
Figure BDA0003607814610000081
流动相的流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量1μL，检测波长为327nm。
实施例1色谱条件选择与系统适用性考察
进样量考察
考察含有紫菀的供试品溶液四个不同进样量1μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL对药材中目标成分的分离效果的影响，结果见表1～表4。
表1进样量1μL的考察结果
Figure BDA0003607814610000082
表2进样量1.5μL的考察结果
Figure BDA0003607814610000083
表3进样量2.0μL的考察结果
Figure BDA0003607814610000091
表4进样量2.5μL的考察结果
Figure BDA0003607814610000092
实验结果表明，当进样量为1～2μL时，各成分与其相邻峰的分离度较大，分离效果好；当进样量为2.5μL时，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸与相邻峰的分离度为1.63>1.5，符合要求；但为保证在后续实验中的每针数据中的各成分均能达到分离要求，故选择进样量为1～2μL较为合适，且最终固定后续实验进样量为1μL。
流速考察
改变上述色谱条件中的流动相的流速，考察含有紫菀的供试品溶液在0.30mL/min、0.35mL/min、0.40mL/min三种流速下的分析情况，以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸六种成分的分离度、理论塔板数等作为评价指标。结果见表5～表7。
表5流速0.30mL/min的考察结果
Figure BDA0003607814610000093
Figure BDA0003607814610000101
表6流速0.35mL/min的考察结果
Figure BDA0003607814610000102
表7流速0.40mL/min的考察结果
Figure BDA0003607814610000103
实验结果表明，在流速为0.30mL/min和0.40mL/min下，部分色谱峰的理论塔板数、分离度均不符合要求,最后确定流速范围为0.32～0.38mL/min。
柱温考察
改变上述色谱条件中的柱温，考察含有紫菀的供试品溶液在30℃、35℃、40℃三种柱温下的分离情况，以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸六种成分的分离度、理论塔板数等作为评价指标。结果见表8～表10。
表8柱温30℃的分析结果
Figure BDA0003607814610000104
Figure BDA0003607814610000111
表9柱温35℃的分析结果
Figure BDA0003607814610000112
表10柱温40℃的分析结果
Figure BDA0003607814610000113
实验结果表明，三种柱温下，目标成分均能被有效的分离。
色谱条件选择与系统适用性考察结果
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为100mm，内径为2.1mm，粒径为1.8μm)，以四氢呋喃和甲醇(体积比1：4)为流动相A，以质量浓度为0.1％的甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比为：
Figure BDA0003607814610000121
流动相的流速为0.35mL/min，柱温为35℃，检测波长为327nm，理论塔板数按绿原酸计不低于3000。
实施例2供试品溶液制备方法的考察
提取方式考察
改变上述供试品溶液制备中的提取方式，取紫菀药材粉末(过三号筛)4份各1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇(质量浓度为100％)25mL，密塞，称定重量，2份超声提取、2份回流提取，提取时间均为30min，冷却后，再称定重量，用(质量浓度为100％)补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液1μL注入色谱仪，分析计算不同提取方式下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的质量含量总量，结果见表11～表18。
表11不同提取方式中新绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000122
表12不同提取方式中绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000123
Figure BDA0003607814610000131
表13不同提取方式中隐绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000132
表14不同提取方式中咖啡酸含量结果
Figure BDA0003607814610000133
表15不同提取方式中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000134
表16不同提取方式中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000135
表17不同提取方式中总含量结果
Figure BDA0003607814610000141
表18不同提取方式中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000142
实验结果表明，超声提取和回流提取所得绿原酸(C16H18O9)、新绿原酸(C16H1809)、隐绿原酸(C16H1809)、咖啡酸(C9H804)、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(C25H24012)和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸(C25H24012)的总量分别为0.223％和0.237％，两种提取方式下总含量差异不明显。
提取溶剂考察
改变上述供试品溶液制备中的提取溶剂，取紫菀药材粉末(过三号筛)，12份各1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入超纯水、30％甲醇(即甲醇的质量浓度为30％)、50％甲醇(即甲醇的质量浓度为50％)、70％甲醇(即甲醇的质量浓度为70％)、甲醇(即甲醇的质量浓度为100％)、乙醇(即乙醇的质量浓度为100％)各25mL，密塞，称定重量，回流提取30min，冷却后，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液1μL注入色谱仪，分析计算不同提取溶剂下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的质量含量总量。结果见表19～表26。
表19不同提取溶剂中新绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000151
表20不同提取溶剂中隐绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000152
表21不同提取溶剂中绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000153
Figure BDA0003607814610000161
表22不同提取溶剂中咖啡酸含量结果
