CN114767710A - 甘氨酸亚铁在治疗类风湿关节炎中的应用 - Google Patents

甘氨酸亚铁在治疗类风湿关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了甘氨酸亚铁在治疗类风湿关节炎中的应用。经实验证明，LPS和IFN‑γ共同刺激Raw264.7细胞后可显著抑制细胞活力，甘氨酸亚铁则可以显著恢复Raw264.7细胞的活力，对Raw264.7细胞具有保护作用，此外，甘氨酸亚铁可以降低炎症因子的表达，抑制iNOS蛋白的表达，抑制类风湿关节炎中过度的氧化应激反应，上调抗氧化相关蛋白NQO‑1蛋白的表达。除此之外，甘氨酸亚铁还可以显著抑制RA‑FLS的迁移，可以改善小鼠脚掌及踝关节肿胀和破坏的情况，可以降低小鼠血清中炎症因子的IL‑6和IL‑1β的水平，在CIA模型小鼠体内具有显著的治疗效果，具有良好的实际推广应用的价值。

Description

甘氨酸亚铁在治疗类风湿关节炎中的应用
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体涉及了甘氨酸亚铁在治疗类风湿关节炎中的应用。
背景技术
类风湿关节炎是一种自身免疫性慢性疾病，以侵袭性关节炎症和软骨不可逆损伤为主要症状，可引起整个身体的对称性关节疼痛和结缔组织广泛性炎症损坏。类风湿关节炎在全球的患病率为千分之五，目前，其具体的病因还不明确，遗传因素和环境因素等都可能导致疾病的发生。类风湿关节炎的病理特征为T细胞、B细胞和巨噬细胞等大量炎性细胞浸润多个关节滑膜，同时，多种类风湿炎症因子的分泌会导致关节疼痛肿胀、畸形至丧失功能。此外，有研究表明氧化应激产生的自由基也参与了类风湿关节炎的发病过程。类风湿关节炎造成的疾病损害是不可逆转的，随时间延长，反复发作，给患者生理和心理都带来了压力。
目前，治疗类风湿关节炎的方法通常是药物治疗法，以减少炎症和疼痛，抑制关节损伤，常用的药物包括标准的抗风湿类药物、非甾体类抗炎药、类固醇类药物等。但是上述药物起效慢、价格昂贵且具有多种不良反应。因此，寻找治疗效果更好、经济易得且副作用小的药物对类风湿关节炎的预防和治疗具有重要的意义。
甘氨酸亚铁，是一种氨基酸铁螯合物，小分子甘氨酸基团保护亚铁离子，可以维持分子的完整性，通常被作为一种理想的铁营养补充剂，用于治疗缺铁性贫血，但至今未有报道将甘氨酸亚铁用于类风湿关节炎的治疗和预防中。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了甘氨酸亚铁在类风湿关节炎中的应用。经实验证明，脂多糖(LPS)和γ干扰素(IFN-γ)共同刺激小鼠单核巨噬细胞(Raw264.7)后可显著抑制细胞的活力，甘氨酸亚铁则可以显著恢复Raw264.7细胞的活力，对Raw264.7细胞具有保护作用；此外，甘氨酸亚铁还可以降低炎症因子的表达，抑制iNOS蛋白(诱导型一氧化氮合酶)的表达，抑制类风湿关节炎中过度的氧化应激反应，上调抗氧化相关蛋白NQO-1(NAD(P)H:醌氧化还原酶1)的表达。且甘氨酸亚铁还可以显著抑制成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)的迁移，从而避免了在病理过程中活化的RA-FLS侵袭软骨，对关节造成破坏；此外，甘氨酸亚铁在胶原诱导关节炎模型小鼠体内具有显著的治疗效果。
本发明的第一方面，提供了甘氨酸亚铁在制备抗炎性药物中的应用。
根据本发明第一方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述抗炎性药物为抗类风湿关节炎药物。
在本发明的一些优选实施方式中，所述类风湿关节炎是一种常见的以关节组织慢性炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抗炎性药物具有如下(1)～(3)中至少一项功能：
(1)抑制炎症反应；
(2)抑制类风湿关节炎相关细胞的迁移；
(3)改善关节肿胀或破坏的情况。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述抑制炎症反应包括抑制炎症因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述类风湿关节炎相关的细胞为RA-FLS。
在本发明的一些优选实施方式中，所述甘氨酸亚铁在抗炎性药物中的有效浓度为5～500μM。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述甘氨酸亚铁在抗炎性药物中的有效浓度为10～300μM。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述甘氨酸亚铁在抗炎性药物中的有效浓度为50～260μM。
本发明第二方面的内容，提供了一种药物组合物，所述药物组合物由甘氨酸亚铁和一种或多种药学上或食品上可接受的辅料组成。
根据本发明第二方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物中甘氨酸亚铁的有效浓度为5～500μM。
在本发明的一些优选实施方式中，所述药物组合物中甘氨酸亚铁的有效浓度为10～300μM。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述药物组合物中甘氨酸亚铁的有效浓度为50～260μM。
在本发明的一些优选实施方式中，所述辅料是本领域中的常规选择，可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖中的一种或其组合。
本发明的第三方面，提供了一种药物制剂，所述药物制剂由本发明第二方面所述的药物组合物制备。
