CN114767783B - 麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用、药物和保健品。麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用，麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮。预防或治疗帕金森病的药物，包括麦冬水提物和麦冬醇提物；麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮。保健品，包括上述麦冬提取物。麦冬醇提物，其主要含有的物质为皂苷和高异黄酮而非麦冬多糖，其对帕金森病有好的预防和治疗效果，具有广阔的市场应用前景。

Description

麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用、药物及保健品。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年人群的慢性神经退行性疾病，发病率仅次于阿尔兹海默病。据统计，我国65岁以上人群中PD的患病率约为1.7％。随着我国人口老龄化的加剧和人均寿命的增加，PD的发病率有逐年增加的趋势。临床上，帕金森病以静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等为主要症状。研究发现，帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，纹状体多巴胺含量显著性减少，以及黑质残存神经元胞质内出现嗜酸性包涵体即路易小体，但是造成这些病理变化的确切病因目前仍不清楚。目前，多巴胺替代疗法是帕金森病的一线治疗药物，左旋多巴是帕金森病治疗的“金标准”。然而，左旋多巴只能轻微缓解帕金森病的症状，并不能终止帕金森病病情的发展，长期服用还会出现药效减退、运动波动、异动症、精神异常等不良反应，限制了其临床应用。因此，亟需寻求更为安全有效的帕金森病治疗药物。
中药具有多靶点、多途径、整体作用等特点，在治疗帕金森病方面具有一定的优势，且长期服用不良反应小，成为近年来帕金森病新药开发的研究热点。麦冬又名麦门冬、沿阶草，来源于百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根，是常用的滋阴中药，始载于《神农本草经》，列为上品，常用于治疗肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等病症。现代研究表明，麦冬含有甾体皂苷、高异黄酮、多糖、挥发油、氨基酸等成分，具有心血管保护、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、镇咳、抗微生物、抗糖尿病等多种药理活性。贾敬选等利用中医传承辅助系统，对《中医方剂大辞典》中治疗帕金森病方剂进行了组方规律研究，发现在60篇处方，203种药物中，麦冬出现在关联度较高的组合中的频次最高为6次。麦冬性微寒，归心、肺、胃经，对于多发于罹患慢性病且生活质量欠佳的老年患者的帕金森病，具有养阴清热、调理脏腑的功效。文献报导表明，麦冬多糖可通过抑制细胞内氧化应激和内质网应激的增加，抑制Notch信号通路，从而对MPP+诱导的PC-12细胞损伤发挥保护作用。本领域一般认为麦冬多糖是使麦冬具有预防或治疗帕金森病的物质。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用、药物和保健品。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用，麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮。
在可选的实施方式中，麦冬提取物还包括麦冬水提物，麦冬水提物包括单糖、低聚果糖和多糖。
在可选的实施方式中，单糖包括果糖和葡萄糖；低聚果糖包括蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
在可选的实施方式中，按照占对应植物干重的质量百分比计，所述麦冬水提物含有：果糖4.96-7.40％、葡萄糖2.66-2.73％、蔗糖0.20-0.30％、蔗果三糖0.01-0.15％、蔗果四糖0.12-0.27％、蔗果五糖0.04％以及多糖2.30-4.93％。