Figure BDA0003607814610000162
表23不同提取溶剂中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000163
表24不同提取溶剂中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000171
表25不同提取溶剂中总含量结果
Figure BDA0003607814610000172
表26不同提取溶剂中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000173
Figure BDA0003607814610000181
实验结果表明，以30％甲醇、50％甲醇、70％乙醇、水、甲醇、乙醇作为提取溶剂时，50％-100％甲醇提取率最高。
提取时间考察
改变上述供试品溶液制备中的提取时间，取紫菀药材粉末(过三号筛)6份各1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，每两份为一平行样，分别回流提取15min、30min、45min，取出、冷却后，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液1μL注入色谱仪，分析计算不同提取时间下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的质量含量总量。结果见表27～表34。
表27不同提取时间中新绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000182
表28不同提取时间中隐绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000191
表29不同提取时间中绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000192
表30不同提取时间中咖啡酸含量结果
Figure BDA0003607814610000193
表31不同提取时间中1，3-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000194
表32不同提取时间中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000201
表33不同提取时间中总含量结果
Figure BDA0003607814610000202
表34不同提取时间中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000203
实验结果表明，提取时间为30min时，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量总量最高，故选择提取时间为30min。
溶剂加入量考察
取本品粉末，过三号筛，6份各约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每两份为一平行样，分别精密加入甲醇10mL，25mL，50mL，密塞，称定重量，回流提取30分钟，取出、放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。取续滤液1μL注入色谱仪，分析计算不同提取溶剂加入量下新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的质量含量总量，结果见表35～表42。
表35不同溶剂加入量中新绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000211
表36不同溶剂加入量中隐绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000212
表37不同溶剂加入量中绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000213
表38不同溶剂加入量中咖啡酸含量结果
Figure BDA0003607814610000221
表39不同溶剂加入量中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000222
表40不同溶剂加入量中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000223
表41不同溶剂加入量中总含量结果
Figure BDA0003607814610000224
表42不同提取溶剂加入量中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000231
实验结果表明，溶剂加入量为50mL时，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的含量总量最高，故选择溶剂加入量为50mL。
供试品溶液制备方法确定
取紫菀药材粉末(过三号筛)1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇(质量浓度为100％)50mL，密塞，称定重量，加热回流提取30min，取出，冷却后，再称定重量，用甲醇(质量浓度为100％)补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，得到含有紫菀的供试品溶液。
实施例3专属性实验
按照实施例2确定的制备方法制备含有紫菀的供试品溶液以及空白对照溶液(空白对照溶液不含有紫菀药材粉末)，分别采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，结果如图1所示。图1为本发明含有紫菀的供试品溶液的专属性UPLC图谱。
从图1可知，空白对照溶液的色谱图对待测峰的测定无干扰，表明本发明提供的检测方法专属性好。
实施例4精密度实验
取对照品溶液连续进样5次，采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，记录绿原酸的峰面积，计算RSD值，结果见表43。
表43精密度考察结果
Figure BDA0003607814610000241
实验结果表明，精密度考察中绿原酸的峰面积RSD值均为0.4％，表明本发明提供的检测方法精密度良好。
实施例5线性关系实验
取绿原酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加甲醇(质量浓度为100％)分别配制成绿原酸浓度为156.50624μg/mL、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为150.444208μg/mL的混合对照品储备液1，分别精密依次吸取0.2mL、0.8mL、1.5mL、2.5mL、5.0mL稀释至10mL，得到浓度为3.1301248μg/mL、12.520499μg/mL、23.475936μg/mL、39.12656μg/mL、78.25312μg/mL的绿原酸对照品溶液及浓度为3.00888416μg/mL、12.03553664μg/mL、22.5666312μg/mL、37.611052μg/mL、75.222104μg/mL的1,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液。