CN103097529A - 在纤维素生物质的预处理期间有活性的木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

提供了多种用一种具有木聚糖酶活性的木聚糖酶来处理木质纤维素材料的组合物以及方法。该酶在增加的pH与温度下是稳定的并且有活性的。本发明因此提供用于水解木质纤维素材料的方法尤其是水解纤维素与半纤维素的方法,它们是非木本植物与木本植物的细胞壁的主要组分。这些用于水解纤维素与半纤维素的方法可以用于任何植物、木材或木制品、木材废料、纸浆、纸产品或纸废料或副产品。

Description

在纤维素生物质的预处理期间有活性的木聚糖酶
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年9月10日提交的美国临时专利申请序列号61/381,455的权益,由此通过引用将其以其全文结合在此。
电子提交的序列表参考
序列表的官方副本是2010年7月1日生成的经由EFS-Web以ASCII格式的序列表以名为“72840SequenceListing.txt”的文件进行电子提交的,该副本的大小为76kb并且与本说明书同时提交,该副本是于此的一部分并且如果提出则以其全文通过引用结合在此。
技术领域
本发明总体上涉及使用具有木聚糖酶活性的酶类来加工木质纤维素材料的方法。
发明背景
半纤维素是一类植物衍生的杂多糖,它们与纤维素以及木素有关联。最普通的半纤维素是木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖以及木葡聚糖。
木聚糖酶催化了木聚糖(一种木糖杂聚物)的1,4-β骨架的内部水解。木聚糖酶是由以下生物体自然产生的,例如藻类、细菌、真菌、腹足类与原生动物,它们可以利用木糖作为一种碳源用于细胞新陈代谢。参见,Prade(布雷德)(1995)《生物工业遗传工程综述》(Biotech.Genet.Eng.Rev.)13:100-131。
木聚糖酶在饲料、食品/饮料和工业产业方面的商业应用(例如,生物质应用)多样。在饲料产业中,木聚糖酶在单胃与反刍动物饲料中用来增加很差地可降解的饲料(例如大麦、青贮饲料以及小麦)的消化率与营养价值。在食品/饮料产业中,木聚糖酶在水果与蔬菜加工中用来加工制造蜜、泥以及汁;在酿造和酿酒中用来水解谷物中的粘液物质用于发酵;并且在烘焙中用来改进生面团的品质(例如,弹性以及强度)。在工业产业中,木聚糖酶在造纸中用来减少在木纸浆的漂白过程中的氯消耗与毒物排放;在纺织品加工中用来减少或替代化学沤麻;并且在生物除污/生物转化中用来处理/再循环废弃物并且加工生物燃料与精细化工产品。
在这些应用的许多中,木聚糖酶是与多种其他的木质纤维素酶结合使用,例如纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶以及蛋白酶。木质纤维素酶因此在饲料、食品/饮料与工业行业具有重要的潜在应用。需要用于有效加工木质纤维素材料的新组合物和方法。
发明概述
提供了多种用于加工木质纤维素材料的组合物以及方法。这些组合物包括至少一种酶,其中该酶具有木聚糖酶活性并且其中该酶在高温与高pH下具有活性。木聚糖酶包括耐热的并且嗜碱的木聚糖酶,特别是家族10木聚糖酶。由于这些酶的嗜碱性质,它们可以制备为被进一步合并到在高pH下(典型地,pH8.5或更高)进行的方法中的组合物或配制品。这些酶在高温下保持活性。这些组合物还可以包括其他的用于加工木质纤维素的酶类,例如纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶以及蛋白酶。
本发明的这些木聚糖酶可以用来转化感兴趣的生物体。这类生物体包括细菌、真菌、以及植物。因此,披露了已经被改性为表达本发明的这些木聚糖酶中的至少一种的植物、植物部分以及种子。认识到改性为表达木聚糖酶的植物可以展示可以通过从家族10类酶选择木聚糖酶而改善的负农学表型。
这些方法涉及木聚糖酶或在此描述的组合物在不同饲料、食品/饮料和技术应用中的木质纤维素材料中水解木聚糖的用途。这些木聚糖酶对于将木质纤维素材料进行生物转化为更简单多糖或甚至单糖而言是有用的。这些单糖或多糖可以用于例如,饲料或食品/饮料的生产,例如基于谷类的动物饲料、麦芽汁或啤酒、奶或奶产品、水果或蔬菜产品;精细化工产品的生产,例如丁醇、乙醇、甲醇和/或丙醇;或燃料的生产,包括生物燃料,例如生物乙醇、生物醚、生物柴油以及合成气。木聚糖酶在木质纤维素材料的生物转化中是有用的,因为它是热稳定性的并且可以在高pH下使用。
以下实施例涵盖在本发明中。
1.包括至少一种木聚糖酶的一种组合物,其中该组合物具有至少约pH8.5的pH,并且其中所述木聚糖酶是一种耐热的并且嗜碱的家族10木聚糖酶。
2.如实施例1所述的组合物,其中所述木聚糖酶具有选自下组的一个氨基酸序列,该组由以下各项组成:
a)SEQ ID号:6、8或10中列出的一个氨基酸序列;
b)与SEQ ID号:6、8或10中列出的氨基酸序列具有至少约90%序列一致性的一个氨基酸序列;
c)与SEQ ID号:6、8或10中列出的氨基酸序列具有至少约95%序列一致性的一个氨基酸序列;
d)与SEQ ID号:6、8或10中列出的氨基酸序列具有至少约99%序列一致性的一个氨基酸序列;以及,
e)SEQ ID号:6、8或10的一个片段,其中所述片段保持木聚糖酶活性。
3.如实施例1所述的组合物,其中该组合物具有约pH12的pH。
4.如实施例3所述的组合物,其中该酶在高达约95℃的温度下是稳定的。
5.如实施例1或2所述的组合物,进一步包括选自下组的至少一种酶,该组由以下各项组成:一种纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶和蛋白酶。
6.如实施例5所述的组合物,其中该纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、1,3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-β-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。
7.如实施例5所述的组合物,其中该半纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、内切-半乳聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶、外切-β-1,4-甘露糖苷酶、外切-β-1,4-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、对位-熏草酸酯酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶和木葡聚糖内糖基转移酶。
8.如实施例5所述的组合物,其中该木质酶选自下组,该组由以下各项组成:一种二芳基丙烷过氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、木素过氧化酶、锰过氧化酶、甲醇氧化酶、甲醇氧化还原酶、苯酚氧化酶、苯酚过氧化酶和藜芦基醇氧化酶。
9.如实施例5所述的组合物,其中该果胶酶是选自下组,该组由以下各项组成:一种果胶降解酶、pectozyme酶和多聚半乳糖醛酸酶。
10.如实施例5所述的组合物,其中该蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:一种萝蘼蛋白酶、菠萝酶、caricain酶、木瓜凝乳蛋白酶、胶原酶、甘氨酰肽链内切酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