在可选的实施方式中，麦冬水提物的制备方法包括：
将粉碎后的麦冬块根与水按照1:8～12的料液比混合，于80～100℃下加热回流提取1.5～2.5h至少一次，每次提取后固体分离得到提取液；
去除得到的提取液中的水分得到麦冬水提物干粉；
优选地，回流提取次数为3次，合并三次的提取液然后去除水分；
优选地，去除水分的方式为先浓缩后干燥。
在可选的实施方式中，皂苷包括麦冬皂苷C、麦冬皂苷Ra、14α-hydroxy-sprengerinin C、麦冬皂苷D、山麦冬皂苷J和麦冬皂苷D'；高异黄酮包括甲基麦冬黄酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B和6-醛基异麦冬黄酮A。
在可选的实施方式中，按照占对应植物干重的量计，麦冬醇提物中各成分含量为麦冬皂苷C12.15～31.09μg/g、麦冬皂苷Ra 26.57～88.28μg/g、14α-hydroxy-sprengerinin C 32.55～34.68μg/g、麦冬皂苷D 22.77～73.19μg/g、山麦冬皂苷J11.85～15.68μg/g、麦冬皂苷D'24.15～28.65μg/g；甲基麦冬黄酮A 5.72～33.83μg/g、甲基麦冬黄烷酮A 51.90～102.64μg/g、甲基麦冬黄烷酮B 52.61～186.88μg/g以及6-醛基异麦冬黄酮A 9.34-60.98μg/g。
在可选的实施方式中，麦冬醇提物的制备方法包括：
将粉碎后麦冬块根与浓度为70％～100％v/v的醇溶液按照1:8～12的料液比混合，于70～90℃下加热回流提取1.5～2.5h至少一次，每次提取后固体分离得到提取液；
去除得到的提取液中的水和醇得到麦冬醇提物浸膏；
优选地，去除中水和醇的方式为先浓缩后干燥。
第二方面，本发明提供一种预防或治疗帕金森病的药物，包括麦冬提取物，所述麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮；
优选地，麦冬提取物还包括麦冬水提物，麦冬水提物包括麦冬多糖、单糖和低聚果糖。
第三方面，本发明提供一种保健品，包括麦冬提取物，包括麦冬水提物和麦冬醇提物；麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮；
优选地，麦冬提取物还包括麦冬水提物，麦冬水提物包括单糖、低聚果糖和多糖。
本发明具有以下有益效果：
麦冬醇提物以及水提物具有较好的预防或治疗帕金森病的作用，特别是麦冬醇提物，其主要含有的物质为皂苷和高异黄酮而非麦冬多糖，但是研究表明其对预防或治疗帕金森病有明显的效果，这与本领域一般认为的是麦冬多糖对于帕金森病有好的预防和治疗效果不同。麦冬醇提物具有开发成预防或治疗帕金森病的药物和保健食品的潜力，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为麦冬醇提物的UPLC图谱；
图2为麦冬水提物的HPLC图谱；
图3为麦冬提取物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性实验结果(实验结果用Mean±SD表示，n＝4。***P<0.001，与对照组相比)；
图4为麦冬提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用实验结果(实验结果用Mean±SD表示，n＝4。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，与MPP+组相比)；
图5为麦冬提取物对帕金森病模型小鼠的转棒行为影响实验结果(实验结果用Mean±SD表示，n＝12。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，与MPTP组相比)；
图6为麦冬提取物对帕金森病模型小鼠的爬杆行为影响实验结果(实验结果用Mean±SD表示，n＝12。**P<0.01；***P<0.001，与MPTP组相比)；
图7为麦冬提取物对帕金森病模型小鼠的黑质TH+神经元的影响实验结果(实验结果用Mean±SD表示，n＝6。***P<0.001，与MPTP组相比)；
图8为麦冬提取物对帕金森病模型小鼠的肝、心、脾、肺、肾的H&E染色结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用、药物及保健品进行具体描述。