取新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸对照品适量，加甲醇分别配制成新绿原酸浓度为61.936μg/mL、隐绿原酸95.0404μg/mL、咖啡酸95.37302μg/mL、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为89.6616μg/mL的混合对照品储备液2，分别精密依次量取0.1mL、0.8mL、1.5mL、2.5mL、5.0mL稀释至10mL，得到新绿原酸对照品溶液浓度分别为0.61936μg/mL、4.95488μg/mL、9.2904μg/mL、15.484μg/mL、30.968μg/mL；隐绿原酸对照品溶液浓度分别为0.950404μg/mL、7.603232μg/mL、14.25606μg/mL、23.7601μg/mL、47.5202μg/mL；咖啡酸对照品溶液浓度分别为0.95373μg/mL、7.629842μg/mL、14.30595μg/mL、23.84326μg/mL、47.68651μg/mL；1,3-O-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液浓度分别为0.896616μg/mL、7.629842μg/mL、14.30595μg/mL、23.84326μg/mL、47.68651μg/mL。分别取上述各溶液1μL注入液相色谱仪，采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，分析得到峰面积，以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制响应曲线，结果见表44～表49、图2～图7。图2为新绿原酸的标准曲线图；图3为隐绿原酸的标准曲线图；图4为绿原酸的标准曲线图；图5为咖啡酸的标准曲线图；图6为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线图；图7为1,5-O-二咖啡酰奎宁酸的标准曲线图。
表44新绿原酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000251
表45隐绿原酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000252
表46绿原酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000253
表47咖啡酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000254
表48 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000261
表49 1,5-O-二咖啡酰奎宁酸标准曲线分析结果
Figure BDA0003607814610000262
实验结果表明，新绿原酸标准曲线为Y＝8.2727x-0.1023，R2＝1.0000，说明样品中新绿原酸浓度在0.61936～61.936μg/mL范围内，线性关系良好；隐绿原酸标准曲线为Y＝8.2475x-0.7563，R2＝1.0000，说明样品中隐绿原酸浓度在0.950404～95.0404μg/mL范围内，线性关系良好；绿原酸标准曲线为Y＝8.7925x-3.3709，R2＝1.0000，说明样品中绿原酸浓度在3.1301248～156.50624μg/mL范围内，线性关系良好；1,5-O-二咖啡酰奎宁酸标准曲线为Y＝10.1774x-6.7092，R2＝1.0000，说明样品中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸浓度在3.00888416～150.444208μg/mL范围内，线性关系良好；1,3-O-二咖啡酰奎宁酸标准曲线为Y＝9.6812x-1.5151，R2＝0.9999，说明样品中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度在0.896616～89.6616μg/mL范围内，线性关系良好。
实施例6稳定性实验
取同一含有紫菀的供试品溶液(批号：010556-1901002)，按照实施例2确定的制备方法制备供试品溶液，采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，分别在0h、2h、4h、10h、16h、24h测定新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸六种成分的含量，并计算质量含量总和及RSD，结果见表50～表57。
表50稳定性实验中新绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000263
Figure BDA0003607814610000271
表51稳定性实验中隐绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000272
表52稳定性实验中绿原酸含量结果
Figure BDA0003607814610000273
表53稳定性实验中咖啡酸含量结果
Figure BDA0003607814610000274
表54稳定性实验中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000275
Figure BDA0003607814610000281
表55稳定性实验中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸含量结果
Figure BDA0003607814610000282
表56稳定性实验中总含量结果
Figure BDA0003607814610000283
表57稳定性实验中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000284
Figure BDA0003607814610000291
实验结果表明，本实施例中，六种成分含量总和的RSD值0.9％，供试品溶液在24h内稳定性良好。
实施例7重复性实验
取同一含有紫菀的供试品溶液(批号：010556-1901002)1.0g，精密称定6份，由同一操作人员按照实施例2确定的制备方法制备供试品溶液，采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，计算6份供试品的质量含量，结果见表58～表65。
表58重复性实验中新绿原酸结果
Figure BDA0003607814610000292
表59重复性实验中隐绿原酸结果
Figure BDA0003607814610000293
表60重复性实验中绿原酸结果
Figure BDA0003607814610000294
Figure BDA0003607814610000301
表61重复性实验中咖啡酸结果
Figure BDA0003607814610000302
表62重复性实验中1,5-O-二咖啡酰奎宁酸结果
Figure BDA0003607814610000303
表63重复性实验中1,3-O-二咖啡酰奎宁酸结果
Figure BDA0003607814610000304
表64重复性实验中总含量结果
Figure BDA0003607814610000305
Figure BDA0003607814610000311
表65重复性实验中相对保留时间结果
Figure BDA0003607814610000312
实验结果表明，6种成分含量总和的RSD值为1.7％，表明本发明提供的检测方法重复性良好。
实施例8中间精密度实验
分别精密称取紫菀药材(批号：010556-1901002)，精密称定12份，由不同操作人员(A、B)在不同时间(Ⅰ、II)按照实施例2确定的制备方法制备供试品溶液，采用实施例1考察后得到的检测条件进行检测，分别在Waters ACQUITY UPLC H-CLASS型超高效液相色谱仪、Agilent 1290 Infinity II型超高效液相色谱仪上进行测定。结果见表66～表67。
