CN114762739B - 高强度的羟基磷灰石-竹基生物活性支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种高强度的羟基磷灰石‑竹基生物活性支架及其制备方法。该羟基磷灰石‑竹基生物活性支架包括：竹基模板和包裹在竹基模板支架表面的经模拟体液矿化处理后形成的羟基磷灰石纳米颗粒层；该竹基模板为经脱木质素溶液处理的具备竹子原有的竹纤维之间的结合方式和多级孔道结构。该羟基磷灰石‑竹基生物活性支架的制备方法包括：将天然竹块去除内外表皮后，常温下经过脱木质素溶液浸泡处理后，取出后超声水洗，干燥得到脱木质素的竹基模板；然后将该竹基模板浸入10～200 mg/mL氯化钙溶液中12‑48小时以吸附溶液中的钙离子，取出常温干燥后进行所述矿化处理。

Description

高强度的羟基磷灰石-竹基生物活性支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种高强度的羟基磷灰石-竹基生物活性支架及其制备方法，以及将所述支架用于修复骨缺损的制备方法和用途，属生物材料领域。
背景技术
移植骨替代材料是临床上修复骨缺损的一种常用的有效策略，然而，传统的骨替代材料却难以同时提供骨再生所需的力学性能和生物活性；人体中的骨是一种力学性能优异的天然材料，具有从纳米到微米尺寸的多级有序结构，其中精细的微纳米界面以及多级孔道等复杂结构是在人工合成材料中难以完全复制的；生物模板法是近些年来发展起来的一种制备多级结构材料策略，该方法利用天然材料本身作为生物模板指导材料的生长，进而得到具有多级结构的材料，竹子也是一种典型的高强高韧的天然材料，竹子中的纤维束结构以及薄壁组织基质不但具有支撑植物体的功能，同时竹子中也遍布着从几微米到几十微米不等的大量毛细管通道，具有良好的毛细作用，其中的导管、气孔等结构对于运输其生长所需的水分、氧气及各种营养物质起着重要作用；因此，竹子无论从在材料的结构上还是在生物学功能上，都是制备具有类骨功能性生物医用材料的极好模板。
传统获取竹纤维的方式多是经过碱性溶液或者过氧化物溶液加热处理，竹子原有的结构遭到破坏，竹子解聚分散成一根根的竹纤维；本专利中，通过生物模板和生物矿化相结合的方法制备了羟基磷灰石-竹基生物活性支架，且采用了常温、长时间浸泡的方法进行木质素的脱除。这一方法工艺简单，条件易于控制，处理方式温和，可以在完全去除竹子中木质素同时，保持竹子原有的结构不遭受破坏，进而可以有效保持竹子原有的多级孔道结构和力学强度。
羟基磷灰石-竹基生物活性支架具有良好的力学强度、液体输运性能和细胞相容性等性能，是一种潜在的用于承重部位骨缺损修复的生物活性植入材料，因此，本专利制备的高强度羟基磷灰石修饰的竹基生物活性支架具有很强的实用意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过生物模板和生物矿化相结合的方法制备的羟基磷灰石修饰的竹基生物活性支架；通过对该支架的结构、成分、力学性能、液体输运性能和体外细胞相容性等性能进行系统地评估，以确定其是否能够成为用于承重部位骨缺损修复的生物活性植入材料。
第一方面，本发明提供了一种羟基磷灰石-竹基生物活性支架，包括竹基模板和包裹在竹基模板支架表面的经模拟体液矿化处理后形成的羟基磷灰石纳米颗粒层；所述竹基模板为经脱木质素处理的具备竹子原有的竹纤维之间的结合方式和多级孔道结构，所述脱木质素溶液包括质量分数为5-20％的亚氯酸盐溶液与0.1-0.5％聚乙二醇辛基苯基醚，所述亚氯酸盐溶液与所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量比为10-200:1。
本发明提供的支架，竹基模板并未破坏竹子原有的多级结构，因而可以有效保持竹子本身的力学强度。此外，矿化处理形成的羟基磷灰石层均匀的覆盖在竹基模板的细胞壁表面，从而进一步的提升了材料的力学强度。本发明将天然竹子去除天然表皮后进行脱木质素处理，在常温下将其浸泡于所述脱木质素溶液中进行处理。本发明的处理方式温和，经脱木质素后的竹基模板支架颜色为白色，其中的木质素得到了有效的脱除，并且没有破坏竹纤维之间的结合，进而可以有效保持竹子原有的多级孔道结构和力学强度。
在所述竹基生物活性支架中，所述竹基模板的Ca/P比优选为1.67-1.85，所述竹基模板的Ca/P比越接近羟基磷灰石的Ca/P比，则容易使植入材料与骨组织相结合，提高修复效果。
