CN1679912B - 六味地黄多糖的提取工艺及其产品和它的应用 - Google Patents

Abstract

本发明是一种六味地黄多糖的提取工艺及其得到的产品和这种产品的应用，这种多糖是将熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓和牡丹皮中的有效成分提取后再用微滤膜过滤，把液用大孔树脂后得到的；提取的工艺简单、合理，成本低廉；得到的产品经验证为六味地黄多糖产品；含有治疗相关疾病需要的多种有效成分；用于治疗糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、抗肿瘤以及用于肾阴亏损等疾病的治疗。

Description

六味地黄多糖的提取工艺及其产品和它的应用

技术领域：本发明是一种六味地黄多糖的提取工艺及其得到的产品和这种产品的应用，属于药品的技术领域。

背景技术：六味地黄为我国中药滋阴补肾的古方名药，是由熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓共六味中药组成，该方出自宋代钱乙所著的《小儿药证直诀》。宋代名医钱乙，根据张仲景《金匮要略》中的肾气(桂附地黄)丸去掉桂枝、附子，留取了地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻六味药而成。原方主治小儿“五迟”之症，现广泛用于肾阴亏虚各种症候。方用熟地黄滋阴补肾，填津益髓为君药。山茱萸滋养肝、肾而涩精，山药补益脾阴而固精，共为臣药。三药相配滋补肝、肾、脾之力较全。但以补肾阴为主，补其不足而治本。配伍泽泻泄肾利湿，并防熟地之滋腻。牡丹皮清泻肝火，并制山茱萸之酸收。茯苓淡渗脾湿，以助山药之健运，以上三药为三泄，泄湿浊平其偏胜以治标，均为佐药。全方配合三补三泄，以补为主。肝、脾、肾三阴并补，以补肾阴为主，相辅相成。滋补而不留邪，降泄而不伤正。组方严谨，是通补开合的经典名方。被誉为补肾方药之祖。经过千年的临床验证，由于其广泛而扎实的疗效，成为发展最稳健、用量最大、越用越火的中成药。经现代药理研究证实，六味地黄制剂具有调节肾功能及内分泌系统、提高肌体免疫力和抗衰老作用，在现代医学临床上主要用于治疗肾功能亏损、虚火上炎、腰酸腿痛、牙齿不固、糖尿病及早衰、须发早白、肤燥面皱、不耐劳乏等症状。

其制剂发展至今，更细分为汤剂、小蜜丸、大蜜丸、口服液、浓缩丸、硬胶囊与软胶囊等多种剂型，在临床上的使用频率非常高。虽然我国六味地黄方已有多种剂型，大多采用常规的提取方法，通过水煮、醇提或一些简单的精制处理，在已有中国专利申请(申请号为03117152.4)中公开的“中药六味地黄制剂的生产工艺”技术，只是对六味地黄中的提取物进行精制，没有对其有效成分进行有效分离，制剂中带有大量的无效物质。由于现有制剂的制备工艺落后，缺乏可靠、客观的质量控制指标，产品粗糙，质量不稳，服用剂量大，口感差，没有国际市场竞争力。

纵观人们对于中药材活性成分与疗效的认识，就是伴随着科学技术的发展而臻于全面的；20世纪中期，人们把多糖当作杂质看待，因而广泛地采用水提醇沉法精制中成药。到20世纪80、90年代后，人们对多糖的认识不断提高，确认了不同种类、不同分子量的多糖有着不同的药理活性。六味地黄每一味药材中都含有多糖，其总含量相当原药材总量的10％以上，是六味地黄众多作用得以发挥的主要物质基础。现有研究资料表明，六味地黄的滋阴补肾功能，体现在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、调节造血功能、降血糖、降血脂、抗氧化及抗衰老等众多的作用，大都是通过多糖类活性物质发挥的。同时，六味地黄中还含有大量中、小分子物质，它们有些能针对性地对人体各脏器、各靶点、各功能发挥治疗和调节作用，补充和加强了六味地黄的滋阴补肾的效果。有研究证实，六味地黄中含有32种无机元素，其中14种微量元素具有生理活性，这些微量元素对动脉粥样硬化、糖尿病等有预防作用，对预防衰老亦有一定作用。但是，通过发明人进行的检索，到目前为止，尚未见到相关六味地黄多糖提取、应用等方面的文献报道。