本申请实施例提供的麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用，麦冬提取物包括麦冬醇提物；麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮。
麦冬醇提物含有皂苷和高异黄酮，发明人发现，含有这些皂苷和高异黄酮的醇提物对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用，因此该醇提物对于预防或治疗帕金森病有一定的效果，因此可应用于制备预防或治疗帕金森病的药物中。
优选地，麦冬醇提物中，皂苷包括麦冬皂苷C、麦冬皂苷Ra、14α-hydroxy-sprengerinin C、麦冬皂苷D、山麦冬皂苷J和麦冬皂苷D'；高异黄酮包括甲基麦冬黄酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B和6-醛基异麦冬黄酮A。
进一步地，按照占对应植物干重的量计，麦冬醇提物中各成分含量为麦冬皂苷C12.15～31.09μg/g、麦冬皂苷Ra 26.57～88.28μg/g、14α-hydroxy-sprengerinin C32.55～34.68μg/g、麦冬皂苷D 22.77～73.19μg/g、山麦冬皂苷J 11.85～15.68μg/g、麦冬皂苷D'24.15～28.65μg/g；甲基麦冬黄酮A 5.72～33.83μg/g、甲基麦冬黄烷酮A 51.90～102.64μg/g、甲基麦冬黄烷酮B 52.61～186.88μg/g以及6-醛基异麦冬黄酮A 9.34-60.98μg/g。
发明人研究发现含有以上成分的麦冬醇提物对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有较好的保护作用。
优选地，麦冬醇提物的制备方法为：
麦冬醇提物按照如下方法制备：取麦冬块根粉碎，按1:8～12(优选1:10)料液比，加70％～100％v/v浓度的乙醇水溶液，于70～90℃下加热回流提取1.5～2.5h(优选2h)至少一次(优选为3次)，每次提取后过滤得到提取液，若一次提取则得到的提取液直接浓缩、干燥(优选冷冻干燥)，若多次提取则合并提取液后进行浓缩、干燥，最终得到麦冬醇提物浸膏。
测麦冬醇提物浸膏的成分含量，测试方式为：
采用UPLC检测，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，柱温30℃，流速0.4mL/min。流动相梯度洗脱条件为：0-2min，30％乙腈，70％水；2-4min，30-35％乙腈，70-65％水；4-10min，35-40％乙腈，65-60％水；10-22min，40-43％乙腈，60-57％水；22-24min，43-46％乙腈，57-54％水；24-27min，46％乙腈，54％水；27-29min，46-49％乙腈，54-51％水；29-39min，49-52％乙腈，51-48％水；39-43min，51-100％乙腈，49-0％水。电雾式检测器：雾化气：N2；雾化气压力：64.2psi；喷雾器温度：35℃；采样频率：10Hz；增益：8。
优选地，麦冬提取物还包括麦冬水提物，麦冬水提物包括单糖、低聚果糖和多糖。麦冬水提物包括麦冬多糖，其对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用，因此该水提物对于预防或治疗帕金森病也有一定的效果，可应用于制备预防或治疗帕金森病的药物中。因此，在具体应用中，可将麦冬醇提物和麦冬水提物配合使用。
优选地，单糖包括果糖和葡萄糖；低聚果糖包括蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
进一步地，按照占对应植物干重的质量百分比计，所述麦冬水提物含有果糖4.96-7.40％、葡萄糖2.66-2.73％、蔗糖0.20-0.30％、蔗果三糖0.01-0.15％、蔗果四糖0.12-0.27％以及蔗果五糖0.04％。
发明人研究发现以上成分的麦冬水提物对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有较好的保护作用。
优选地，麦冬水提物的制备方法为：