11.如实施例1、2、或5所述的组合物,进一步包括至少一种选下组的酶,该组由以下各项组成:一种淀粉酶、过氧化氢酶、角质酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶、支链淀粉酶和木糖异构酶。
12.如实施例1、2、5、或11所述的组合物,进一步包括至少一种选自下组的试剂,该组由以下各项组成:一种氯、洗涤剂、次氯酸盐、过氧化氢、草酸、过酸、pH-调节试剂、磷酸三钠、亚氯酸钠、硝酸钠、表面活性剂、脲和水。
13.如实施例1、2、5、11、或12所述的组合物,进一步包括一种产乙醇微生物,例如一种细菌或酵母。
14.用核酸构建体转化的一种宿主细胞,包括任选地连接到编码木聚糖酶的核苷酸序列的一个启动子,其中该细胞是一种细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞,其中该启动子关于该核苷酸序列是异源的,并且其中该木聚糖酶是一种耐热的并且嗜碱的家族10木聚糖酶。
15.如实施例14所述的宿主细胞,其中该木聚糖酶具有选自下组的一个氨基酸序列,该组由以下各项组成:SEQ ID号:6、8或10,或其一个活性变体或片段。
16.如实施例14所述的宿主细胞。其中该核苷酸序列选自下组,该组由以下各项组成:SEQ ID号:5、7和9。
17.一种加工木质纤维素材料的方法,所述方法包括在其中pH为至少pH8.5的条件下,使木质纤维素材料与至少一种木聚糖酶接触,并且其中所述木聚糖酶是一种耐热的并且嗜碱的家族10木聚糖酶。
18.如实施例17所述的方法,其中所述木聚糖酶具有选自下组的一个氨基酸序列,该组由以下各项组成:SEQ ID号:6、8或10或其一个活性变体或片段。
19.如实施例17所述的方法,其中这些条件包括约95℃的反应温度。
20.如实施例17或18所述的方法,其中该木聚糖酶以从约0.01单位至约1000单位存在。
21.如实施例17或18所述的方法,其中该木聚糖酶以约500单位存在。
22.如实施例17或18所述的方法,其中该pH随时间降低至约pH6的pH。
23.如实施例17或18所述的方法,其中该接触持续约12小时至约24小时。
24.如实施例17或18所述的方法,其中该接触持续约6小时。
25.如实施例17或18所述的方法,其中该接触是在选自下组的至少一种额外的酶存在下进行的,该组由以下各项组成:一种纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶和蛋白酶。
26.如实施例25所述的方法,其中该纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、1,3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-β-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。
27.如实施例25所述的方法,其中该半纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、内切-半乳聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶、外切-β-1,4-甘露糖苷酶、外切-β-1,4-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、对位-熏草酸酯酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶和木葡聚糖内糖基转移酶。
28.如实施例25所述的方法,其中该木质酶选自下组,该组由以下各项组成:一种二芳基丙烷过氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、木素过氧化酶、锰过氧化酶、甲醇氧化酶、甲醇氧化还原酶、苯酚氧化酶、苯酚过氧化酶和藜芦基醇氧化酶。
29.如实施例25所述的方法,其中该果胶酶是选自下组,该组由以下各项组成:果胶降解酶、pectozyme酶和多聚半乳糖醛酸酶。
30.如实施例25所述的方法,其中该蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:一种萝蘼蛋白酶、菠萝酶、caricain酶、木瓜凝乳蛋白酶、胶原酶、甘氨酰肽链内切酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
31.如实施例17、18、或25所述的方法,其中该方法包括用至少一种选下组的酶进行加工,该组由以下各项组成:一种淀粉酶、过氧化氢酶、角质酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶、支链淀粉酶和木糖异构酶。
32.如实施例17、18、25、或31所述的组合物,其中该方法进一步包括用至少一种选自下组的试剂进行加工,该组由以下各项组成:一种氯、洗涤剂、次氯酸盐、过氧化氢、草酸、过酸、pH-调节试剂、磷酸三钠、亚氯酸钠、硝酸钠、表面活性剂、脲和水。
33.如实施例17、18、25、31、或32所述的方法,其中该方法进一步包括用一种产乙醇微生物进行加工,该产乙醇微生物例如是一种细菌或酵母。
34.如实施例17至33中任一项所述的方法,其中在步骤(a)之前,通过生物预处理、化学预处理或物理预处理对该木质纤维素材料进行预处理。
35.如实施例34所述的方法,其中该生物预处理包括使用木素增溶微生物。
36.如实施例35所述的方法,其中该化学预处理选自下组,该组由使用以下处理组成:碱处理、氨处理、稀酸处理、有机溶剂处理、臭氧处理、二氧化硫处理、二氧化碳处理和pH控制的水热处理。
37.如实施例35所述的方法,其中该物理预处理选自下组,该组由使用以下项组成:水热处理、辐射、研磨、气烘/蒸汽喷发和声处理(超声处理)。
从以下描述,本发明的这些和其他优点、特征、以及目的将变得更好理解。示例性实施例的描述并不旨在将本发明限制在所披露的二聚体形式,而是相反,意图是打算覆盖落在如以上实施例和以下权利要求书所限定的本发明的精神和范围内的所有替代方案、等价物和修改。因此应参考用于解释本发明的范围的以上实施例和以下权利要求书。
序列表概述
SEQ ID号:1:衍生自热纤维梭菌的多核苷酸序列,基因XynZ全酶
SEQ ID号:2:由SEQ ID号:1编码的多肽
SEQ ID号:3:衍生自热纤维梭菌的多核苷酸序列,基因XynZ阿魏酸酯酶(ferrulic acid esterase)
SEQ ID号:4:由SEQ ID号:3编码的多肽
SEQ ID号:5:衍生自海栖热孢菌(Thermotoga maritime)的多核苷酸序列,基因XynA
SEQ ID号:6:由SEQ ID号:5编码的多肽
SEQ ID号:7:衍生自海栖热孢菌的多核苷酸序列,基因XynB
SEQ ID号:8:由SEQ ID号:7编码的多肽
SEQ ID号:9:衍生自芽胞杆菌属的多核苷酸序列,基因XynA
SEQ ID号:10:由SEQ ID号:9编码的多肽
发明详细说明
概述
在此描述的工作首先示出分离自微生物(例如栖热孢菌)的木聚糖酶可以在木质纤维素材料的化学预处理过程中具有活性。即,在预处理过程中,木聚糖酶水解了木聚糖。这些酶在高pH与高温下保持了显著的木聚糖酶活性。木聚糖是半纤维素的一种主要组分,并且与纤维素和木素一起共同称为为木质纤维素,构成非木本与木本植物的组要成分。
如在此使用,“木质纤维素”或“木质纤维素材料”是指包括多糖聚合物(例如,纤维素、半纤维素以及木素)的非木本和木本植物材料,例如作物、植物和树木生物质。木质纤维素材料还可以包括作物、植物或树木废料产品,包括农业废弃物例如玉米秸秆以及甘蔗渣、专门的能源作物废弃物、木材废料例如锯木厂以及造纸厂废弃物、以及城市废纸。