发明内容：本发明的目的在于提供一种六味地黄多糖的提取工艺及其得到的产品和这种产品的应用；目前多糖的提取方法多为水煮醇沉法，该方法对提取其水煎液中含有的酸性多糖(分子量7300～33000)、寡糖及环烯萜苷等醇不溶物质是很好的方法，但是对于水煎液中含有的中性多糖及大量的中小分子物质来说，这些物质能够溶解于乙醇中，且是发挥免疫调节作用的主要物质基础，由于六味地黄水煎液中所含的中性多糖、中小分子物质等成分易溶于醇，不溶于水，在醇沉过程中会完全丢失这部份活性成分；因此，采用常规的水煮醇沉提取的六味地黄多糖，其临床运用价值远远低于六味地黄方剂原来固有的临床价值；没有应用的价值；本发明为了解决现有提取多糖的不足，保证提取的六味地黄多糖的药理作用与六味地黄方保持一致性，将六味药材进行合煎，然后用超滤装置进行分离，得到所有包含各种有效成分的六味地黄多糖物质，且六味地黄总多糖的含量达到50％以上，保证六味地黄多糖的疗效不受影响.本发明是这样构成的：由熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、茯苓和牡丹皮组成，按照现行国家药典规定的用量，将熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、茯苓和牡丹皮分别粉碎成粗粉，加水浸泡，然后煎煮，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用微滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用超滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用大孔树脂吸咐，收集流出液，备用；取上述六味地黄液出液，用纳滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，膜上液备用；将上述膜上液采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即得产品.具体的说：按照重量百分比计算：将熟地黄32％、制山茱萸16％、山药16％、泽泻12％g、茯苓12％和牡丹皮12％分别粉碎成粗粉，加水浸泡12小时，煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用装有3μm～0.5μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用装有能切割15万～1000分子量超滤膜的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用大孔树脂吸咐，收集流出液，流出液备用；取上述六味地黄流出液，用装有能切割100～300分子量的纳滤膜的纳滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，膜上液备用；将上述膜上液采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即得.准确的说：将熟地黄32公斤、制山茱萸16公斤、山药16公斤、泽泻12公斤、茯苓12公斤和牡丹皮12公斤分别粉碎成粗粉，加水浸泡12小时，煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用装有3μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取通过3μm微滤膜的六味地黄膜下液，用装有0.5μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取通过0.5μm微滤膜的六味地黄膜下液，用装有能切割8万分子量的超滤膜的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；将上述膜下液用D101型、DA201型、D-型、SIP系列、X-5型、AB-8型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD-40型、DM-130型、R-A型、CHA-111型、WLD型(混合型)、H107型、NKA-9型大孔树脂吸咐，收集流出液，流出液备用；取上述六味地黄流出液，用装有能切割150分子量的纳滤膜的纳滤器分别过滤，将经过纳滤器过滤的膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，将上述六味地黄膜上液，采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即可.利用上述方法制备得到的六味地黄多糖，可以应用在临床上：治疗糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、增强体质、延缓衰老、抗疲劳、抗肿瘤以及用于治疗肾阴亏损，头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴.常规方法是指公开的技术、国家标准载明的、药学专业教科书中或该领域的专业技术人员可以查阅、实施的方法.

采用本发明提取的六味地黄多糖，是在继承和发扬祖国中医传统理论的基础上，结合现代科学技术的最新研究成果，采用六味药材合煎，还原了汤剂的原始方法，保证六味地黄多糖的疗效，选用高分子材料，通过物理方法进行精制，以保证六味地黄多糖提取的最大化，经测试，六味地黄多糖的含量在50％以上。六味地黄多糖中含有的多糖成份包括：六味地黄多糖CA4、地黄寡糖、地黄多糖RPS-a、b、地黄低聚糖(RGOS)、山茱萸多糖、水溶性多糖Co4、β-茯苓聚糖、茯苓次聚糖、甘露聚糖、山药多糖RDPS-I、岩藻糖、山茱萸多糖：山茱萸多糖PFCC I、山茱萸多糖SZYP-2、山茱萸多糖PFCAIII等；六味地黄多糖中尚含有32种无机元素，其中14种微量元素具有生理活。

微量元素测定一览表

与现有技术相比，本发明提供的制备工艺能有效的将六味地黄药材里的有效成分提取出来，方法简单、合理，成本低廉；能够为企业所接受；得到的产品经验证为六味地黄多糖产品；含有治疗相关疾病需要的多种有效成分。

为了证实六味地黄多糖的药理作用，发明人进行了有关的药理及毒理实验，结果如下：

六味地黄多糖主要药效学实验研究

I、摘要：

六味地黄多糖是中药新药，通过对六味地黄多糖的一系列的药效学试验研究：结果证明：

1、六味地黄多糖1.04、0.52、0.26g/kg ig 4周与8周对高血糖模型大鼠有明显降低空腹血糖作用，改善糖耐量，并有抑制肥胖大鼠胆固醇与甘油三酯升高的趋势，提示该药对于高血脂、高甘油三酯有预防作用。

2、六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周显著增强巨噬细胞的吞噬功能。

3、六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg  ig 2周对体外抗体形成细胞有促进增长的趋势。

4、六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg  ig 2周对正常小鼠白细胞介素-2的生成有明显的促进作用趋势，与对照组比较无统计学差异。

5、六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 10天，对冷刺激模型小鼠，各剂量组以及阳性组动物大脑皮层中NE、5-HT含量与模型组相比较，有升高趋势，其中，六味地黄多糖中剂量组NE、5-HT含量，阳性组5-HT含量与模型组相比较有显著差异(P＜0.05)，各试验组大脑皮层中DA含量与模型组相比较，无明显差异；六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物脑干中NE、DA、5-HT含量与模型组相比较，有升高趋势，其中六味地黄多糖三个剂量组DA含量与模型组相比较有显著差异(P＜0.05).