表66不同仪器考察结果
Figure BDA0003607814610000313
Figure BDA0003607814610000321
表67相对保留时间
Figure BDA0003607814610000322
实验结果表明，用上述2种仪器对供试品进行检测时，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸六种成分含量总量的RSD值为3.6％，表明本发明提供的检测方法中间精密度较好。
实施例9加样回收率实验
取已知含量(新绿原酸0.009％，隐绿原酸0.01555％，绿原酸0.0742％，咖啡酸0.00825％，1,3-O-二咖啡酰奎宁酸0.01275％，1,5-O-二咖啡酰奎宁酸0.09505％)的供试品(批号：010556-1901002)0.5g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸对照品，按照实施例2确定的制备方法制备供试品溶液并测定，计算回收率，结果见表68～表74。计算公式如下式所示：
Figure BDA0003607814610000331
表68新绿原酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000332
表69隐绿原酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000333
表70绿原酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000334
Figure BDA0003607814610000341
表71咖啡酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000342
表72 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000343
表73 1,5-O-二咖啡酰奎宁酸加样回收实验结果
Figure BDA0003607814610000344
Figure BDA0003607814610000351
表74相对保留时间
Figure BDA0003607814610000352
实验结果表明，新绿原酸回收率为90.02％～99.84％，平均值为94.74％；隐绿原酸回收率为92.25％～107.24％，平均值为101.31％；绿原酸回收率为96.22％～103.80％，平均值为100.79％；咖啡酸回收率为87.02％～92.87％，平均值为89.59％；1,3-O-二咖啡酰奎宁酸回收率为90.82％～98.72％，平均值为95.46％；1,5-O-二咖啡酰奎宁酸回收率为95.81％～104.26％，平均值为99.49％；表明本发明提供的检测方法准确度良好。
实施例10耐用性实验
采用不同品牌色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 C18 2.1*100mm 1.8μm、ZORBAX SB-C18 2.1*100mm 1.8μm、ZORBAX Extend-C18 2.1*100mm 1.8μm、Agilent ZORBAX SB-AqC18 2.1*100mm 1.8μm对同一供试品进行检测，结果见表75。
表75耐用性考察结果
Figure BDA0003607814610000353
Figure BDA0003607814610000361
由于色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 C18和ZORBAX SB-C18分析供试品时，隐绿原酸与绿原酸出峰顺序发生变化，不适用于紫菀药材含量测定；又由上表可知，色谱柱ZORBAXSB-Aq C18和ZORBAX Extend-C18测出的供试品中六种成分含量总和RSD值为33.11％，ZORBAX Extend-C18不满足耐用性限度规定值，故最终规定紫菀药材含量测定使用的色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18。实验结果表明，本发明提供的检测方法实现了对紫菀药材或紫菀制品中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸6种有机酸类成分同时进行定量分析，方法准确度高、稳定性良好、重现性较好。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种同时检测紫菀药材或紫菀制品中6种有机酸的方法，包括以下步骤：
将含有紫菀的供试品溶液采用高效液相色谱法进行检测，得到6种有机酸的含量；
所述高效液相色谱法检测的条件包括：
流动相包括流动相A和流动相B，以四氢呋喃和甲醇为流动相A，以甲酸溶液为流动相B液，进行梯度洗脱；
流动相的流速为0.32～0.38mL/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B的体积比为9～38：62～91；
所述流动相A中，四氢呋喃和甲醇的体积比为1：4；
所述流动相B中，甲酸溶液的质量浓度为0.08％～0.12％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比为：
Figure FDA0003607814600000011
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃，检测波长为325～330nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为35℃，检测波长为327nm，流动相的流速为0.35mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18；
所述高效液相色谱法采用的检测器为DAD检测器。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述6种有机酸包括绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸和1,5-O-二咖啡酰奎宁酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有紫菀的供试品溶液按照以下方法进行制备：
将紫菀样品粉末与溶剂混合，称重，进行超声提取或回流提取，冷却后，称重，用所述溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，得到含有紫菀的供试品溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述溶剂包括甲醇、乙醇和水中的至少一种；
所述甲醇的质量浓度为50％～100％；
所述溶剂与所述紫菀样品粉末的用量比为10～50mL：0.8～1.2g。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述超声提取或回流提取的时间为15～45min。
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曲艳丽;刘治民;孙冶;刘雨过;杨建龙;: "山紫菀药材的质量标准研究", 中国药房, no. 08, pages 1057 - 1060 *
王曼;王敏;张梅;: "一测多评法在中药材及制剂质量控制中的研究进展", 中药与临床, no. 06, pages 59 - 63 *

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