在此描述的这些组合物与方法因此可以用来将木质纤维素材料加工为许多有用的有机化学品、燃料以及产品。例如,一些可以从木质纤维素材料生产的商品与特种化学品包括但不局限于,丙酮、乙酸盐、丁二醇、顺式-已二烯二酸、乙醇、乙二醇、糠醛、丙三醇、甘氨酸、赖氨酸、有机酸(例如,乳酸)、1,3-丙二醇、聚羟基烷酸酯、以及木糖。同样地,动物饲料以及不同的食品/饮料可以从木质纤维素材料来生产。总体参见,Lynd(林德)等人(1999)《生物技术进展》(Biotechnol.Prog.)15:777-793;Philippidis(菲力皮迪斯),《生物技术手册:生产与利用》(Handbookon Bioethanol:Production and Utilization)中的179-212页“纤维素生物转化技术”("Cellulose bioconversion technology"),编辑Wyman(怀曼)(泰勒与弗朗西斯出版社(Taylor&Francis)1996);以及Ryu(柳)&Mandels(曼德尔斯)(1980)《酶微生物技术》(Enz.Microb.Technol.)2:91-102。潜在的共同生产效益超出了在木质纤维素材料中从发酵性糖合成多种有机产品,因为加工之后剩下的富含木素的残余物可以转化为木素衍生的化学品或可以用于电力生产。
组合物
酶组合物
本发明的组合物包括至少一种木聚糖酶或其活性变体或片段,其中这些组合物是在高pH下有活性。“高pH”指一个至少约pH8.5的pH,包括约pH9.0、约pH9.5、约pH10.0、约pH10.5、约pH11.0、约pH11.5、约pH12.0、约pH12.5或更高。其他组分可以包括在包括其他酶类的这些组合物中。
本发明的木聚糖酶是耐热的并且嗜碱的家族10木聚糖酶。“耐热的”是指该酶在60℃30分钟以后,保持其活性的至少70%。“嗜碱的”是指该酶在8.5的pH30分钟以后,保持其活性的至少80%。
木聚糖酶是水解酶的一个大家族。如在此使用,“木聚糖酶”(xylanase)或“木聚糖酶类”(xylanases)是指一种能够至少将木聚糖水解为木二糖与木三糖的酶。由于木聚糖的异质性与复杂性,木聚糖酶在其折叠模式(即一级序列变体)、水解活性(即,产量、速率以及产物)、作用机制、底物特异性以及物理化学特征方面是相当多样的。参见,《植物生物化学与分子生物学方法》(Methods in PlantBiochemistry and Molecular Biology)(Dashek(达谢克)编辑,CRC出版社(CRC Press)1997);以及Collins(柯林斯)等人(2005)《FEMS微生物学综述》(FEMS Microbiol.Rev.)29:3-23。木聚糖酶的正式名称是例如内切-1,4-β-木聚糖酶;然而,它在本领域还称为内切木聚糖酶、1,4-β-D-木聚糖-木聚糖水解酶、内切-1,4-β-D-木聚糖酶、β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶。
对木聚糖酶与其他糖苷酶通过催化结构域的一级结构对比而进行分类并且分组进入相关序列的家族。参见,Henrissat(亨利萨特)等人(1989)《基因》(Gene)81:83-95;以及Henrissat(亨利萨特)等人(2001)《酶学方法》(Methods Enzymol.)330:183-201。在这一分类系统内,木聚糖酶典型地被限制于家族10和11。由于木聚糖酶在饲料、食物/饮料以及工业产业方面内的商业需求,一些极端嗜性木聚糖酶已经得以分离,特别是来自嗜酸、嗜碱以及嗜热细菌的木聚糖酶。
在此感兴趣的是高温(即,热稳定的)以及高pH(即,嗜碱的)耐受性的分离自微生物(例如,细菌)的展示出木聚糖酶活性的木聚糖酶。这类木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在一个实施例中,木聚糖酶可以来自一种栖热孢菌《环境微生物学》(Environ.Microbiol.)61:4403-4408。SEQ ID号:5和7分别列出了该酶的核苷酸和氨基酸序列。
这类木聚糖酶可以自其分离的其他细菌的实例包括但并不局限于芽孢杆菌(例如坚硬芽孢杆菌(
Figure BDA00002900703500091
登录号AAQ83581)、耐盐嗜碱芽孢杆菌S7(
Figure BDA00002900703500092
登录号AAV98623)、耐盐嗜碱芽孢杆菌C-125(
Figure BDA00002900703500093
登录号BAA00055)、芽孢杆菌菌株NG-27(
Figure BDA00002900703500094
登录号AAB70918)、以及嗜热脂肪芽孢杆菌T-6(
Figure BDA00002900703500095
登录号ABI49951));和栖热孢菌(例如海栖热孢菌(
Figure BDA00002900703500096
登录号AAD35164))。还参见Chang(常)等人,(2004)《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)319:1017-1025;Gat(加特)等人,(1994)《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.),60:1889-1896;Gupta(格普塔)等人,(2000)《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.),66:2631-2635;Hamamoto(滨本)等人,(1987)《农业与生物化学》(Agr.Biol.Chem.),51:953-955;Horikoshi(堀越)(1999)《微生物学与分子生物学综述》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.),63:735-750;Jiang(江)等人,(2006)《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.),70:65-71;以及Mamo(马莫)等人,(2006)《分子生物技术》(Mol.Biotechnol.),33:149-159。
这些酶在高温下显示出最佳木聚糖酶活性并且是热稳定的。在85℃,这些酶在pH6.8与pH9.3时的半衰期可以分别是约24小时与6.5小时。这些酶还可以在一个广泛的pH范围显示出实质性的木聚糖酶活性并且是嗜碱的。
这些木聚糖酶是耐热的并且热活性的。如在此使用,“耐热的”描述了具有大于60℃的熔化温度的酶。如在此使用,“热活性的”描述了在大于60℃具有最佳活性的酶。耐热的木聚糖酶在约60℃保温30分钟后保持至少约70%活性,在约70℃保温30分钟后保持至少约65%活性,在约80℃保温30分钟后保持至少约60%活性。这些酶在高达约85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、或更高的温度下保持木聚糖酶活性。
如在此使用,“嗜碱的”是指这些酶在pH8.5保持至少约70%活性,在pH9.0保持至少65%活性,在pH10.0保持至少60%活性。该木聚糖酶在pH12.0或更高时保持活性。
如在此使用,“约”是指一个值处于统计学上有意义的范围内,例如一种说明的浓度、时间范围、分子量、体积、温度或pH。这样的范围可以在给定值或给定范围的一种数量级之内,典型地在20%之内,更典型地在10%之内,并且甚至更典型地在5%之内。“约”所涵盖的可允许的变化将取决于研究的具体系统,并且可以易为本领域一个技术人员所理解。