在一优选方案中，包裹在竹基模板支架表面的经模拟体液矿化处理后形成的羟基磷灰石纳米颗粒层中，所述颗粒的直径为小于500纳米。
较佳地，所述模拟体液pH为7～7.45，接近人体组织体液的pH。使用模拟体液可以更好地模拟本发明的竹基模板支架在生物体内的反应情况。经过试验可以发现所述竹基模板支架可以在模拟体液中形成羟基磷灰石纳米颗粒层，这说明所述竹基模板具有生物活性，并可作为植入体应用。
在一优选方案中，本发明提供的所述复合生物活性支架的抗弯强度为221～261MPa，抗压强度为94～119MPa。又，所述复合生物活性支架的弯曲模量为8～10GPa，压缩模量为2.5～4GPa。
采用静态机械测试机测定支架的抗弯强度、抗压强度，并根据应力-应变曲线计算支架的模量。竹基模板并未破坏竹子原有的多级结构，因而可以有效保持竹子本身的力学强度。此外，矿化处理形成的羟基磷灰石层均匀的覆盖在竹基模板的细胞壁表面，从而进一步的提升了材料的力学强度。
在一优选方案中，本发明提供的所述复合生物活性支架对模拟体液沿逆重力方向的输运速率为0.8～2.5mm/s。
第二方面，本发明提供一种羟基磷灰石-竹基生物活性支架的制备方法，包括以下步骤：
a)将天然竹块去除内外表皮，常温下经过脱木质素溶液浸泡处理后，取出超声水洗至溶液澄清，干燥得到脱木质素的竹基模板；
b)然后将所述竹基模板浸入10～200mg/mL氯化钙溶液中12～48小时以吸附溶液中的钙离子；
c)将吸附钙离子的竹基模板取出干燥后进行生物矿化处理，制得羟基磷灰石修饰的竹基生物活性支架。
本发明通过生物模板和生物矿化相结合的方法制备了羟基磷灰石-竹基生物活性支架，工艺比较简单，条件易于控制，处理方式温和，可以在完全去除竹子中木质素同时，仍能保持竹子原有的结构不遭受破坏，进而可以有效保持竹子原有的多级孔道结构和力学强度。
将天然竹块去除内外表皮，常温下经过脱木质素溶液浸泡处理后；浸泡时间优选为7～60天。
较佳地，所述亚氯酸盐溶液为亚氯酸钠、亚氯酸钙、亚氯酸镁中的至少一种。
较佳地，所述生物矿化包括将干燥的竹基模板支架浸入模拟体液环境中矿化1～10天，优选为矿化3～7天。矿化时间过短，竹基生物活性支架中颗粒尺寸过大且Ca/P比过高于羟基磷灰石；矿化时间过长，矿化产生的无机颗粒会一定程度上堵塞竹子的孔道结构，降低材料的液体运输性能。所述模拟体液环境包括模拟体液溶液和37℃的体内温度环境。矿化7天后得到的羟基磷灰石-竹基生物活性支架具有与皮质骨相似的力学性能其抗弯强度和抗压强度分别可达到241.5MPa和104.3MPa；并且该支架在具有较高机械强度的同时可以保持较低的模量，其弯曲模量和压缩模量分别为8.8GPa和3.1Gpa。
本发明通过生物模板和生物矿化相结合的方法制备的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，具有良好的力学强度、液体输运性能和细胞相容性等性能，是一种潜在的用于承重部位骨缺损修复的生物活性植入材料。且所述制备方法工艺比较简单，条件易于控制，处理方式温和，可以在完全去除竹子中木质素同时，仍能保持竹子原有的结构不遭受破坏，进而可以有效保持竹子原有的多级孔道结构和力学强度，具有很强的实用意义。
附图说明
图1为脱木质素前后竹基模板的光学照片，(a)脱木质素前的竹基模板(Bamboo)；(b)脱木质素后的竹基模板(D-Bamboo)；D-Bamboo支架颜色变为白色，表明其中的木质素得到了脱除；
图2为脱木质素前后竹基模板的化学表征，(a)脱木质素前后竹基模板的FTIR图谱；(b)脱木质素前后竹子中各组分含量的表征；表明D-Bamboo中木质素得到完全的脱除；
图3为脱木质素前后竹竹基模板的断面形貌，木质素的脱除并未破坏对竹基模板原有的多级结构，并且提升了其多孔结构的连通性；
图4为不同羟基磷灰石-竹基生物活性支架(HA-Bamboo)生物活性支架的光学照片，(a)矿化1天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架(HA-Bamboo-1)；(b)矿化3天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架(HA-Bamboo-3)；(c)矿化7天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架(HA-Bamboo-7)；