根据本发明第三方面的内容，在本发明的一些实施方式中，所述药物制剂的剂型为汤剂、口服液剂、颗粒剂、滴丸、片剂、胶囊或配方颗粒。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提出了甘氨酸亚铁在类风湿关节炎中的应用，经实验证明，LPS和IFN-γ共同刺激Raw264.7细胞后可显著抑制细胞活力，甘氨酸亚铁则可以显著恢复细胞的活力，对Raw264.7细胞具有保护作用；此外，甘氨酸亚铁可以降低炎症因子的表达，包括Raw264.7细胞炎症因子IL-6、IL-1β以及由人单核细胞(THP-1)诱导分化的M1型巨噬细胞中的炎症因子IL-6的表达；而且，甘氨酸亚铁还可以抑制iNOS蛋白的表达，抑制类风湿关节炎中过度的氧化应激反应，上调抗氧化相关蛋白NQO-1的表达；
(2)甘氨酸亚铁可以显著抑制RA-FLS的迁移，从而避免了在病理过程中活化的RA-FLS侵袭软骨，对关节造成破坏；
(3)甘氨酸亚铁在胶原诱导关节炎模型小鼠体内具有显著的治疗效果，可以改善小鼠脚掌及踝关节肿胀和破坏的情况，可以降低小鼠血清中炎症因子IL-6和IL-1β的水平，具有良好的实际推广应用价值。
附图说明
图1为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中RAW264.7细胞存活率统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未添加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横线上方的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图2为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的IL-6mRNA的相对表达量统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未添加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横坐标处的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图3为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的IL-1βmRNA的相对表达量统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横坐标处的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图4为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的iNOS、NQO-1和β-肌动蛋白的电泳条带图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及电泳条带图上方的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度)；
图5为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的iNOS蛋白的相对表达量统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横坐标处的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图6为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的NQO-1蛋白的相对表达量统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横坐标处的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，#表示与刺激对照组进行比较)；
图7为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的活性氧阳性细胞率统计图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及横坐标处的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图8为24h后空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的愈合面积率统计图(其中，C表示空白对照组，5μM、25μM、50μM、75μM分别代表不同浓度甘氨酸亚铁加药组中甘氨酸亚铁的有效浓度，*表示与空白对照组进行比较)；
图9为36h后空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的愈合面积率统计图(其中，C表示空白对照组，5μM、25μM、50μM、75μM分别代表不同浓度甘氨酸亚铁加药组中甘氨酸亚铁的有效浓度，*表示与空白对照组进行比较)；
图10为空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中进行划痕实验24h和36h后的RA-FLS的迁移情况(其中，C表示空白对照组，5μM、25μM、50μM、75μM分别代表不同浓度甘氨酸亚铁加药组中甘氨酸亚铁的有效浓度，图中的标尺为1000μm)；