虽然一种全长酶可以用于这些组合物中,但是其活性变体或片段也可以使用。如在此所使用,“变体”是指具有与参比酶序列(例如SEQ ID号:6、8或10)实质性相似的氨基酸序列的一种酶。变体还包括具有与编码该参比酶的核酸(例如SEQID号:5、7或9)实质性相似的核苷酸序列的一个核酸分子。对于分子(例如酶),变体可以包括在参比酶的氨基酸序列中的一个或多个位点添加或删除一个或多个氨基酸,和/或在参比酶的氨基酸序列中的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸残基。如在此所述,变体可以是活性的,并且因此继续拥有参比酶的所希望的活性,例如木聚糖酶活性。该变体可以产生于例如遗传多态性或产生于人的操作。如通过序列比对程序以及在此的其他地方描述的参数所确定的,该参比酶的活性变体与该参比酶的氨基酸序列可以具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更高的序列一致性。活性变体可以不同于该参比酶序列,不同处可少至1-15个氨基酸残基、少至1-10、少至6-10、少至5、少至4、3、2、或甚至1个氨基酸残基。
可以用不同方式从参比酶改变成变体,这些方式包括核苷酸或氨基酸删除、插入、取代和平截。用于这类操作的方法在本领域是熟知的。
例如,该参比酶的氨基酸序列变体可以通过将编码该酶的核苷酸序列进行突变来制备。用于诱变与核苷酸序列改变的方法在本领域是熟知的。参见,例如,Kunkel(昆克)(1985)《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82:488-492;Kunkel(昆克)等人(1987)《酶学方法》(Methods in Enzymol.)154:367-382;以及《分子生物学技术》(Techniques in Molecular Biology)(Walker(沃克)Gaastra(嘉仕堡)编辑,麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Co.1983)以及其中引用的参考文献;连同美国专利号4,873,192。不影响参考酶的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于Dayhoff(戴霍夫)等人(1978)《蛋白序列与结构图谱》(Atlas of Protein Sequence and Structure)(国家生物医药研究基金会,华盛顿特区)(National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.)的模型中。
并未预期酶的删除、插入和取代产生其特征中的根本性变化。然而,当在这样做以前很难预测取代、删除或插入的确切效果时,本领域的一个技术人员将理解可以通过木聚糖酶活性测定来评估效果。
木聚糖酶活性测定在本领域是熟知的。参见,例如,Bailey(贝利)等人(1992),《生物技术杂志》(J.Biotechnol.)23:257-270;Ge(葛)等人(2007),《分析生物化学》(Anal.Biochem.)362:63-68;Gibbs(吉布斯)等人(1995),如以上;Jeffries(杰夫瑞斯)等人(1998),《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)70-72:257-265;Kenealy(基尼利)&Jeffries(杰夫瑞斯)(2003),《生物技术通讯》(Biotechnol.Lett.)25:1619-1623;Miller(米勒)(1959),《分析化学》(Anal.Chem.)31:426-428;Taguchi(田口)等人(1996),《生物科学生物技术生物化学》(Biosci.Biotechnol.Biochem.)60:983-985;Teather(特泽)&Wood(伍德)(1982),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)43:777-780;以及Wang(王)&Broda(布罗达)(1992),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)58:3433-3436。同样地,用于测定木聚糖酶活性的试剂盒是可商购的,例如,购自Invitrogen公司(卡尔斯巴德(Carlsbad),加利福尼亚州)以及MegazymeInt'l Ireland Ltd公司(威克洛(Wicklow),爱尔兰)。
如以上所指出,这些组合物可以使用该木聚糖酶的活性片段。如在此使用的,“片段”是指该参考酶的一部分,该部分保留了木聚糖酶活性。片段还指为编码该参比酶的核酸分子的一部分。该酶的活性片段可以例如通过将表达该酶的经编码的片段的酶编码核酸分子的一部分进行分离(例如,利用体外重组体表达),并评估该片段的活性来制备。编码此类片段的核酸分子可以是至少约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或1,400个连续核苷酸,或高达存在于在此披露的全长酶编码核酸分子中的核苷酸数目。按照这样,多肽片段可以是至少约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225或250个连续氨基酸残基,或高达存在于该全长酶中的氨基酸残基总数目。
确定任何两种序列之间的序列一致性百分比可以使用一种数学算法来完成。此类数学算法的非限制性实例是Myers(迈尔斯)与Miller(米勒)(1988)CABIOS4:11-17的算法;Smith(史密斯)等人(1981)《应用数学进展》(Adv.Appl.Math.)2:482-489的局部比对算法;Needleman(尼德曼)与Wunsch(翁施)(1970)《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)48:443-453的全局比对算法;Pearson(皮尔逊)&Lipman(利普曼)(1988)《美国科学院院刊》85:2444-2448的局部搜索比对法(search-for-local alignment method);Karlin(卡尔林)与Altschul(阿尔丘尔)(1990)《美国科学院院刊》87:2264-2268的算法,如在Karlin(卡尔林)与Altschul(阿尔丘尔)(1993)《美国科学院院刊》90:5873-5877中的修改。
这些数学算法的电脑执行能用以比较序列以确定序列一致性。此类执行包括但不局限于:PC/Gene程序中的CLUSTAL(Intelligenetics公司,山景城,加利福尼亚州(Mountain View,CA));ALIGN程序(版本2.0;Corpet(科佩特)等人(1988)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)16:10881-10890;Higgins(希金斯)等人(1988)《基因》(Gene)73:237-244;Higgins(希金斯)等人(1989)CABIOS5:151-153;Huang(黄)等人(1992)CABIOS8:155-165;以及Pearson(皮尔逊)等人(1994)《分子生物学方法》(Meth.Mol.Biol.)24:307-331)以及GCG威斯康辛遗传软件包(GCG Wisconsin Genetics Software Package)第10版中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA与TFASTA(Accelrys Inc.公司;圣迭哥,加利福尼亚州(San Diego,CA))。利用这些程序的比对可以使用缺省参数来进行。