6、六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig单次给药六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物游泳时间对照组相比较有升高趋势，其中六味地黄多糖高剂量组与对照组相比较有显著性差异(P＜0.05)，其它各组无统计学差异；多次给药六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物游泳时间与对照组相比较有升高趋势，其中六味地黄多糖中剂量组与对照组相比较有显著性差异，其它各组未见统计学差异。

II、试验目的：观察中药六味地黄多糖对大鼠高血糖模型动物的降糖作用以及对小鼠免疫系统的影响。

一、六味地黄多糖对化学性糖尿病大鼠的降血糖作用

(一)试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克，

六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司。试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

链尿霉素(strepiozotocin，简称SZ)：为美国sigma化学公司产品。用时溶于0.1MPH4.4枸橼缓冲液中。

血糖(GLU)、总胆固醇(TC)和甘油三脂(TRIG)试剂盒。

2、动物及饲料

wistar大鼠，200g-500g，B2-型大鼠饲料笼具，苏州吴县枫桥辐射制品厂产；颗粒鼠饲料。

3、仪器：

离心沉淀机：LXJ-II型，上海第二分析仪器厂产；

Lab-500型全自动生化分析仪，由南京桃园应用生物技术有限公司生产。

(二)试验方法及结果

选体重200g-500g的健康wistar大鼠，雌雄兼用，分为正常(10只)和高血糖模型组。高血糖模型组大鼠禁饲24h后按30mg/kg尾静脉i.v新鲜配制的SZ。两周后取血(取血前禁饲12h)，分离血清，酶法测血糖。后选血糖值在13.95-26.82mmol/l的50只动物进入试验。高血糖模型动物按血糖水平随机分为5组：六味地黄多糖高、中、低剂量组；阳性组和模型组。分别ig给予配制好的药液，分别相当于六味地黄多糖药粉1.04、0.52、0.26g/kg六味地黄胶囊0.23g/kg，自来水、给药容积为1ml/100g，正常组给予自来水，容积为1ml/100g，同时，六味地黄多糖高、中低剂量组；阳性组和模型组这五组动物自给药起加喂高脂高糖半合成高热量饲料(蛋白质15％、蔗糖52％，脂肪25％及适量混合盐、维生素及纤维素等，热量为21.33/g)，给药时间为8周。

分别于给药4周和8周时，禁饲10h后尾静脉取血，取血离心后取血清测定血糖、胆固醇、甘油三脂；取血后按照2g/kg i.p给予各组动物葡萄糖溶液，给予葡萄糖溶液后1h与2h，再次尾静脉取血，离心后取血清测定血糖。

结果：1、对高血糖模型大鼠的血糖及耐糖量的影响

六味地黄多糖药粉1.04、0.52、0.26g/kg及六味地黄胶囊0.23g/kg ig给药4周，可明显降低高血糖模型大鼠的空腹血粮值.与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)，可明显降低给予葡萄糖后1h与2h的血糖值，与模型组比较，六味地黄多糖1.25g/kg组与阳性组有统计学差异(P＜0.05).

六味地黄多糖1.04、0.26g/kg组有降低趋势，无统计学差异。(见表1)

表1给药后四周对空腹血糖含量及糖耐量的影响(X±SD)

^*vs模型组^*P＜0.05 ^**P＜0.01模型组vs正常组P＜0.01

六味地黄多糖1.04、0.52、0.26g/kg及六味地黄胶囊0.23g/kg ig给药8周，可明显降低化学性糖尿病模型大鼠的空腹血糖值，与模型组比较有统计学差异(P＜0.05)；可明显降低给予血糖后1h与2h的血糖值，与模型组比较六味地黄多糖0.52g/kg组与阳性组有统计学差异(P＜0.05)，六味地黄多糖1.04、0.26g/kg组有降低趋势，无统计学差异。(见表2)

表2给药后八周对空腹血糖含量及糖耐量的影响(X±SD)

^*vs模型组^*P＜0.05^**P＜0.01模型组vs正常组P＜0.01

2、对胆固醇与甘油三脂含量的影响

药后四周，六味地黄多糖各剂量组与阳性组胆固醇与甘油三脂相比于模型组明显有降低趋势，但未见统计学差异。(见表3)

表3药后四周对胆固醇与甘油三脂含量的影响(X±SD)

^**模型组vs正常组P＜0.01

药后八周，六味地黄多糖各剂量组与阳性组胆固醇与甘油三脂相比于模型组明显有降低趋势，但未见统计学差异。(见表4)

表4药后八周对胆固醇与甘油三脂含量的影响(X±SD)

^**模型组vs正常组^**P＜0.01

二、六味地黄多糖对小鼠免疫系统的影响

实验一：药物对小鼠巨噬功能的影响

(一)试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克；六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司生产。试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

白色念珠菌悬液：试验时培养，配制成1×10⁷个/ml细菌悬液。

6％高温灭菌淀粉，Hanks液(含5％小牛血清)

0.03％亚甲蓝(4℃存放)、华氏管、吸量管。

2、动物：

动物：昆明种小鼠50只，体重18-22g，雌雄兼用，试验开始前预饲养三天。

(二)试验方法及结果

取健康小鼠50只，体重18-22g，随机分为五组：六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg给药组，0.33g/kg六味地黄胶囊阳性对照组和空白对照组。各组均连续ig给药2周，对照组给予自来水，给药体积0.2ml/10克。于末次药前三天i.p高温灭菌淀粉溶液1ml/只，末次药后依照吞噬细胞的吞噬试验方法进行检测，结果以吞噬率(吞噬百分率＝200个M○内发生吞噬的M○数/200*100％)和吞噬指数(吞噬指数＝发生吞噬的100个M○内所吞入白色念珠菌总数/100)表示。