取麦冬块根粉碎，按1:8～12(优选1:10)料液比，加蒸馏水，于80～100℃下加热回流提取1.5～2.5h(优选2h)至少一次(优选为3次)，每次提取后过滤得到提取液，若一次提取则得到的提取液直接浓缩、干燥(优选冷冻干燥)，若多次提取则合并提取液后进行浓缩、干燥，最终得到麦冬水提物干粉。
测麦冬水提物干粉的成分含量，测试方式为：
采用HPLC检测单糖和低聚果糖，色谱条件为：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6mm I.D.×250mm,5μm)色谱柱，柱温40℃，流速1.0mL/min。流动相梯度洗脱条件为：0-25min，85％乙腈，15％水；25-27min，85-78％乙腈，15-22％水；27-36min，78％乙腈，22％水；36-37min，78-72％乙腈，22-28％水；37-48min，72％乙腈，28％水。电雾式检测器：雾化气：N2；雾化气压力：64.2psi；喷雾器温度：35℃；采样频率：10Hz；增益：8。
采用醇沉法测定多糖含量。向麦冬水提液中加入95％乙醇直至乙醇浓度达到75％(v/v)以上，使多糖沉淀。于4℃静置过夜，4,000rpm离心15min，弃去上清液。然后将沉淀用水复溶，使用Amicon Ultra-4 3K超滤离心管，4500rpm离心30min进行超滤，重复3次，以去除样品中分子量小于3000的小分子。将样品冷冻干燥并称重，计算多糖在植物干重中的含量。
本申请实施例提供的预防或治疗帕金森病的药物，包括上述的麦冬提取物。该药物由于包括了上述提到的麦冬提取物，因此该药物具有好的预防或质量帕金森病的作用。
本申请实施例提供的保健品，包括上述的麦冬提取物，该保健品由于包括了上述提到的麦冬提取物，因此该药物具有好的预防或质量帕金森病的作用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
以下实施例用到的麦冬样品分别采集于四川省绵阳市三台县里程乡(CMD)和浙江省慈溪市胜山镇(ZMD)。
实施例1
本申请提供的麦冬提取物为麦冬醇提物。
麦冬醇提物的制备方法为：
麦冬粉碎后置于提取瓶中，按1:10料液比，加无水乙醇溶液，于90℃下加热回流提取2h，重复提取3次，合并滤液，经浓缩后，冷冻干燥得麦冬醇提物浸膏(CMD-E和ZMD-E)。提取率及主要成分含量见表1。
表1
采用HPLC检测上述提取物，色谱条件为：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱，柱温30℃，流速0.4mL/min。流动相梯度洗脱条件为：0-2min，30％乙腈，70％水；2-4min，30-35％乙腈，70-65％水；4-10min，35-40％乙腈，65-60％水；10-22min，40-43％乙腈，60-57％水；22-24min，43-46％乙腈，57-54％水；24-27min，46％乙腈，54％水；27-29min，46-49％乙腈，54-51％水；29-39min，49-52％乙腈，51-48％水；39-43min，51-100％乙腈，49-0％水。电雾式检测器：雾化气：N2；雾化气压力：64.2psi；喷雾器温度：35℃；采样频率：10Hz；增益：8。UPLC图谱如图2所示，其中含有麦冬皂苷C(1)、麦冬皂苷Ra(2)、14α-hydroxy-sprengerinin C(3)、麦冬皂苷D(4)、山麦冬皂苷J(5)、麦冬皂苷D'(6)等皂苷类成分，以及甲基麦冬黄酮A(7)、甲基麦冬黄烷酮A(8)、甲基麦冬黄烷酮B(9)、6-醛基异麦冬黄酮A(10)等高异黄酮类成分。
实施例2
本申请提供的麦冬提取物为麦冬醇提物和水提物的混合物，质量比为1:1。
麦冬醇提物的制备方法参考实施例1。
麦冬水提物的制备方法为：
麦冬粉碎后置于提取瓶中，按1：10料液比，加蒸馏水，于80-100℃下加热回流提取2h，重复提取3次，合并滤液，经浓缩后，冷冻干燥得麦冬水提物干粉(CMD-W和ZMD-W)。提取率及主要成分含量见表2。
表2
采用HPLC检测上述提取物，色谱条件为：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6mmI.D.×250mm,5μm)色谱柱，柱温40℃，流速1.0mL/min。流动相梯度洗脱条件为：0-25min，85％乙腈，15％水；25-27min，85-78％乙腈，15-22％水；27-36min，78％乙腈，22％水；36-37min，78-72％乙腈，22-28％水；37-48min，72％乙腈，28％水。电雾式检测器：雾化气：N2；雾化气压力：64.2psi；喷雾器温度：35℃；采样频率：10Hz；增益：8。HPLC图谱如图1所示，其中含有果糖(11)、葡萄糖(12)等单糖以及蔗糖(13)、蔗果三糖(14)、蔗果四糖(15)、蔗果五糖(16)等低聚糖类成分。