图11为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-6和β-肌动蛋白的电泳条带图(其中，-代表的是未进行刺激，且未加甘氨酸亚铁，+代表的是使用含PMA、LPS和IFN-γ的培养基进行刺激，FeG及电泳条带图上方的数字分别代表甘氨酸亚铁及其有效浓度)；
图12为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-6蛋白的相对表达量统计图(其中，C表示空白对照组，M表示刺激对照组，5μM、10μM、25μM、50μM分别代表不同浓度甘氨酸亚铁加药组中甘氨酸亚铁的有效浓度，*表示与空白对照组进行比较，#表示与刺激对照组进行比较)；
图13为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠关节炎评分(其中，CIA+FeG(130)为低剂量给药组，CIA+FeG(260)为高剂量给药组)；
图14为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠踝关节直径及后脚脚掌厚度测量情况(其中，CIA+FeG(130)为低剂量给药组，CIA+FeG(260)为高剂量给药组)；
图15为第0天和第47天正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的踝关节直径厚度统计图(其中，FeG(130)为低剂量给药组，FeG(260)为高剂量给药组)；
图16为第0天和第47天正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的后脚脚掌厚度统计图(其中，FeG(130)为低剂量给药组，FeG(260)为高剂量给药组)；
图17为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的左后肢踝关节Micro-CT扫描图(其中，第二列图为第一列图的圈出部分的放大图)；
图18为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠血清中血清炎症因子IL-1β的浓度统计图(其中，FeG(130)为低剂量给药组，FeG(260)为高剂量给药组)；
图19为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的血清中血清炎症因子IL-6的浓度统计图(其中，FeG(130)为低剂量给药组，FeG(260)为高剂量给药组)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
本发明实施例中的所有实验数据均是进行三次平行实验后的平均值。
实施例1体外甘氨酸亚铁对LPS与IFN-γ共同刺激诱导Raw264.7细胞炎症损伤模型的保护作用
一、Raw264.7细胞培养
将Raw264.7细胞复苏后，置于直径为10mm的培养皿中培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基(DMEM是一种含有各种氨基酸和葡萄糖的培养基，其购自美国赛默飞世尔科技)，培养皿置于37℃和5％CO2的恒温培养箱中培养，每两天更换一次培养基，待培养皿中的细胞密度达到80％左右即可传代，按照本领域的常规培养技术，培养3～5代后进行后续实验。
二、实验分析
MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)法检测细胞增殖情况
(1)收集上述培养好的RAW264.7细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种的密度约为5×103个细胞/孔，24h小时后进行实验。实验分为9组，分别为：空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组(7组)，每组4个复孔。
(2)刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组均加入200μL的含LPS和IFN-γ的培养基对接种后的RAW264.7细胞进行共同刺激，刺激的时间为6h，6h后得到LPS与IFN-γ共同刺激诱导的Raw264.7细胞炎症损伤模型，LPS和IFN-γ在培养基中的工作浓度分别为500ng/mL和20ng/mL。
(3)步骤(2)中的刺激模型建立后，去除各组中的培养基，空白对照组和刺激对照组分别加入200μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，不同浓度甘氨酸亚铁加药组加入包含不同有效浓度的甘氨酸亚铁的含10％胎牛血清的DMEM培养基，其中，甘氨酸亚铁的有效浓度依次为10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、200μM、500μM。继续培养24h，培养结束后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，吸去培养基，每孔加入200μL的二甲基亚砜(DMSO)，在微量振荡器中振荡5min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在490nm处测定每孔的吸光值(即OD值)，记录结果，并计算细胞的存活率，从而表征甘氨酸亚铁对于RAW264.7细胞存活率的影响。以分组为横坐标，细胞存活率为纵坐标绘制图形。
其中，不同浓度甘氨酸亚铁加药组细胞存活率的计算公式为：
Figure BDA0003591123430000061
刺激对照组细胞存活率的计算公式为：
Figure BDA0003591123430000062