结果：六味地黄多糖高、中剂量组吞噬百分率与吞噬指数、阳性组吞噬指数明显高于对照组，与对照组相比较有极显著性统计学差异(P＜0.01)，六味地黄多糖低剂量组与对照组相比较无明显差异。结果见表5。

表5六味地黄多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响(X±SD)

对照组^**P＜0.01

实验二：药物对体外抗体开成细胞及脾脏系数的影响

(一)试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克；六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司生产。试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

20％绵羊红细胞悬液。

补体：取新鲜豚鼠血清(用之前经绵羊红细胞吸收，1ml压积羊红细胞加20ml补体，置4℃20min，离心取上清，置冰箱备用)。

琼脂：用hanks液配制，表层基0.7％，底层基1.4％。

胎牛血清：经56℃30min，灭活。

2、动物：

动物：昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼用，试验开始前预饲养三天。

(二)试验方法及结果

取健康小鼠50只，体重18-22g，随机分为五组：六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg给药组，0.33g/kg六味地黄胶囊阳性对照组和空白对照组。各组均连续ig给药2周，对照组给予自来水，给药体积0.2ml/10克。于试验前四天i.p10％SRBC0.2ml/只，四天后，末次药后1h将动物脱臼处死，计算脾脏系数，后依照溶血空斑试验方法进行测试。

结果：六味地黄多糖中、低剂量组OD值有升高趋势，与对照组相比较明显统计学差异，六味地黄多糖高剂量组、阳性组OD与对照组基本一致。各组动物脾脏系数与对照组比较无明显差异结果见表6。

表6六味地黄多糖对体外抗体开成细胞及脾脏系数的影响(X±SD)

vs  对照组^**P＜0.01

试验三：药物对正常小鼠白细胞介素-2的影响

(一)试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克；六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司。试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

ELISA  Mouse IL-2.

2、动物：

动物：昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼用，试验开始前预饲养三天。

3、仪器：

96孔培养板。酶标检测仪，型号MK3，芬兰产。

(二)试验方法及结果

取健康小鼠50只，体重18-22g，随机分为五组：六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg给药组，0.33g/kg六味地黄胶囊阳性对照组和空白对照组。各组均连续ig给药4周，对照组给予自来水，给药体积0.2ml/10克。给药结束后，摘眼球处死取血处死小鼠。血液置4℃静置1小时。4000rpm离心5min，取上层血清，-20℃保存备用。依照晶美生物工程有限公司ELISA Mouse IL-2试剂盒说明书测定药物对正常小鼠白细胞介素-2的影响，结果以OD值表示，取两次OD平均值进行统计。

结果：六味地黄多糖各剂量组以及阳生组OD值有升高趋势，其中六味地黄多糖各剂量组OD值有剂量正向关系，现对照组相比较，无统计学差异，结果见表7。

表7六味地黄多糖对正常小鼠白细胞介素-2的影响(X±SD)

试验四：药物对冷刺激小鼠胸腺系数、脾脏系数以及脑内递质含量的影响

(一)试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克；六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司生产。试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

多巴胺，Fluka公司产品；

去甲肾上腺素、5-羟色胺，sigama公司产品；

L-半胱氨酸，上海华舜生物工程有限公司产品；

乙酸钠，默克尔精细化学品有限公司产品；

柠檬酸、高氯酸、半胱氨酸、辛烷基磺酸钠、EDTA、磷酸氢二钾、尔正丁胺和柠檬酸钾，均为国产分析纯。

2、动物：

动物：昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼用，试验开始前预饲养三天。

3、仪器

600-717-2465高效液相色谱仪，美国waters公司产品，eprendorf低温离心机，德国出产；

(二)试验方法及结果

取健康小鼠50只，体重18-22g，随机分为五组：六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg给药组，0.33g/kg六味地黄胶囊阳性对照组和空白对照组。各组均连续ig给药10d，模型对照组给予自来水，给药体积0.2ml/10g。给药期间，除去空白对照组动物，其余五组动物每天强迫其在温度为10℃左右的冷水中游泳5min，给药1h后，称重后脱臼处死动物，解剖分离胸腺、脾脏，称重，计算胸腺系数；在冰面解剖取出大脑皮层与脑干，称重后迅速存于液氮容器之中，送检测定多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)等神经递质含量。

结果：六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物胸腺系数、脾脏系数与模型组相比较，无

统计学差异(P＞0.05)，结果见表8

表8六味地黄多糖对冷刺激小鼠胸腺系数与脾脏系数的影响(X±SD)

六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物大脑皮层中NE、5-HT含

量与模型级相比较，有升高趋势，其中六味地黄多糖中剂量组NE、5-HT含量，阳性组5-HT含量与模型组相比较有显著差异(P＜0.05)，各试验组大脑皮层中DA含量与模型组相比较，无明显差异，结果见表9。

表9六味地黄多糖对冷刺激小鼠大脑皮层神经递质含量的影响(X±SD)

^*模型 ^*p＜0.05

六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物大脑皮层中NE、5-HT含量与模型级相比较，有升高趋势，其中六味地黄多糖三个剂量组DA含量与模型组想比较有显著差异(p＜0.05)，六味地黄多糖高剂量组动物脑干中5-HT含量与与模型组相比较有显著差异(P＜0.05)，结果见表10。