图5为不同HA-Bamboo生物活性支架的断面形貌，从上至下，图像放大倍数不断增加，矿化后支架的细胞壁表面都覆盖有纳米羟基磷灰石颗粒；
图6为HA-Bamboo生物活性支架的EDS分析，(a)HA-Bamboo-1；(b)HA-Bamboo-3；(c)HA-Bamboo-7；从图中可知矿化3天和7天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架中纳米颗粒的Ca/P比分别为1.75和1.69，接近于羟基磷灰石的Ca/P比(1.67)；
图7为不同HA-Bamboo生物活性支架的抗弯强度，矿化7天后得到的HA-Bamboo-7支架的抗弯强度可达到241.5MP；
图8为不同HA-Bamboo生物活性支架的抗压强度，矿化7天后得到的HA-Bamboo-7支架的抗压强度可达到104.3MPa；
图9为不同HA-Bamboo生物活性支架的弹性模量，表明HA-Bamboo支架在具有较高机械强度的同时还能保持较低的模量；
图10为液体运输性能实验中不同支架的光学照片，表明HA-Bamboo支架的具有良好的液体输运能力；
图11为液体运输性能实验中各支架液体上升高度随时间的变化曲线，从图中可知具有良好的液体输运性能；
图12为骨髓间充质干细胞在矿化7天后的HA-Bamboo-7支架上端表面的共聚焦图像，表明HA-Bamboo-7支架可以逆重力地将支架底端的细胞悬液定向输送到支架上端；
图13为骨髓间充质干细胞在矿化3天和7天后的HA-Bamboo支架上培养1天后的细胞形态，从图中可知骨髓间充质干细胞可以粘附在支架表面，并有大量的细胞伪足伸出；
图14为内皮细胞在矿化3天和7天后的HA-Bamboo支架上培养1天后的细胞形态，从图中可知内皮细胞可以粘附在支架表面，并有大量的细胞伪足伸出。
具体实施方式
以下通过下述实施方式对本发明作进一步说明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。如未作具体地说明，所述模拟体液可通过市售或自制方式获得，下述实施例中使用的模拟体液包括将16.0724g氯化钠(NaCl)、0.7014g碳酸氢钠(NaHCO3)、0.4489g氯化钾(KCl)、0.4606g磷酸氢二钾(KH2PO4·3H2O)、0.6224g氯化镁(MgCl2·6H2O)、80ml盐酸(HCl，1mol/L)、0.7670g无水氯化钙(CaCl2)、0.1434g硫酸钠(Na2SO4)、12.1383g三羟甲基氨基甲烷[(CH2OH)3CNH2]溶于1.8L去离子水中，并将pH调节至7.4获得的溶液。
本发明采用亚氯酸钠、Triton X-100和天然竹子为原料，根据不同骨缺损部位选用合适尺寸的天然竹子，将竹子中的木质素脱除，制备得到初步的竹基模板。然后将竹基模板浸入模拟体液中矿化，使竹基模板支架表面形成均匀的羟基磷灰石纳米层，得到羟基磷灰石-竹基生物活性支架(HA-Bamboo)。
采用质量分数为5-20％的亚氯酸盐溶液与0.1-0.5％Triton X-100为原料，制备得到脱木质素溶液。在一具体实施方式中，使亚氯酸盐溶液与Triton X-100的质量比为10-200:1得到脱木质素溶液。
将去除表皮的天然竹子支架在常温下浸入脱木质素溶液，由于木质素为有色物质，直至所述支架变为纯白色后，即支架中的木质素完全去除后将支架取出。在一具体实施方式中，浸泡时间为7-60天。取出后将样品反复超声水洗至溶液澄清，常温下自然干燥得到脱木质素的竹基模板。
将竹基模板浸入10～200mg/mL的氯化钙溶液中12～48小时以吸附溶液中的钙离子。取出常温干燥后对样品进行生物矿化处理。
将干燥的竹基模板支架浸入常规配置的模拟体液溶液中，在37℃模拟生理环境下矿化1-10天，矿化过程中每天更换模拟体液溶液。
脱木质素竹基模板的成分及形貌(参看附图1)
通过红外光谱仪(FTIR)、自动纤维分析仪和扫描电镜(SEM)对制备的脱木质素竹基模板的成分及形貌进行表征。传统获取竹纤维的方式多是经过碱性溶液或者过氧化物溶液加热处理，竹子原有的结构遭到破坏，竹子解聚分散成一根根的竹纤维。本发明中采用的是常温下长时间浸泡脱木质素溶液的方式，处理方式比较温和，经脱木质素后的竹基模板支架颜色为白色，其中的木质素得到了有效的脱除，并且没有破坏竹纤维之间的结合，进而可以有效保持竹子原有的多级孔道结构和力学强度。