如在此使用,在上下文中两种核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”或“一致性”是指,当对一个特定区域的最大相符性进行比对时,这两种序列中的残基是相同的。在对于蛋白例如酶使用序列一致性的百分比时,公认地,不一致的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同,其中氨基酸残基被取代为其他具有相似化学特性(例如,电荷或疏水性)的氨基酸残基并且因此并不改变该酶的功能特性。当序列在保守取代方面不同时,该序列一致性百分比可以向上调整以对该取代的保守性质进行校正。因此类保守取代而不同的序列被认为是具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的手段是本领域一个技术人员熟知的。保守取代的分数是例如在PC/GENE程序(PC/GENE Program)中实施的进行计算。
如在此使用,“序列一致性百分比”是指一种通过在指定区域比较两种最佳比对的序列而确定的值,其中在该指定区域中的核苷酸或氨基酸序列部分与该参比序列(它不包括添加或删除)相比,可以包括用于这两种序列最佳比对的添加或删除(即,缺口)。该百分比是通过以下计算的:确定位置的数目(在这些位置,该一致的核苷酸或氨基酸残基在两种序列中都存在,以产生匹配位置的数目)、用比较窗口中的位置总数目除以该匹配位置数目、并且将该结果乘以100以产生序列一致性百分比。
如此,在该组合物中,木聚糖酶可以作为一种部分或完全纯化的全长酶、或作为其活性变体或片段来提供,或甚至可以作为一种产酶微生物、植物、植物部分或植物宿主细胞来提供。在任何情况下都不要求完全纯化。该酶、变体或片段因此可以是至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%纯,或更纯。
纯化多肽与蛋白(例如酶类)的方法在本领域是熟知的。参见,例如,Cesar(恺撒)&
Figure BDA00002900703500131
(1996),《酶与微生物技术》(Enzyme Microb.Tech.)19:289-296;Chivero(切沃罗)等人(2001),《食品化学》(Food Chem.)72:179-185;de AlbuquerqueLucena-Neto等人(2004),《英国微生物杂志》(Br.J.Microb.)35:86-90;Ehle(艾尔)&Horn(霍恩)(1990),《生物分离》(Bioseparation)1:97-110;Gupta(格普塔)等人(2002),《生物技术通讯》(Biotechnol.Lett.)24:2005-2009;Hengen(亨根)(1995),《生物化学科学趋势》(Trends Biochem Sci.)20:285-286;Kanda(神田)等人(1985),《生物化学杂志》(J.Biochem.)98:1545-1554;Khasin(哈辛)等人(1993),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microb.)59:1725-1730;Kudo(工藤)等人(1985),《普通微生物学杂志》(J.Gen.Microbiol.)131:2825-2830;Regnier(雷古纳)(1983),《科学》(Science)222:245-252;Roy(罗伊)&Uddin(乌丁)(2004),《巴基斯坦生物科学杂志》(Pak.J.Biol.Sci.)7:372-379;Royer(罗耶)&Nakas(纳卡斯)(1991),《欧洲生物化学杂志》(Eu.J.Biochem.)202:521-529;Sá-Pereira等人(2003),《分子生物技术》(Mol.Biotechnol.)24:257-281;Shaw(萧),《分子生物学方法》第32卷中的通过反相HPLC(高效液相色谱法)的肽纯化("Peptide purification by reverse-phaseHPLC"257-287In:Methods in Molecular Biology,Vol.32)(Walker(沃克)编辑,Humana出版社,1994)(Walker ed.,Humana Press1994);Simpson(辛普森)等人(1991),《生物化学杂志》(Biochem.J.)277:419-417;《化学技术百科全书》第52版(Encyclopedia of Chemical Technology,52nd ed.)(Kirk(科克)-Othmer(奥斯默)编辑,威利交互科学,2007)(Kirk-Othmer ed.,Wiley-Interscience2007);蛋白纯化与分析基本方法:实验室手册(Basic Methods in Protein Purification andAnalysis:A Laboratory Manual)(Simpson(辛普森)等人编辑,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2008);《酶纯化与相关技术》(EnzymePurification and Related Techniques)。《酶学方法》第22卷(Methods in Enzymology,Vol.22)(Jakoby(雅各布)编辑,学术出版公司(Academic Press Inc.)1971)《酶学方法:亲和技术-酶纯化:B部分:第34卷:亲和技术B部分》(Methods inEnzymology:Affinity Techniques–Enzyme Purification:Part B:Vol.34:AffinityTechniques Part B)(Kaplan(卡普兰)等人编辑,爱思唯尔出版公司(Elsevier)1974);以及美国专利申请号2009/0137022与2009/0239262;以及美国专利申请号4,347,322;4,634,673;4,725,544与5,437,992。适合酶类的纯化技术的实例包括但不局限于,沉淀,例如硫酸铵沉淀;基于分子大小的分离,例如凝胶过滤;基于电荷的分离,例如离子交换层析;基于与其他生物分子特定相互作用的分离,例如生物亲和层析或氨基酸序列的抗体识别;基于其他原理的分离,例如疏水相互作用层析或羟磷灰石层析。
无论这些组合物包括一种全长木聚糖酶,或其一个活性变体或片段,它们可以包括每克要处理的木质纤维素材料约0.01单位至约1000单位、约0.1单位至约500单位、或约1单位至约50单位的酶活性。可替代地,这些组合物可以包括每克要处理的木质纤维素材料约1单位至约10单位、约10单位至约100单位、约100单位至约200单位、约200单位至约300单位、约300单位至约400单位、约400单位至约500单位、约500单位至约600单位、约600单位至约700单位、约700单位至约800单位、约800单位至约900单位、约900大内至约1000单位、或更多的酶活性。一单位可以定义为在一个测定温度下每分钟释放1μmol木糖所要求的酶量。如果使用一个用于确定木聚糖酶活性的还原糖测定,一单位可以定义为在一个测定温度下每分钟(minut)释放1微摩尔木糖等效物所要求的酶量。
这些组合物可以仅包括该木聚糖酶、其变体或片段,或可以是一种混合物(即,“鸡尾酒”("cocktail")),该混合物具有该木聚糖酶、其变体或片段以及至少一种或多种其他酶,这些其他酶包括其他的在加工木质纤维素材料中有用的木质纤维素酶类,例如其他的纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶以及蛋白酶。如在此使用的,“木质纤维素酶”是指一种酶,该酶加工木质纤维素材料,例如纤维素、半纤维素与木素,以及其他多糖和蛋白组分,它们可以是木质纤维素的一部分或与木质纤维素有关。
纤维素酶的实例包括但不局限于,甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、1,3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-β-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。