表10六味地黄多糖对冷刺激小鼠脑脑干中神经递质含量的影响(X±SD)

^*vs  模型组  ^*p＜0.05

试验五：单次给药和多次给药对正常小鼠冷水中游泳时间的影响

试验材料：

1、药品与试剂：

六味地黄多糖：由北京军区总医院提供，每克浸膏相当于生药2.13克；六味地黄胶囊：贵州康纳圣方药业有限公司，试验时将药物用蒸馏水配成所需浓度。

2、动物：

动物：昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄兼用，试验开始前预饲养三天。

试验方法及结果

取健康小鼠100只，18-22g，随机分为10组；单次给药和多次给药(10d)各5组，剂量为六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg六味地黄胶囊阳性对照组和空白对照组。给药体积均为0.2ml/10g/d，空白对照组动物给予自米水，单次给药动物于药后1h后，称重，根据体重不同在小鼠尾部系重量为其体重10％的坠物，将各组动物放入冷水(15度)中测试游泳时间，以小鼠全身没入水面下10sec计时截至时间；

结果：单次给药六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物游泳时间与对照组相比较有升高趋势，其中六味地黄多糖高剂量组与对照组相比较有显著差异(p＜0.05)，其它各组无统计学差异，多次给药六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物游泳时间与对照组比较有升高趋势，其中六味地黄多糖中剂量组与对照组与与对照组相比较有显著性差异，其它各组未见统计学差异。见表11。

表11六味地黄多糖对正常小鼠在冷水中游泳时间的影响(X+SD)

*vs 对照组*P＜0.06

四、结论

六味地黄多糖1.04、0.52、0.26g/kg ig4周与8周对高血糖模型大鼠有明显降低空腹血糖作用，改善糖耐量，并有抑制肥胖大鼠胆固醇与甘油三酯升高的趋势，提示该药对于高血脂、高甘油三脂有预防作用。

六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周显著增强巨噬细胞的吞噬功能。

六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig2周对体外抗体形成细胞有促进增长的趋势。

六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig 2周对正常小鼠白细胞介素-2的生成有明显的促进作用趋势，与对照组相比较无统计学差异。

六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg  ig10天，对冷刺激模型小鼠，各剂量组以及阳性组动物大脑皮层中NE、5-HT含量与模型组相比较有显著差异(p＜0.05)，各试验组大脑皮层中DA含量与模型组相比较，无明显差异；六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物脑干中NE、DA、5-HT含量与模型组相比较，有升高趋势，其中六味地黄多糖三个剂量组DA含量与模型组相比较有显著差异(p＜0.05)

六味地黄多糖1.48、0.74、0.37g/kg ig单次给药六味地黄多糖剂量组以及阳性组动物游泳时间与对照组相比较有升高趋势，其中六味地黄多糖高剂量组与对照组相比较有显著性差异(p＜0.05)，其它各组无统计学差异；多次给药六味地黄多糖各剂量组以及阳性组动物游泳时间与对照组相比较有升高趋势，其中六味地黄多糖中剂量组与对照组相比较有显著性差异，其它各组未风统计学差异。

六味地黄多糖大鼠长期毒性研究

一、摘要

本申请人试验研究了六味地黄多糖26wk ig大鼠的长期毒性。取健康wistar大鼠160只，雌雄各半，按体重随机分为六味地黄多糖对照组(veh)、低剂量组(8.5g/kg/d)、中剂量组(25.5g/kg/d)和高剂量组(76.5g/kg/d)，连续ig大鼠26wk，每周给药6d，每天观察动物的外观和一般行为变化，并于给药13wk、26wk及停药4wk将各组部份动物代谢笼收集尿液，检查尿常规，然后腹主动脉取血，进行血液学指标、血清尘化指标和血液指标的测定，最后将动物剖检并取脏器进行病理组织学检查。结果：

(1)六味地黄多糖8.5g\kg/d，连续ig大鼠26wk及停药4wk，动物外观和一般行为基本正常。体重增长，尿常规、血液学、血清生化检测、脏器系数和病理组织学检查等各项指标均未见异常。

(2)六味地黄多糖2.5g/kg/d连续ig大鼠26wk及停药4wk，动物外观和一般行为基本正常。体重增长，尿常规、血液学、血清生化检测、凝血指标、脏器系数和病理组织学检查等各项指标均未见异常。

(3)高剂量组(76.5g/kg/d)部分动物给药第2-4wk出现药前流涎和给药时挣扎、吐药，药后活动减少，行为邋遢，后渐恢复。动物药后体重增长，饮食基本正常，与对照组情况基本一致。给药13wk后高剂量级动物红细包明显小于对照组，与对照组相比较，有极显著性差异(p＜0.01)，其余各项血常规指标现对照组比较，差异未见统计学意义；给药26wk各组各项血常规指标与对照组相比，未见明显异常。体重增长，尿常规、血液学、血清生化检测、凝血指标、脏器系数和病理组织学检查等各项指标均未见异常。

本试验证明，本品主要肉眼所能观察到的中毒症状为给药2-4wk药后活动减少，给药13wk高剂量对红细胞造成显著影响。安全用药剂量为25.5g/kg/d，其确实中毒剂量为76.5g/kg/d。分别约为临床用药剂量的345、1035倍。