采用醇沉法测定多糖含量。向麦冬水提液中加入95％乙醇直至乙醇浓度达到75％(v/v)以上，使多糖沉淀。于4℃静置过夜，4,000rpm离心15min，弃去上清液。然后将沉淀用水复溶，使用Amicon Ultra-4 3K超滤离心管，4500rpm离心30min进行超滤，重复3次，以去除样品中分子量小于3000的小分子。将样品冷冻干燥并称重，计算多糖在植物干重中的含量。
实验例1
麦冬提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用研究：
1、实验方法
选用人多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，培养于DMEM培养基(含10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，在含5％CO2和95％相对湿度的37℃培养箱中培养，每24-48h更换一次培养基，待细胞生长到80％-90％时进行传代。首先考察麦冬提取物对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用。取对数期生长的SH-SY5Y细胞，以每孔5×103个细胞密度接种于96孔板中，待细胞贴壁良好后给药，设置浓度范围为0-1000μg/mL。细胞与相应浓度的药物共同孵育24h后，每孔加入5mg/mL MTT 20μL，于培养箱中避光继续培养4h，吸弃全部上清液，每孔加入150μL DMSO，采用酶标仪检测570nm处的吸光度，计算细胞存活率。
选择不产生细胞毒性的药物浓度考察麦冬提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护作用。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，以每孔5×103个细胞密度接种于96孔板中，待细胞贴壁良好后给药。实验设立空白对照组(加入干预组等量的无血清的DMEM培养液)，模型组(加入2mM MPP+)和给药组(预先分别加入不同浓度的麦冬提取物4h后再加入2mM MPP+共培养)，培养24h后，每孔加入5mg/mL MTT 20μL，培养箱中继续培养4h，吸弃全部上清液，每孔加入150μL DMSO，采用酶标仪检测570nm处的吸光度，计算细胞存活率(Cellviability)。
2、实验结果
麦冬提取物作用于SH-SY5Y细胞24h后，基本没有表现出显著的细胞毒性。CMD-E、CMD-W、ZMD-W在5-1000μg/mL浓度范围内均无明显的细胞毒副作用。ZMD-E在低浓度(5-400μg/mL)对细胞存活率无明显影响，但在高浓度(>800μg/mL)明显降低细胞的存活率(图3)。因此研究麦冬提取物神经保护作用时，ZMD-E最高给药浓度设为100μg/mL，其它三种提取物的最高给药浓度设为800μg/mL。如附图4所示，麦冬提取物治疗24h后，麦冬水提物(CMD-W和ZMD-W)的神经保护作用呈浓度依赖性显著增加，且具有统计学差异。麦冬醇提物(CMD-E和ZMD-W)的神经保护作用在100μg/mL及以下呈浓度依赖性增加，随后CMD-E的神经保护作用随浓度增加而下降。以上结果表明，麦冬醇提物和水提物都对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用。
实验例2
麦冬提取物对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的药效学作用：
1、实验材料
SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，体重20±2g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(粤)2018-0034。麦冬提取物CMD-E、ZMD-E、CMD-W、ZMD-W按实施例1和实施例2中涉及到的方法制备。
2、实验方法
2.1动物饲养及给药