半纤维素酶的实例包括但不局限于,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、内切-半乳聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶、外切-β-1,4-甘露糖苷酶、外切-β-1,4-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、对位-熏草酸酯酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶和木葡聚糖内糖基转移酶。
木质酶的实例包括但不局限于,二芳基丙烷过氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、木素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化酶、甲醇氧化酶、甲醇氧化还原酶、苯酚氧化酶(虫漆酶)、苯酚过氧化酶和藜芦基醇氧化酶。
果胶酶的实例包括但不局限于,果胶降解酶、pectozyme酶和多聚半乳糖醛酸酶。
蛋白酶的实例包括但不局限于,萝蘼蛋白酶、菠萝酶、caricain酶、木瓜凝乳蛋白酶、胶原酶、甘氨酰肽链内切酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
这些组合物还可以包括其他酶类,例如淀粉酶、过氧化氢酶、角质酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶、支链淀粉酶和木糖异构酶。
如以上,这些酶中的任一种都可以作为部分或完全纯化的全长酶、或其活性变体或片段来提供,或者可以作为一种产酶微生物来提供。此外,可以按有效水解它们的底物的一个量来提供这些酶中的任何一种,这些量例如从约0.001wt.%至约50wt.%、从约0.01wt.%至约50wt.%、从约0.1wt.%至约50wt.%、从约1wt.%至约50wt.%、从约10wt.%至约50wt.%、从约20wt.%至约50wt.%、从约30wt.%至约50wt.%、从约40wt.%至约50wt.%、或更多。
这些组合物还可以包括在加工木质纤维素材料中典型地使用的试剂,例如一种氯、洗涤剂、次氯酸盐、过氧化氢、草酸、过酸、pH-调节试剂、磷酸三钠、亚氯酸钠、硝酸钠、表面活性剂、脲和水。
洗涤剂的实例包括但不局限于,阴离子、阳离子或中性洗涤剂,例如诺纳(Nonidet)(N)P-40、十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基硫酸钠(SLS)、磺基甜菜碱、正-辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、
Figure BDA00002900703500161
(道化学公司(Dow Chemical Co.);米德兰,密歇根州(Midland,MI))以及
Figure BDA00002900703500162
20(ICI美国有限公司(ICI Americas,Inc.));布里奇沃特,新泽西州(Bridgewater,NJ))。
过酸的实例包括但不局限于,间氯过氧苯甲酸、过苯甲酸、高氯酸、邻羧基过苯甲酸、过马来酸、过乙酸、过甲酸、过氧丙酸(perproprionic acid)和对硝基过苯甲酸。
表面活性剂的实例包括但并不局限于,一种仲醇乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、脂肪醇的磷酸酯、聚氧乙烯醚、聚乙二醇、聚氧乙烯化的烷基酚以及硬脂酸以及十三烷基乙氧基化物。
这些试剂中的任一种都可以做为部分或完全纯化的来提供。此外,可以按从约0.001wt.%至约50wt.%、从约0.01wt.%至约50wt.%、从约0.1wt.%至约50wt.%、从约1wt.%至约50wt.%、从约10wt.%至约50wt.%、从约20wt.%至约50wt.%、从约30wt.%至约50wt.%、从约40wt.%至约50wt.%、或更多的量提供这些试剂中的任一种。
这些组合物还可以包括微生物,尤其是产乙醇的和/或木素增溶的微生物,例如细菌或酵母。总体参见,Burchhardt(布哈特)&Ingram(英格拉姆)(1992),《应用与环境微生物学》58:1128-1133;Dien(迪恩)等人(1998),《酶与微生物技术》23:366-371;Keating(基廷)等人(2004),《酶与微生物技术》35:242-253;Lawford(劳福德)&Rousseau(卢梭)(1997),《应用生物化学与生物技术》63-65:221-241;《生物技术手册:生产与利用》(Wyman(怀曼)编辑,CRC出版社1996);连同美国专利申请号2009/0246841与2009/0286293;以及美国专利申请号6,333,181。此类微生物可以表达在加工木质纤维素材料中辅助的酶类,例如醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转醛醇酶、转酮醇酶丙酮酸脱羧酶(transketolasepyruvate decarboxylase)、木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或木糖异构酶木酮糖激酶。此类微生物的实例包括但并不局限于,以下属中的成员,例如假丝酵母属、欧文菌属、埃希氏菌属、克雷白氏菌属、毕赤酵母属、酵母菌属、链霉菌属和发酵单胞菌属。参见,例如,Dien(迪恩)(1998),如以上;Ingram(英格拉姆)&Conway(康威)((1988),《应用与环境微生物学》54:397-404;Jarboe(扎博)等人(2007),《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:237-261;Keating(基廷)等人(2004),《工业微生物生物技术杂志》(J.Indust.Microbiol.Biotech.)31:235-244;Keating(基廷)等人(2006),《生物技术与生物工程学》(Biotechnol.Bioeng.)93:1196-1206;Pasti(帕斯提)等人(1990),《应用与环境微生物学》56:2213-2218;以及Zhang(张)等人(1995),《科学》(Science)267:240-243。
具有该酶、其变体或片段,连同以上描述的任何其他酶类和/或试剂的组合物可以制备为液体、膏剂、固体或凝胶。
转基因生物
本发明的组合物包括用编码至少一种木聚糖酶、或其具有木聚糖酶活性的变体或片段的核酸构建体转化的植物、植物部分和植物宿主细胞。如在此使用,“植物部分”是指非木本和木本植物细胞、植物原生质体、植物可以由之再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物簇(plant clumps)、以及在植物或以下植物的部分中完整的植物细胞,这些植物的部分例如是胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药、块茎、根茎、以及类似物。转化的植物旨在用于生产纤维素乙醇。本发明的转基因植物将用作在木质纤维素转化过程中木聚糖酶活性的来源。可以结合含有其他酶的其他转基因植物(例如AMY797E,一种表达热稳定α-淀粉酶的转基因植物)使用本发明的转基因植物。