二、实验目的

观察连续26wk重复ig给予六味地黄多糖对大鼠所产生的毒性反应，确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。

三、实验材料

1、受验物：六味地黄多糖浸膏，由北京军区总医院提供，每毫升相当于2.556克药粉。

2、试剂：血液生化测定试剂盒：碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酐(Crea)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(T.BILI)、总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)试剂盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供，总胆固醇(TC)出温州东瓯生物工程有限公司提供。全自动血球计数仪试剂由美国BioChem ImmunoSystem公司提供。尿八联试纸，由高尔宝生物技术有限公司生产，批号：20031008。活化部分凝血活醇时间(APTT-LH011)、凝血酶原时间(PT-N39)和凝血酶时间(TT-25006)试剂盒均出上海生物技术公司，上海太阳医疗器械有限公司提供。

3、仪器：全自动血球计数仪，型号MEK-6318K，日本光电株式会社生产。Lab-500型全自动生化分析仪，由南京桃园应用生物技术有限公司生产。C2000-4型血凝仪。由北京普利生仪器公司生产。B2型大鼠饲料笼具，苏州枫桥辐身制品厂产。

4、动物及饲料：雄性Wistar大鼠，颗粒鼠饲料。

四、方法

1、动物饲养：4-6周龄健康雄性大鼠挑选后，首先预饲养1wk，用于实验时体重为100g左右，每笼5只，供给充足的水和饲料，保持室温20-25℃，湿度55-65％。

2、试验周期、剂量、分组和给药方法：六味地黄多糖人用剂量为4.4g药粉/d，以人体重60kg计，人用剂量为0.074g药粉/d。小鼠一日口服最大给药量为230.1g药粉/kg。按药品注册管理办法的要求，确定用药周期26wk，设六味地黄多糖高剂量组(76.5g药粉/kg/d)、中剂量组(25.5g药粉/kg/d)、低剂量组(8.5g药粉/kg/d)和对照组(给予空白溶剂)。每天两次上午两次上午8:30、下午4:30ig给药，高剂量动物原液给予，其它各组药物用水等比稀释，每次给药溶积为1.5ml/100g，对照组ig等溶量溶剂。

3、检查项目及方法

(1)一般症状及死亡情况：给药期间每天定时观察动物外观体征、行为活动和饮食情况，记录症状变化，发现有严重中毒反应的动物取出单笼饲养，重点观察，发现死亡或濒死动物及时尸检。

(2)体重测定：给药及停药期间每周测定体重，现药前比较求出体重增减值。

(3)尿常规检查：于给药13wk、26wk和恢复期结束后，分别代谢笼收集部分大鼠的尿液进行尿常规检查。

(4)血液学和生化验学检查：于给药13wk取对照组和高剂量组各1/4动物、给药26wk每组各取1/2动物、恢复期结束时取剩余所有动物ip 1％戊巴比妥钠溶液浅麻，腹主动脉取血，部分用于测定血液学指标，部分血液离心取血清后测定十项血清生化指标，部分血液离心取血清，测定血凝指标.血液学指标包括：红细胞计数(RBC)白细胞计数(WBC)及分类，血红蛋白(HB)和血小板(PLT).血清生化指标包括：丙氨酸基转移酶(ALT)碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血糖(GLU)总胆同醇(TC)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、总胆红素(T.BILI)、肌酐(Crea).血凝指标包括凝血酶时间(TT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT).

(5)剖检及病理组织学检查：给药13wk时取高剂量组和对照组各1/4动物、给药26wk后每组各取1/2动物、恢复期结束后取剩余所有动物进行剖检，并行肉眼观察，然后测脑、心、肝、脾、肺、肾、肾腺、胸腺、睾丸、附睾、前列腺、精囊腺和甲状腺湿重，求出脏器系数，并将上述脏器及胃肠等脏器以10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋后切片，H-E染色镜检。

五、结果

1、一般情况：给药期间高剂量组(76.5g/kg/d)部分动物给药第2-4wk出现药前流涎和给药时挣扎、吐药，药后活动减少，行为邋遢，后渐恢复，动物药后体重增长、饮食基本正常，与对照情况基本一致。其它各剂量组动物给药期间一般行动、精神状况均正常，与对照动物想比较无明显差异。恢复期所有各组动物肉眼观察均正常。

2、体重：药前及药后各组大鼠体重变化见表12、13、14、15。

由表12、13、14、15可见，用药期间六味地黄多糖低、中、高剂量组动物体重增长基本

与对照组一致，与对照组相比较，无明显差异。

表13六味地黄多糖口服给药26wk对雄性大鼠体重增长的影响

表14六味地黄多糖口服给药26wk对雄性大鼠体重增长的影响(n＝40)

表15六味地黄多糖口服给药26wk对雄性大鼠体重增长的影响(n＝40)

3、尿常规检查：结果见表16

表16六味地黄多糖po给药13wk对大鼠尿常规的影响

注：X±SD，P＞0.05，vs veh

由此表16可见，六味地黄多糖各剂量组动物在各个测定时期，尿常规检查结果与对照组比较，未见明显异

4.血液学及凝血时间检查：结果见表17。

表17口服给药26wk对大鼠血液学指标及凝血时间的影响

注：X±SD，P＞0.01，vs veh

由表17可见，用药组动物给药13wk高剂量组动物红细胞明显小于对照组，对照组相比较，有极显著性差异(P＞0.01)，其余各项血常规指标现对照组比较，差异未见统计学意义；给药26wk以及停药4wk时，各项血常规指标与对照组比较，差异未见统计学意义。

表18六味地黄多糖口服给药26wk对大鼠血液学指标及凝血时间的影响

由表18可见，给药26wk以及停药4wk时，各项血凝血指标与对照组比较，差异未见统计学意义。

5、血清生化学检查：结果见表19。

表19六味地黄多糖口服给药26wk对大鼠血清生化学指标的影响

X±SD，P＞005，vs veh

由表19可见，给药13wk，给药26wk后血清生化检测，各项检测指标与对照组比较，均未出现明显差异.