选取8周龄的C57BL/6J小鼠于SPF屏障环境中饲养。保障充足的食物和饮水，温度控制为23±1℃；相对湿度控制在50-70％；保证12h黑暗/12h光照的节律性光周期。动物适应性饲养1周后开始给予药物干预。动物随机分为正常对照组、MPTP模型组和4个给药组(CME-E组、ZMD-E组、CMD-W组、ZMD-W组)。造模前药物干预一周，每天灌胃给药一次，对照组、模型组灌胃等体积的生理盐水。每隔两天称量一次动物体重，记录动物生长情况。
2.2 MPTP模型的建立
用生理盐水溶解MPTP配制成3mg/mL的MPTP溶液，C57BL/6小鼠药物干预一周后开始造模，其中模型组和给药组按18mg/kg的剂量腹腔注射MPTP，每2h一次，连续腹腔注射4次。对照组腹腔注射等量生理盐水，每2h一次，连续腹腔注射4次。造模后灌胃给予0.3mL的生理盐水补充动物损失的水分，将温度调高至28℃缓解动物造模后体温过低的状况。
2.3动物行为学实验
2.3.1转棒实验
采用转棒测试仪进行转棒实验，评价小鼠的运动和协调能力。将小鼠放置在转速为20rpm的转棒测试仪上，记录小鼠2min内第一次掉落的时间即潜伏期，以及2min内掉落的次数，重复测定3次取平均值，以综合观察小鼠的运动能力(Latency to fall)。
2.3.2爬杆实验
用一根直径1cm，高50cm的金属杆(表面缠绕纱布以防止小鼠打滑)垂直竖立，将小鼠头部向上放置在杆的顶部。观察小鼠从开始运动到完全翻转为头部向下的时间(T-turn)，以及爬下金属杆双前肢接触桌面的总时间(T-total)。实验重复3次，每次间隔1min。
2.4动物取材
造模后第7天，给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)，待小鼠进入深度麻醉，将其固定于手术台上，立即打开胸腔，暴露小鼠心脏，以25G注射器针头插入左心室，将右心耳剪开一个小口，便于血液流出。灌注70mL4℃预冷的0.9％生理盐水，随后继续灌注50mL预冷的4％多聚甲醛溶液。取肝、心、脾、肺、肾以及全脑浸入4％多聚甲醛溶液中使其充分固定，备用。
2.5免疫荧光检测黑质中TH+神经元
小鼠全脑浸泡在4％多聚甲醛溶液中充分固定72h后，转移到蔗糖溶液中进行脱水。具体方法为先转移到10％的蔗糖溶液中，待其沉入底部后，依次转移到20％、30％蔗糖中。将脱水后的小鼠全脑放入脑切片模具中取脑前囟后2.5mm～4.5mm处的脑组织厚片。将取得的脑厚片用冰冻切片固定剂OCT固定，进行冰冻切片。从脑干向嗅球方向切削。切片厚度调整为30μm/片，每隔3片取一片，共取12片。留待免疫荧光检测。
将上述脑组织的冰冻切片放入装有PBS的48孔板中，洗掉包埋剂OCT。加入枸橼酸钠缓冲溶液，在75℃下抗原修复10min。随后移除修复液，加入PBS清洗三遍，加入免疫组化强力通透液通透15min。将通透过后的脑切片用PBS清洗三次，每次5min，加10％山羊血清封闭非特异性的抗原，封闭时间持续30min。随后移除山羊血清，加入一抗(1:2000稀释，稀释液为10％山羊血清)，4℃孵育过夜。回收一抗，PBST清洗三次，每次5min。然后加入二抗(1:500稀释，稀释液为5％山羊血清)，室温避光孵育2h。回收二抗，PBST清洗三次，加入Hoechst33342标记细胞核。PBST清洗三次，每次5min，随后用抗荧光淬灭封片剂封片，光镜下照相观察。每只小鼠重复观察6张切片，选择有清晰细胞轮廓带有明显核仁的神经元进行计数，定量分析TH+神经元细胞数。
2.6病理检查
取4％多聚甲醛固定好的肝、心、脾、肺、肾组织，修整调节适合的切面，放入包埋盒中，使用组织自动脱水机对组织进行脱水。将脱水后的组织进行石蜡包埋和病理学切片，切片厚度4μm，随后进行H&E染色。最后使用中性树脂封片，镜检，观察各组织病理形态。
3、实验结果
3.1动物行为学实验
麦冬提取物对帕金森病模型小鼠的行为学特征具有显著改善作用，如图5和图6所示，与模型组相比，在转棒实验中，延长小鼠第一次掉落的时间即潜伏期，减少掉落次数(Latency to fall)；在爬杆实验中，缩短小鼠转头向下的时间T-turn，以及爬下金属杆双前肢接触桌面的总时间T-total。
3.2免疫荧光检测黑质中TH+神经元的数量
MPTP诱导的帕金森病模型组小鼠比对照组小鼠TH+神经元显著减少，麦冬提取物给药组比模型组小鼠的TH+神经元数量显著增加，说明麦冬提取物对MPTP诱导的多巴胺能神经元损失具有较好的保护作用(图7)。
3.3 H&E染色结果