其中空白OD为与试验孔一样的操作程序但不含细胞的孔中的OD值。
qPCR实验
(1)收集上述培养好的RAW264.7细胞的细胞悬浮液，接种于十二孔板中，接种的密度约为1×105个细胞/孔，24h小时后进行实验。实验分为八组，分别为：空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组(6组)，每组2个复孔。
(2)刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组均加入1mL含LPS和IFN-γ的培养基对接种后的RAW264.7细胞进行共同刺激，刺激的时间为6h，6h后得到LPS与IFN-γ共同刺激诱导Raw264.7细胞炎症损伤模型，LPS和IFN-γ在培养基中的工作浓度分别为500ng/mL和20ng/mL。
(3)在步骤(2)中的刺激模型建立后，去除各组中的培养基，空白对照组和刺激对照组分别加入1mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，不同浓度甘氨酸亚铁加药组加入1mL包含不同有效浓度的甘氨酸亚铁的含10％胎牛血清的DMEM培养基，其中，甘氨酸亚铁的有效浓度依次为10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM，继续培养24h后收样。以下实验步骤均在冰上进行。用预冷的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤各组细胞两遍后，每孔加入0.5mL的Trizol(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)后收集转至1.5mL的EP管，室温静置5min，加入100μL氯仿，剧烈震荡混匀，室温静置3min。于4℃和12000rpm下离心15min，吸取细胞上清于1.5mL的EP管中，加入250μL的异丙醇，混匀，室温静置10min，于4℃和12000rpm下离心10min，弃去上清，所得的沉淀用预冷的80％的乙醇洗涤，于4℃和7500rpm下离心5min，室温通风干燥10min，依提取的RNA的量加入10～20μL的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA。用超微量紫外分光光度计检测上述空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的RNA浓度。按照Evo M-MLV反转录预混型试剂盒(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司)说明进行逆转录反应，得cDNA，依据Pro Taq HS Premix Probe qPCR Kit(购自湖南艾科瑞生物工程有限公司))说明完成RT-qPCR反应，检测各组中IL-6、IL-1β和Hnr(内参)基因的表达水平，得到各组Ct值，用2-△△Ct法处理数据。
蛋白质印迹(Western blot)实验
(1)收集上述培养好的RAW264.7细胞的细胞悬浮液，接种于六孔板中，接种的密度约为2×105个细胞/孔，24h小时后进行实验。实验分为八组，分别为：空白对照组、刺激对照组、不同浓度甘氨酸亚铁加药组(6组)，每组2个复孔。
(2)刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组均加入2mL含LPS和IFN-γ的培养基对接种后的RAW264.7细胞进行共同刺激，刺激的时间为6h，6h后得到LPS与IFN-γ共同刺激诱导的Raw264.7细胞炎症损伤模型，LPS和IFN-γ在培养基中的工作浓度分别为500ng/mL和20ng/mL。
(3)步骤(2)中的刺激模型建立后，去除各组中的培养基，空白对照组和刺激对照组分别加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，不同浓度甘氨酸亚铁加药组加入2mL包含不同浓度的甘氨酸亚铁的含10％胎牛血清的DMEM培养基，其中，甘氨酸亚铁的有效浓度依次为10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM，继续培养36h后收样。每孔细胞用细胞刮轻柔刮下收集至1.5mL的EP管中，于4℃和5600rpm下离心5min，弃去上清，每个样品中加入40μL的RIPA强裂解液(购自碧云天生物)，混匀冰上裂解30min。于4℃和12000rmp下离心15min，取上清，用BCA试剂盒(购自碧云天生物)测定各组提取的总蛋白浓度，依据浓度定量上样，用10％的SDS－PAGE进行电泳分离，经过转膜，封闭，孵育一抗，抗体为iNOS、NQO-1、β-肌动蛋白(参比)，洗膜，再封闭，孵育二抗，洗膜，显影等实验步骤得图片，用imageJ软件分析图片。
细胞活性氧(ROS)检测实验
(1)收集上述培养好的RAW264.7细胞的细胞悬浮液，接种于二十四孔板中，接种的密度约为2.5×104个细胞/孔，24h小时后进行实验。实验分为八组，分别为：空白对照组、刺激对照组、不同浓度甘氨酸亚铁加药组(6组)，每组2个复孔。
(2)刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组均加入500μL含LPS和IFN-γ的培养基对接种后的RAW264.7细胞进行共同刺激，刺激的时间为6h，6h后得到LPS与IFN-γ共同刺激诱导的Raw264.7细胞炎症损伤模型，LPS和IFN-γ在培养基中的工作浓度分别为500ng/mL和20ng/mL。