6、病理组织学检查

(1)剖检给药13wk、26wk及药后恢复期结束后，剖检各组动物均未有肉眼可见的异常。

(2)脏器重量主要脏器湿重与体重比值为脏器系数，测定结果见表20、表21。

表20六味地黄多糖口服给药26wk对雄性大鼠脏器系数的影响

表21六味地黄多糖口服给药26wk对雌性大鼠脏器系数的影响

注：X±SD，P＞0.05，vs  veh

由表20、表21可见，给药13wk，26wk，与对照组比较，六味地黄多糖各剂量组动物脏器系数未见统计学差异(P＞0.05)，观察期结束各组脏器系数未见异常。

(3)组织切片检查：给药13wk病理检查可见：心：组织形态呈正常分布，未见心肌细胞变性，也无心肌细胞出血、坏死及纤维化等病变；肝：结构完整，肝小叶正常，肝细胞无变性坏死；脾：未见病变；肺：动物肺泡正常，间质内无增生及炎细胞浸润；肾：未见间质内轻、中度灶性炎细胞浸润及血管充血；肾上腺：分为皮质和髓质，皮质细胞无变性、环死、增生，髓质细胞和血管未见异常；甲状腺：甲状腺滤泡大小及分泌功能正常；胰腺：胰腺结构正常，腺泡及导管、胰岛结构及数量无异常；小肠：小肠粘膜结构完整，无炎症及粘膜脱落、坏死；前列腺、睾丸、附睾、精囊腺、淋巴结、子宫、卵巢、膀胱、脑、脊髓、垂体、视神经、胸骨、胃、十二指肠等脏器未见异常。

给药结束病理检验，心：未见心肌细胞明显变性，也无心肌出血、坏死及纤维化等病变；肝：正常动物，结构完整，肝小叶正常，肝细胞无变性坏死，未见炎细胞浸润，汇管区较明显；脾：未见病变；肺：动物肺泡正常，间质内无增生及炎细胞浸润；肾：未见间质内轻、中度灶性炎细胞浸润及血管充血；肾上腺：分为皮质和髓质，皮质细胞无变性、环死、增生，髓质细胞和血管未见异常；甲状腺：甲状腺滤泡大小及分泌功能正常：胰腺：胰腺结构正常，腺泡及导管、胰岛结构及数量无异常；小肠：小肠粘膜结构完整，无炎症及粘膜脱落、坏死；前列腺、睾丸、附睾、精囊腺、淋巴结、子宫、卵巢、膀胱、脑、脊髓、垂体、视神经、胸骨、胃、十二指肠等脏器未见异常.

观察结束，所有动物各脏器均未见明显的病理改变。

六、结论

本试验研究了六味地黄多糖26wk ig大鼠的长期毒性。结果：

(1)六味地黄多糖8.5g/kg/d，连续ig大鼠26wk及停药4wk，动物外观和一般行为基本正常。体重增长，尿常规、血液性、血清生化检测、凝血指标、脏器系数和病理组织学检查等各项指标均未见异常。

(2)高剂量组(76.5g/kg/d)部分动物给药第2-4wk出现药前流涎和给药时挣扎、吐药，药后活动减少，行为邋遢，后渐恢复。动物药后体重增长、饮食基本正常，与对照组情况基本一致。给药13wk后高剂量级动物红细胞明显小于对照组，与对照组相比较，有极显著性差异(P＜0.01)，其余各项血常规指标与对照组比较，差异未见统计学意义；给药26wk各组各项血常规指标与对照组比较，未见明显异常；停药4wk时，各组各项血常规指标与对照组比较，未见明显异常；体重增长，尿常规、血液性、血清生化检测、凝血指标、脏器系数和病理组织学检查等各项指标均未见异常。

本试验证明，本品主要肉眼所能观察到的中毒症状为给药2-4wk药后活动减少，给药13wk高剂量对红细胞造成显著影响。安全用药剂量为25.5g/kg/d，其确实中毒剂量为76.5g/kg/d。分别约为临床用药剂量的345、1035倍。

具体实施方式：

本发明的实施例1：

1.处方：熟地黄32公斤  山茱萸[制]16公斤  山药16公斤

泽泻12公斤  茯苓12公斤  牡丹皮12公斤

2.操作：

①熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入温水浸泡12小时，然后煎煮两次，每次2小时，合并煎液，离心过滤，收集离心液，备用。

②离心后的六味地黄水煎液，用装有3μm微滤膜的过滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜上液，膜下液用能切割15万分子量的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，收集通过滤膜的膜下液，用D101型大孔树脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的纳滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜下液，收集膜上液，干燥(喷雾、冷冻、真空或常温干燥)，粉碎，即得到六味地黄多糖产品。

本发明的实施例2：

1.处方：熟地黄32公斤  山茱萸[制]16公斤  山药16公斤

泽泻12公斤  茯苓12公斤  牡丹皮12公斤

2.操作：

①熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入温水浸泡12小时，然后煎煮两次，每次2小时，合并煎液，离心过滤，收集离心液，备用.