植物的实例包括但并不局限于,大麦、豆类(beans in general)、芸薹属、三叶苜蓿、可可、咖啡、棉花、亚麻、玉米、粟、花生、油菜/卡罗拉(canola)、稻、黑麦、红花、高粱、大豆、甘蔗、甜菜、向日葵、甘薯、茶以及小麦;蔬菜类例如西兰花、甘蓝小包菜、甘蓝、胡萝卜、木薯、花椰菜、葫芦科植物、滨豆、莴苣、豌豆、胡椒、马铃薯、萝卜以及番茄;草类例如紫花苜蓿、百慕达草、象草、盖氏虎尾草、高羊茅草、高小麦草、芒属以及柳枝稷;果树类例如苹果、杏、鳄梨、香蕉、柑橘、椰子、梨、桃、菠萝以及核桃;以及花卉例如康乃馨、兰花和玫瑰。
为了防止与植物中的木聚糖酶表达相关的负表型,认识到将需要小心地控制植物中木聚糖酶的表达、活化、或定位。如在此进一步讨论,控制负表型的一种方法是在植物中隔绝表达的木聚糖酶。特别是,信号序列或靶向序列可以用于将该酶靶向至细胞器,例如液泡、内质网、叶绿体、以及类似物。以这种方式,将一种信号序列或靶向序列可操作地连接至该木聚糖酶上。因此,用于在植物中表达该酶的一种DNA构建体或表达盒将包括一种可操作地连接至该木聚糖酶的编码序列的信号序列。此类靶向序列会将该木聚糖酶靶向至液泡、内质网、叶绿体、以及类似物。
此类序列的实例包括但不局限于,针对酰基载体蛋白的转运肽、二磷酸核酮糖羧化酶(RUBISCO)的小亚基、植物EPSP合酶、以及类似物。参见例如Archer(阿彻)等人(1990)《生物能与生物膜杂志》(J.Bioenerg.Biomemb.)22:789-810),Clark(克拉克)等人(1989)《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)264:17544-17550;Daniell(丹尼尔)(1999)《自然生物技术》(Nat.Biotech.)17:855-856;de CastroSilva Filho等人(1996)《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)30:769-780;Della(黛拉)-Cioppa(塞奥帕)等人(1987)《植物生理学》(Plant Physiol.)84:965-968;Lamppa(兰帕)等人(1988)《生物化学杂志》263:14996-14999;Lawrence(劳伦斯)等人(1997)《生物化学杂志》272:20357-20363;Romer(罗默)等人(1993)《生物化学与生物物理研究通讯》196:1414-1421;Schmidt(施密特)等人(1993)《生物化学杂志》268:27447-27457;Schnell(施耐尔)等人(1991)《生物化学杂志》266:3335-3342);Shah et al.(1986)《科学》233:478-481;Von Heijne(冯海耶)等人(1991)《植物分子生物学报导》(Plant Mol.Biol.Rep.)9:104-126;以及Zhao(赵)等人(1995)《生物化学杂志》270:6081-6087;连同美国专利号6,338,168。
内质网信号肽包括描述于Raikhel(莱克尔)&Chrispeels(克里斯皮尔斯)《植物生物化学与分子生物学》中的“蛋白分选与囊泡运输“("Protein sorting and vesicletraffic"In:Biochemistry and Molecular Biology of Plants)(Buchanan(布坎南)等人编辑,美国植物生理学家学会(American Society of Plant Physiologists)2000)中的那些。参见,例如,Denecke等人(1992),《EMBO杂志》(EMBO J.)11:2345-2355;Denecke(丹耐克)等人(1993),《实验植物学杂志》(J.Exp.Bot.)44:213-221;Gomord(谷莫德)等人(1996),《植物生理学与生物化学》(Plant Physiol.Biochem.)34:165-181;Lehmann(莱曼)等人(2001),《植物生理学》127:436-449;Munro(芒罗)&Pelham(佩勒姆)(1986),《细胞》(cell)46:291-300;Munro(芒罗)&Pelham(佩勒姆)(1987),《细胞》48:899-907;Vitale(维塔尔)等人(1993),《实验植物学杂志》44:1417-1444;以及Wandelt(万德尔特)等人(1992),《植物杂志》(Plant J.)2:181-192。
在一些情况下,令人希望的是将该木聚糖酶定位于液泡内。为了木聚糖酶的液泡靶向表达,将植物用载体进行转化,这些载体包括一种液泡靶向序列,例如来自烟草甲壳酶基因的靶向序列。液泡分选信号序列包括大麦多胺氧化酶2(BPAO2)信号序列(Cervelli(瑟维里)等人(2004)《植物杂志》(The Plant Journal)40:410-418)。对于其他的液泡分选信号,参见例如美国专利申请号12/359,421以及Raikhel(莱克尔)&Chrispeels(克里斯皮尔斯)(2000),如以上。
质体靶向序列在本领域是熟知的并且可以用于本发明的惯例中。参见,例如,Clark(克拉克)等人(1989),《生物化学杂志》264:17544-17550;Della(黛拉)-Cioppa(塞奥帕)等人(1987),如以上;Romer(罗默)等人(1993),《生物化学与生物物理学研究通讯》196:1414-1421;Shah(沙阿)等人(1986),《科学》233:478-481;以及Von Heijne(冯海耶)等人(1991),《植物分子生物学报导》9:104-126。其他的靶向叶绿体序列包括核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996),《植物分子生物学》30:769-780;以及Schnell(施耐尔)等人(1991),《生物化学杂志》266:3335-3342);5-(烯醇丙酮)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer(阿彻等人(1990),如以上);色氨酸合酶(Zhao(赵)等人(1995),如以上);质体蓝素(Lawrence(劳伦斯)等人(1997),如以上);分支酸合酶(Schmidt(施密特)等人(1993),如以上);以及集光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa(兰帕)等人(1988),如以上)。本领域一个技术人员还可以设想产生在其中该叶绿体已经得以转化的转基因植物,以过表达该木聚糖酶。参见,例如,Daniell(丹尼尔)(1999),《自然生物技术》17:855-856;连同美国专利号6,338,168。
用于转化叶绿体的方法在本领域是熟知的。参见,例如Svab(斯瓦博)等人(1990),《美国科学院院刊》87:8526-8530;Svab(斯瓦博)&Maliga(马利加)(1993),《美国科学院院刊》90:913-917;Svab(斯瓦博)&Maliga(马利加)(1993),《EMBO杂志》12:601-606。同样地,可以针对在该叶绿体中的表达将有待靶向至该叶绿体的核苷酸序列进行最优化,以考虑植物细胞核与这种细胞器之间在密码子使用上的不同。以这种方式,可以使用叶绿体偏好密码子合成感兴趣的多核苷酸。参见,例如,美国专利号5,380,831。
为了该木聚糖酶定位于该质外体内,可以使用一种质外体靶向序列,例如一种玉米γ-玉米素N端信号序列(美国专利号7,102,057)。
额外的有关靶向多肽的指导可以发现于,例如Bruce(布鲁斯)((2001),Biochim Biophys Acta1541:2-21;Emanuelsson(埃曼纽尔森)等人(2000),《分子生物学杂志》300:1005-1016;Emanuelsson(埃曼纽尔森)&von Heijne(冯海耶)(2001),Biochim Biophys Acta1541:114-119;Hadlington(哈丁顿)&Denecke(丹耐克)(2000),《植物生物学现行观点》(Curr.Opin.Plant Biol.)3:461-468;Nicchitta(尼基塔)(2002),《植物生物学现行观点》14:412-416;以及Silva-Filho(2003),《植物生物学现行观点》6:589-595。