羟基磷灰石-竹基生物活性支架的成分及形貌
通过SEM和X射线能谱分析(EDS)等对制备的羟基磷灰石-竹基生物活性支架的成分及形貌进行表征。经模拟体液矿化后，竹基支架的表面都包裹了一层均匀的羟基磷灰石纳米颗粒，随着矿化时间的延长，纳米颗粒的粒径逐渐减小且变得更为均匀，且竹基生物活性支架的Ca/P比的接近于羟基磷灰石的Ca/P比(1.67)。
羟基磷灰石-竹基生物活性支架的力学性能。
采用静态机械测试机测定了支架的抗弯强度、抗压强度，并根据应力-应变曲线计算支架的模量。竹基模板并未破坏竹子原有的多级结构，因而可以有效保持竹子本身的力学强度。此外，矿化后的羟基磷灰石层均匀的覆盖在竹基模板的细胞壁表面，从而进一步的提升了材料的力学强度。
在一具体实施方式中，本发明制备的羟基磷灰石-竹基生物活性支架具有与皮质骨相似的力学性能其抗弯强度和抗压强度分别可达到261MPa和119MPa；并且该支架在具有较高机械强度的同时可以保持较低的模量，其弯曲模量为8～10GPa，其压缩模量为2.5～3.4GPa。
羟基磷灰石-竹基生物活性支架的液体输运性能。
将本发明的实施例3制得的羟基磷灰石-竹基生物活性支架进行液体输运性能测试：采用红墨水对模拟体液溶液进行染色标记，将尺寸为3mm×6mm×30mm的长方体样品竖直放置在盛有上述溶液的培养皿中(液面高度为5mm)，记录材料输运溶液的高度；在30s内，液体都能够到达羟基磷灰石-竹基生物活性支架的最顶端；2min内液体基本可以遍布整个支架，由此可见，根据本发明的羟基磷灰石-竹基生物活性支架具有良好的液体输运性能。同时，为了评价材料的液体输运功能对细胞定向迁移的作用，将矿化7天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架下端浸入细胞悬液中，培养24h后用共聚焦激光扫描显微镜观察支架上端表面的是否有细胞的存在，其中，鬼笔环肽-AF488(AF488 Phalloidin)用于细胞质的染色；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)用于细胞核的染色。
该细胞实验表明，本发明使用天然竹子制备得到的羟基磷灰石-竹基生物活性支架保留了天然竹子的多级结构，仍具有良好的毛细作用，可以逆重力地将支架底端的细胞悬液定向输送到支架上端；表明支架良好的液体输运能力有利于细胞沿支架方向的定向传输，能够有效提升细胞的迁移距离。
羟基磷灰石-竹基生物活性支架的细胞相容性评价。
参看附图13骨髓间充质干细胞和内皮细胞能很好地粘附在羟基磷灰石-竹基生物活性支架表面。同时，粘附在支架表面上的细胞都有着较好的铺展状态，有大量的细胞伪足伸出，这表明支架上细胞具有良好的活力，进一步证明脱木质素后的竹基支架并不会对细胞产生毒害作用。
实施例1：
a)向质量分数为10％的NaClO2溶液中加入0.1％Triton X-100制备得到脱木质素溶液，其中亚氯酸钠溶液与Triton X-100的质量比为100:1；
b)将去除表皮的天然竹子支架在常温下浸入脱木质素溶液30天，直至其中的木质素完全去除后取出；
c)将样品反复超声水洗至溶液澄清，自然干燥得到脱木质素的竹基模板；
d)将竹基模板浸入100mg/mL的氯化钙溶液中24小时后，取出于常温下自然干燥；
e)进一步将支架置于37℃的模拟体液溶液下矿化1天。
矿化后支架的细胞壁表面都覆盖有纳米羟基磷灰石颗粒；矿化1天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架中纳米颗粒的Ca/P比为1.85。
实施例2：
a)向质量分数为10％的NaClO2溶液中加入0.1％Triton X-100制备得到脱木质素溶液，其中亚氯酸钠溶液与Triton X-100的质量比为100:1；
b)将去除表皮的天然竹子支架在常温下浸入脱木质素溶液30天，直至其中的木质素完全去除后取出；
c)将样品反复超声水洗至溶液澄清，自然干燥得到脱木质素的竹基模板；
d)将竹基模板浸入100mg/mL的氯化钙溶液中24小时后，取出干燥；
e)进一步将支架浸入模拟体液溶液并置于37℃环境下矿化3天，矿化过程中每天更换模拟体液溶液。