(3)步骤(2)中的刺激模型建立后，去除各组中的培养基后，空白对照组和刺激对照组分别加入500μL含10％胎牛血清的DMEM培养基，不同浓度甘氨酸亚铁加药组加入500μL包含不同浓度的甘氨酸亚铁的含10％胎牛血清的DMEM培养基，其中，甘氨酸亚铁有效浓度依次为10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM。继续培养24h，去除细胞培养基，按照1:1000的体积比，用无血清的DMEM培养基稀释乙酸酯(DCFH-DA)，使得DCFH-DA的终浓度为10μM。分别在空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中加入500μL稀释好的DCFH-DA。于37℃细胞培养箱内孵育30分钟。用PBS洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。再用500μL的PBS吹打收集各孔细胞至1.5mL的EP管中，用流式细胞仪检测荧光，用flowjo软件分析数据。
三、实验结果
(1)图1为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中RAW264.7细胞存活率统计图，从图1中可以看出，在LPS与IFN-γ共同刺激Raw264.7细胞后构建的炎症模型中，Raw264.7细胞的存活率明显下降，相比于空白对照组，LPS和IFN-γ共同刺激后，Raw264.7细胞的存活率下降了40％，而甘氨酸亚铁的加入对Raw264.7细胞呈现保护作用，可以将Raw264.7细胞的生存率提高至空白对照组的80％。
(2)图2为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-6mRNA的相对表达量统计图，图3为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-1βmRNA的相对表达量统计图。从图2和图3中可以看出，在LPS与IFN-γ构建的炎症模型中，甘氨酸亚铁可显著降低Raw264.7细胞炎症因子IL-6和IL-1β的mRNA的表达水平，IL-6的mRNA相对表达量最多可以降低为刺激对照组的13％左右，IL-1β的mRNA相对表达量最多可以降低为刺激对照组的7％左右。
(3)图4为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的iNOS、NQO-1和β-肌动蛋白的电泳条带图。从图4中可以看出，相比于空白对照组，刺激对照组中细胞的iNOS蛋白表达量显著提高，而甘氨酸亚铁的加入则可以显著降低iNOS蛋白的含量，使其恢复低水平的表达，从而抑制疾病中过度的氧化应激反应。此外，甘氨酸亚铁的加入还可以显著提高抗氧化相关蛋白NQO-1蛋白的表达。图5为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的iNOS蛋白相对表达量统计图，从图5中可以看出，相比于刺激对照组，甘氨酸亚铁可以将iNOS蛋白的表达量降低为刺激对照组的30％左右，图6为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的NQO-1蛋白的相对表达量统计图，从图6中可以看出，相比于刺激对照组，甘氨酸亚铁可以将NQO-1蛋白的含量提高为刺激对照组的3倍左右。在各组中检测的β-肌动蛋白作为参比蛋白。
(4)图7为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的活性氧阳性细胞率统计图，从图7中可以看出，相比于刺激对照组，甘氨酸亚铁的加入最高可将活性氧阳性细胞率降低为刺激对照组的25％左右。也就是说，甘氨酸亚铁可以有效抑制细胞内活性氧的产生，从而抑制氧化应激反应。
实施例2体外甘氨酸亚铁对类风湿关节炎RA-FLS迁移的作用
一、RA-FLS培养：
将RA-FLS复苏后，加入到含10％澳洲胎牛血清的DMEM培养基(购自美国赛默飞世尔科技公司)的25T培养瓶中，放置于37℃和5％CO2的恒温培养箱中培养，每2天更换一次培养基，待细胞密度达到95％左右即可传代，传代3～10次内进行实验。
二、划痕实验：
细胞达到适当密度后(汇合度约80％)，用胰蛋白酶消化2min，用完全培养基(含10％澳洲胎牛血清的DMEM培养基)终止消化，于800rpm的转速下离心5min，去上清后，用完全培养基(含10％澳洲胎牛血清的DMEM培养基)悬浮细胞，并接种于十二孔板中，接种的密度为5×104个细胞/孔，在37℃下培养24h，待细胞完全贴壁后，换1mL无血清的DMEM培养基饥饿6h后进行实验，实验分为空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组，每组三个平行孔。用200μL的灭菌枪头沿孔中间从上而下划痕，用无菌PBS洗去脱落的细胞。空白对照组中加入1mL含10％澳洲胎牛血清的DMEM培养基(购自美国赛默飞世尔科技公司)，不同浓度甘氨酸亚铁加药组分别加入1mL含有不同有效浓度甘氨酸亚铁的含10％澳洲胎牛血清的DMEM培养基，其中，甘氨酸亚铁的有效浓度依次为5μM、25μM、50μM、75μM。分别在24h和36h后在倒置显微镜下记录划痕区RA-FLS细胞的迁移情况，用image软件处理分析图形，量化比较。
三、实验结果
图8为24h后空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的愈合面积率统计图；图9为36h后空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中的愈合面积率统计图。从图8和图9中可以看出，在加入甘氨酸亚铁后可以显著降低划痕实验后的愈合面积率，也就是说甘氨酸亚铁可以有效地抑制RA-FLS细胞的迁移。图10为空白对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中进行划痕实验24h和36h后的成纤维样滑膜细胞的迁移情况，从图10中同样可以看出甘氨酸亚铁可以有效地抑制RA-FLS细胞的迁移。