②离心后的六味地黄水煎液，用装有0.5μm微滤膜的过滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜上液，膜下液用能切割8万分子量的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，收集通过滤膜的膜下液，用WLD型大孔树脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的纳滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜下液，收集膜上液，干燥(喷雾、冷冻、真空或常温干燥)，粉碎，即得到六味地黄多糖粉。

本发明的实施例3：

1.处方：熟地黄32克  山茱萸[制]16克  山药16克

泽泻12克  茯苓12克  牡丹皮12克

2.操作：

①熟地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮，粉碎成10-80目的粗粉，加入温水浸泡12小时，然后煎煮两次，每次2小时，合并煎液，离心过滤，收集离心液，备用。

②离心后的六味地黄水煎液，用装有0.5μm微滤膜的过滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜上液，膜下液用能切割1000分子量的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，收集通过滤膜的膜下液，用AB-8型大孔树脂吸咐，收集流出液，用能切割150分子量的纳滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，弃去膜下液，收集膜上液，干燥(喷雾、冷冻、真空或常温干燥)，粉碎，即可得到六味地黄多糖粉。

本发明的实施例4：将得到的得到六味地黄多糖粉

采用常规的制备方法，压成片；用于治疗、预防疾病；口服：每天2次、每次2片。

本发明的实施例5：将得到的得到六味地黄多糖粉采用常规的方法制备成胶囊制剂；用于治疗、预防疾病；口服：每天次、每次2粒。

本发明的实施例6：将得到的得到六味地黄多糖粉采用常规的制备方法，制备成颗粒；用于治疗、预防疾病；口服：每天2次、每次1包。

本发明的实施例7：将得到的得到六味地黄多糖粉采用常规的制备方法，制备成注射制剂；用于治疗、预防疾病：静脉注射用。

Claims (6)

1.六味地黄多糖的提取工艺，其特征在于：由熟地黄32％、制山茱萸16％、山药16％、泽泻12％、茯苓12％和牡丹皮12％组成，将熟地黄、制山茱萸、山药、泽泻、茯苓和牡丹皮分别粉碎成粗粉，加水浸泡，然后煎煮，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用微滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用超滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用大孔树脂吸咐，收集流出液，流出液备用：取上述六味地黄流出液，用纳滤膜过滤，将膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，膜上液备用；将上述膜上液采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即得。

2.按照权利要求1所述的六味地黄多糖的提取工艺，其特征在于：按照重量百分比计算：将熟地黄32％、制山茱萸16％、山药16％、泽泻12％、茯苓12％和牡丹皮12％分别粉碎成粗粉，加水浸泡12小时，煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用装有3μm～0.5μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用装有能切割15万～1000分子量超滤膜的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取上述六味地黄膜下液，用大孔树脂吸咐，收集流出液，流出液备用；取上述六味地黄流出液，用装有能切割100～300分子量的纳滤膜的纳滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，膜上液备用；将上述膜上液采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即得。

3.按照权利要求1或2所述的六味地黄多糖的提取工艺，其特征在于：将熟地黄32公斤、制山茱萸16公斤、山药16公斤、泽泻12公斤、茯苓12公斤利牡丹皮12公斤分别粉碎成粗粉，加水浸泡12小时，煎煮2次，每次2小时，合并煎煮液，离心过滤，得六味地黄提取液，备用；取上述六味地黄提取液，用装有3μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取通过3μm微滤膜的六味地黄膜下液，用装有0.5μm微滤膜的过滤器过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；取通过0.5μm微滤膜的六味地黄膜下液，用装有能切割8万分子量的超滤膜的超滤装置过滤，将膜上液与膜下液分离，膜上液弃去，膜下液备用；用D101型、AB-8型或WLD混合型大孔树脂吸咐，收集流出液，流出液备用；取上述六味地黄流出液，用装有能切割150分子量的纳滤膜的纳滤器分别过滤，将经过纳滤器过滤的膜上液与膜下液分离，膜下液弃去，将通过8万分子量的超滤膜与150分子量的纳滤膜之间的提取液，采用喷雾、冷冻、真空或常温干燥的方法干燥，粉碎，即可。

4.按照权利要求3所述的六味地黄多糖的提取工艺，其特征在于：用DA201型、D-型、SIP系列、X-5型、GDX104型、LD605型、LD601型、CAD-40型、DM-130型、R-A型、CHA-111型、WLD混合型、H107型或NKA-9型大孔树脂代替D101型、AB-8型或WLD混合型大孔树脂。

5.如权利要求1-4所述工艺制备得到的六味地黄多糖。

6.如权利要求5所述的六味地黄多糖在制备治疗糖尿病、改善糖耐量、降血脂、提高免疫力、增强体质、延缓衰老、抗疲劳、抗肿瘤以及治疗肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、消渴的药物中的应用。