经麦冬提取物治疗后，肝、心、脾、肺、肾组织的纹理与正常组相近，无病理学损伤和坏死，且并未出现明显的毒副作用(图8)。
以上实验结果表明，麦冬提取物对帕金森病模型小鼠具有较好的治疗作用：可改善帕金森病模型小鼠的行为学特征，同时可增加TH+神经元数量，且对小鼠的心、肝、脾、肺、肾没有明显的毒副作用。由此可见，本申请实施例1提供的麦冬醇提物，实施例2提供的麦冬醇提物和水提物的混合物对帕金森病有明显的治疗效果。
综上，麦冬醇提物以及水提物具有较好的预防或治疗帕金森病的作用，特别是麦冬醇提物，其主要含有的物质为皂苷和高异黄酮而非麦冬多糖，但是研究表明其对预防或治疗帕金森病有明显的效果，这与本领域一般认为的是麦冬多糖对于帕金森病有好的预防和治疗效果不同。麦冬醇提物具有开发成预防或治疗帕金森病的药物和保健食品的潜力，具有广阔的市场应用前景。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.麦冬提取物在制备预防或治疗帕金森病的药物中的应用，所述麦冬提取物包括麦冬醇提物；所述麦冬醇提物包括皂苷和高异黄酮，所述麦冬醇提物为乙醇提取物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述麦冬提取物还包括麦冬水提物，所述麦冬水提物包括单糖、低聚果糖和多糖。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述单糖包括果糖和葡萄糖；所述低聚果糖包括蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，按照占对应植物干重的质量百分比计，所述麦冬水提物含有：果糖4.96-7.40％、葡萄糖2.66-2.73％、蔗糖0.20-0.30％、蔗果三糖0.01-0.15％、蔗果四糖0.12-0.27％、蔗果五糖0.04％以及多糖2.30～4.93％。
5.根据权利要求2～4任一项所述的应用，其特征在于，所述麦冬水提物的制备方法包括：
将粉碎后的麦冬块根与水按照1:8～12的料液比混合，于80～100℃下加热回流提取1.5～2.5h至少一次，每次提取后固体分离得到提取液；
去除得到的提取液中的水分得到麦冬水提物干粉。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，回流提取次数为3次，合并三次的提取液然后去除水分。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，去除水分的方式为先浓缩后干燥。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皂苷包括麦冬皂苷C、麦冬皂苷Ra、14α-hydroxy-sprengerinin C、麦冬皂苷D、山麦冬皂苷J和麦冬皂苷D'；所述高异黄酮包括甲基麦冬黄酮A、甲基麦冬黄烷酮A、甲基麦冬黄烷酮B和6-醛基异麦冬黄酮A。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，按照占对应植物干重的量计，所述麦冬醇提物中各成分含量为麦冬皂苷C12.15～31.09μg/g、麦冬皂苷Ra 26.57～88.28μg/g、14α-hydroxy-sprengerinin C 32.55～34.68μg/g、麦冬皂苷D 22.77～73.19μg/g、山麦冬皂苷J11.85～15.68μg/g、麦冬皂苷D'24.15～28.65μg/g；甲基麦冬黄酮A5.72～33.83μg/g、甲基麦冬黄烷酮A51.90～102.64μg/g、甲基麦冬黄烷酮B 52.61～186.88μg/g以及6-醛基异麦冬黄酮A9.34-60.98μg/g。
10.根据权利要求1、6或7所述的应用，其特征在于，所述麦冬醇提物的制备方法包括：
将粉碎后的麦冬块根与浓度为70％～100％v/v的乙醇溶液按照1:8～12的料液比混合，于70～90℃下加热回流提取1.5～2.5h至少一次，每次提取后固体分离得到提取液；
去除得到的提取液中的水和醇得到麦冬醇提物浸膏。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，去除得到的提取液中的水和醇的方式为将所述提取液先浓缩后干燥。
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