实施例3体外甘氨酸亚铁对THP-1诱导分化的M1型巨噬细胞炎症因子分泌的作用
一、THP-1培养
将THP-1细胞复苏后，置于含10％胎牛血清的1640培养基(购自美国赛默飞世尔科技公司)的25T培养瓶中，于37℃和5％CO2的恒温培养箱中培养，每2天更换一次培养基，培养至8×105个细胞/mL后即可传代。
二、Western blot实验
(1)收集上述培养好的THP-1细胞的细胞悬浮液，接种于六孔板中，接种的密度为1×106个细胞/孔，37℃和5％CO2条件下培养24h后进行实验。实验分为六组，分别为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组(4组)，每组2个复孔。
(2)刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组用50ng/mL的佛波酯(PMA)诱导6h后再加含LPS(100ng/mL)和IFN-γ(20ng/mL)的培养基共同刺激18h。
(3)步骤(2)中的炎症模型建立后，分别更换空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组的培养基，其中，空白对照组、刺激对照组的培养基更换为2mL的10％胎牛血清的1640培养基，不同浓度甘氨酸亚铁加药组中更换的培养基为2mL含有甘氨酸亚铁的10％胎牛血清的1640培养基，其中甘氨酸亚铁的有效浓度5μM、10μM、25μM、50μM，培养24h后收样。每孔细胞吸取收集至1.5mL的EP管中，于4℃和5600rpm下离心5min，弃去上清，每个样品加入40μL的RIPA强裂解液，混匀冰上裂解30min。于4℃和12000rpm下离心15min，取上清，用BCA试剂盒(购自碧云天生物)测定各组提取的总蛋白浓度，依据浓度定量上样，用10％的SDS－PAGE进行电泳分离，经过转膜，封闭，孵育一抗，抗体为iNOS、NQO-1、β-肌动蛋白(参比)，洗膜，再封闭，孵育二抗，洗膜，显影等实验步骤得图片，用imageJ软件分析图片。
三、实验结果
图11为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-6和β-肌动蛋白的电泳条带图；图12为空白对照组、刺激对照组和不同浓度甘氨酸亚铁加药组中IL-6蛋白的相对表达量统计图。从图11和图12中可以看出，甘氨酸亚铁的加入对THP-1诱导分化的M1型巨噬细胞炎症因子分泌具有显著的抑制作用，在甘氨酸亚铁的有效浓度为50μM时，IL-6的蛋白相对表达量为刺激对照组的50％左右。
实施例4体内甘氨酸亚铁对CIA小鼠模型的体内药效学试验
一、建立CIA小鼠模型
1、动物：DBA/1小鼠，6～8周龄，每个分组5只小鼠。
2、方法：第一次胶原免疫于DBA/1小鼠尾基底部皮内注射含有100μg牛二型胶原(CII)的完全弗式佐剂(CFA)乳浊液100μL，记为第0天，在第22天给予第二次胶原加强免疫，注射含有100μgCII的不完全弗式佐剂(IFA)乳浊液100μL，完成CIA造模，第26天开始分组给予干预，观察小鼠临床表现。
3、分组：正常组，腹腔注射给予200μL的PBS溶液；模型组，腹腔注射给予200μL的PBS溶液；高剂量给药组：腹腔注射给予200μL的含甘氨酸亚铁的PBS溶液，剂量为260mg/kg/只；低剂量给药组：腹腔注射给予200μL的含甘氨酸亚铁的PBS溶液，剂量为130mg/kg/只。每隔一天给药，第47天处死小鼠。
二、实验结果
1、评分结果：每两天评分一次，对每只小鼠的四肢进行测定评分，并计算总分；评分标准：0分，无红斑和水肿；1分，红斑和轻度水肿，局限于足中段(跗骨)或踝关节；2分，红斑和轻度水肿，从踝关节延伸到足中段；3分，红斑和轻度水肿，从踝关节延伸到跖关节；4分，红斑和严重水肿，包围了踝关节、足及足趾。
图13为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠临床评分，从图13中可以看出，给药组小鼠的关节炎临床评分显著性低于模型组，从而证明甘氨酸亚铁对CIA模型的小鼠有一定的治疗作用。
2、脚掌及踝关节肿胀程度
测量了正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组小鼠踝关节直径及后脚脚掌厚度，图14为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的踝关节直径及后脚脚掌厚度测量情况，图15为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的踝关节直径厚度统计图，图16为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的后脚脚掌厚度统计图。从图14～16中可以看出，第47天，给药组小鼠的脚掌及踝关节肿胀程度显著轻于模型组。
3、踝关节骨破坏情况
Micro-CT扫描正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组小鼠左后肢踝关节，图17为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠的左后肢踝关节Micro-CT扫描图，从图17中可以看出，甘氨酸亚铁可显著改善CIA模型小鼠的踝关节骨破坏。