矿化后支架的细胞壁表面都覆盖有纳米羟基磷灰石颗粒；矿化3天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架中纳米颗粒的Ca/P比为1.75；该HA-Bamboo-3支架的抗弯强度可达到228.6MPa；抗压强度可达到118.6MPa，且该支架在具有较高机械强度的同时可以保持较低的模量，其弯曲模量和压缩模量分别为8.3GPa和3.1GPa；该支架对模拟体液沿逆重力方向的输运速率为2.5mm/s；该支架能够很好的支持间充质干细胞和内皮的粘附和铺展，具有良好的细胞相容性。
实施例3：
a)向质量分数为10％的NaClO2溶液中加入0.1％Triton X-100制备得到脱木质素溶液，其中亚氯酸钠溶液与Triton X-100的质量比为100:1；
b)将去除表皮的天然竹子支架在常温下浸入脱木质素溶液30天，直至其中的木质素完全去除后取出；
c)将样品反复超声水洗至溶液澄清，自然干燥得到脱木质素的竹基模板；
d)将竹基模板浸入100mg/mL的氯化钙溶液中24小时后，取出干燥；
e)进一步将支架浸入模拟体液溶液并置于37℃环境下矿化7天，矿化过程中每天更换模拟体液溶液。
矿化后支架的细胞壁表面都覆盖有纳米羟基磷灰石颗粒；矿化7天后的羟基磷灰石-竹基生物活性支架中纳米颗粒的Ca/P比为1.69；矿化7天后得到的HA-Bamboo-7支架的抗弯强度可达到241.5MP；抗压强度可达到104.3MPa；且该支架在具有较高机械强度的同时可以保持较低的模量，其弯曲模量和压缩模量分别为8.8GPa和3.1GPa；该支架对模拟体液沿逆重力方向的输运速率约为0.8mm/s；该支架能够很好的支持间充质干细胞和内皮的粘附和铺展，具有良好的细胞相容性。
以上所述实施例仅为本发明部分实验数据，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改，等同替换，改进，应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，包括竹基模板和包裹在竹基模板支架表面的经模拟体液矿化处理后形成的羟基磷灰石纳米颗粒层；所述竹基模板为经脱木质素溶液处理的具备竹子原有的竹纤维之间的结合方式和多级孔道结构；
所述羟基磷灰石-竹基生物活性支架的制备方法包括：将天然竹块去除内外表皮后，常温下经过脱木质素溶液浸泡处理后，取出后超声水洗，干燥得到脱木质素的竹基模板；然后将所述竹基模板浸入10～200 mg/mL氯化钙溶液中12-48小时以吸附溶液中的钙离子，取出常温干燥后进行所述矿化处理，制得羟基磷灰石修饰的竹基生物活性支架；
所述脱木质素溶液包括质量分数为5-20％的亚氯酸盐溶液与0.1-0.5％聚乙二醇辛基苯基醚，所述亚氯酸盐溶液与所述聚乙二醇辛基苯基醚的质量比为10-200:1；
所述矿化处理为将干燥的竹基模板支架置入模拟体液环境中矿化1～10天；
所述模拟体液的pH为7～7.45。
2.根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述竹基模板的Ca/P比为1.67～1.85。
3.根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述羟基磷灰石纳米颗粒层中颗粒的直径小于500纳米。
4. 根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述羟基磷灰石-竹基生物活性支架的抗弯强度为221～261 MPa，抗压强度为94～120MPa，弯曲模量为8～10GPa，压缩模量为2.5～3.4GPa。
5.根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述羟基磷灰石-竹基生物活性支架对模拟体液沿逆重力方向的输运速率为0.6～3mm/s。
6.根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述浸泡的时间为7～60天。
7.根据权利要求1所述的羟基磷灰石-竹基生物活性支架，其特征在于，所述亚氯酸盐溶液为亚氯酸钠、亚氯酸钙、亚氯酸镁中的至少一种。
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