4、血清炎症因子IL-1β和IL-6的含量
血清炎症因子IL-1β和IL-6的含量是使用Elisa试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)的使用说明测定。采用摘眼球取血法，取上层血清检测炎症因子水平。图18为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠血清中血清炎症因子IL-1β的浓度，图19为正常组、模型组、高剂量给药组和低剂量给药组的小鼠血清中血清炎症因子IL-6的浓度。从图18和图19中可以看出，给药组小鼠血清中的IL-6与IL-1β水平显著低于模型组，证明甘氨酸亚铁可显著性降低小鼠血清炎症因子IL-6与IL-1β水平，进一步说明甘氨酸亚铁在CIA模型小鼠体内的治疗作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.甘氨酸亚铁在制备抗炎性药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗炎性药物为抗类风湿关节炎药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗炎性药物具有如下(1)～(3)中至少一项功能：
(1)抑制炎症反应；
(2)抑制类风湿关节炎相关细胞的迁移；
(3)改善关节肿胀或破坏的情况。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制炎症反应包括抑制炎症因子白细胞介素-6和白细胞介素-1β的表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述类风湿关节炎相关细胞为成纤维样滑膜细胞。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其特征在于，所述甘氨酸亚铁在抗炎性药物中的有效浓度为5～500μM。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述甘氨酸亚铁在抗炎性药物中的有效浓度为10～300μM。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由甘氨酸亚铁和一种或多种药学上或食品上可接受的辅料组成。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中甘氨酸亚铁的有效浓度为5～500μM。
10.一种由权利要求8或9中任一项所述的药物组合物制备的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为汤剂、口服液剂、颗粒剂、滴丸、片剂、胶囊或配方颗粒。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134227A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-22 Bortz Jonathan D Compositions including iron
US20190365697A1 (en) * 2017-02-17 2019-12-05 Profeat Biotechnology Co., Ltd. Method for Treating Liver Dysfunction
US20200129544A1 (en) * 2017-06-30 2020-04-30 Rozegen Llc Iron glycine sulfate compositions and uses thereof
US20220031651A1 (en) * 2018-12-20 2022-02-03 Profeat Biotechnology Co., Ltd. Composition comprising ferrous amino acid particles and method for treating or ameliorating pancres-related disease using the same

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060134227A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-22 Bortz Jonathan D Compositions including iron
US20190365697A1 (en) * 2017-02-17 2019-12-05 Profeat Biotechnology Co., Ltd. Method for Treating Liver Dysfunction
US20200129544A1 (en) * 2017-06-30 2020-04-30 Rozegen Llc Iron glycine sulfate compositions and uses thereof
US20220031651A1 (en) * 2018-12-20 2022-02-03 Profeat Biotechnology Co., Ltd. Composition comprising ferrous amino acid particles and method for treating or ameliorating pancres-related disease using the same

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