简言之,在植物部分(例如植物宿主细胞)中表达一种核苷酸序列的方法包括,用例如一种核酸构建体转化植物宿主细胞,该构建体是例如一种表达盒,该表达盒具有针对一种木聚糖酶、其变体或片段的可操作地连接至一种或多种调节序列上的编码序列。用于一些实施例的木聚糖酶编码序列包括SEQ ID号:5、7或9中列出的核苷酸序列,或其片段或变体,或SEQ ID号:6、8或10中列出的多肽序列或其片段或变体。转化的植物宿主细胞是在该核苷酸序列得以在该植物宿主细胞中表达的条件下生长的。在一些情况下,这些方法包括一种额外的步骤,该步骤是将该经转化的植物宿主细胞再生成为一种形态学上正常的可育植物。
如在此使用,“表达盒”是指一种核酸分子,该核酸分子具有至少一种可操作地连接至感兴趣(例如木聚糖酶)的编码序列上的控制序列。以这种方式,可操作地与针对该木聚糖酶的核苷酸序列相互作用的植物启动子在表达盒中提供,用于在一种植物、植物部分或植物宿主细胞中表达。
表达该木聚糖酶的一种植物、植物部分或植物宿主细胞因此可以通过将针对一种木聚糖酶的编码序列引入该植物、植物部分或植物宿主细胞来获得。优选地,该编码序列可以存在于一个表达盒中或另一核酸构建体(例如载体)中。
感兴趣的编码序列在表达盒中的表达可以是在一个组成型启动子或一个诱导型启动子的控制下,只有当该宿主细胞暴露于一些具体外部刺激时,该启动子才引发转录。可替代地,该表达盒可以处在一种组织特异性启动子的控制下,该启动子在具体的组织、器官、或者甚至在具体的发育阶段起作用。
为了本发明的目的,对于宿主细胞或对于彼此,调节区(即启动子、转录调节区、以及转录终止区)可以是天然的/同功的。可替代地,对于宿主细胞或对于彼此,调节区可以是异源的。如在此使用,提及一种序列的“异源的”意为一种序列,该序列源自一种外来物种,或者如果源自相同物种,则是通过有意的人工介入对其天然形式在构成和/或基因座方面进行了实质性的修改。例如,可操作地连接至一种异源多核苷酸上的启动子是来自一种物种,该物种与该多核苷酸从其衍生而来的物种不同,或者,如果来自相同/类似物种,则一者或两者在其原始形式和/或基因座方面进行了修改,或者该启动子对于该可操作地连接的多核苷酸而言不是天然的启动子。
有待使用的启动子的选择取决于几个因素,包括但不局限于:细胞-或组织-特异性表达、所希望的表达水平、效率、可诱导性以及可选择性。例如,当希望在特定组织或器官中表达时,可以使用组织特异性启动子。相反,当希望响应刺激表达时,可以使用可诱导性启动子。当希望遍布植物的细胞中连续表达时,可以使用组成型启动子。对于本领域一个技术人员而言,通过相对于一种核苷酸序列来适当地选择并且定位启动子以及其他的调节区而调整该核苷酸序列的表达是一种惯例。
因此,在一些情况下,可以使用组成型启动子。组成型启动子的实例包括但不局限于,水稻肌动蛋白1启动子(Wang(王)等人(1992),《分子和细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)12:3399-3406;以及美国专利号5,641,876)、CaMV35S启动子(Odell(奥德尔)等人(1985),《自然》(Nature)313:810-812)、CaMV19S启动子(Lawton(劳顿)等人(1987),《植物分子生物学》9:315-324)、nos启动子(Ebert(埃伯特)等人(1987),《美国科学院院刊》84:5745-5749)、Adh启动子(Walker(沃克)等人(1987),《美国科学院院刊》84:6624-6629)、蔗糖合酶启动子(Yang(杨)&Russell(拉塞尔)(1990),《美国科学院院刊》87:4144-4148)、以及泛素启动子。
此外,在植物中已经报道了几个组织特异性调节基因和/或启动子。一些报道的组织特异性基因包括对种子贮藏蛋白(例如β-伴大豆球蛋白、十字花科蛋白、油菜籽蛋白和菜豆素),玉米素或油体蛋白(例如oleosin),或脂肪酸生物合成中涉及的蛋白(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad2-1)),以及在胚发育中表达的其他基因(例如Bce4,参见例如Kridl(克里德)等人(1991)《种子科学研究》(Seed Sci.Res.)1:209-219;连同欧洲专利号255378)。组织特异性启动子的额外实例包括但不局限于,凝集素启动子(Lindstrom(林斯特龙)等人(1990),Der.Genet.11:160-167;以及Vodkin(沃德金)(1983),《临床生物学研究进展》(Prog.Clin.Biol.Res.)138:87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(Dennis(丹尼斯)等人(1984),《核酸研究》12:3983-4000)、玉米集光复合体启动子(Bansal(班赛尔)等人(1992),《美国科学院院刊》89:3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(O'Dell(欧德尔)等人(1985),《EMBO杂志》5:451-458;以及Rochester(罗彻斯特)等人(1986),《EMBO杂志》5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore(卡什莫尔),《植物遗传工程》29-39中的编码核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶小亚基的核基因("Nuclear genes encoding the small subunit ofribulose-l,5-bisphosphate carboxylase"29-39In:Genetic Engineering of Plants)(Hollaender(霍兰德尔)编辑,普力纳姆出版社(Plenum Press)1983);以及Poulsen(波尔森)等人(1986),《分子和普通遗传学》(Mol.Gen.Genet.)205:193-200)、Ti质粒甘露氨酸合酶启动子(Langridge(兰格里奇)等人(1989),《美国科学院院刊》86:3219-3223)、Ti质粒胭脂氨酸合酶启动子(Langridge(兰格里奇)等人(1989),如以上)、矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van Tunen(范杜能)等人(1988),《EMBO杂志》7:1257-1263)、大豆甘氨酸富含蛋白1启动子(Keller(凯勒)等人(1989),《基因与发育》(Genes Dev.)3:1639-1646)、截短的CaMV35S启动子(O'Dell(欧德尔)等人(1985),《自然》313:810-812)、马铃薯块茎储藏蛋白启动子(Wenzler(温茨勒)等人(1989),《植物分子生物学》13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto(山本)等人(1990),《核酸研究》18:7449)、玉米玉米素启动子(Kriz(柯立兹)等人(1987),《分子和普通遗传学》207:90-98;Langridge(兰格里奇)等人(1983),《细胞》34:1015-1022;Reina(雷纳)等人(1990),《核酸研究》18:6425;Reina(雷纳)等人(1990),《核酸研究》18:7449;以及Wandelt(万德尔特)等人(1989),《核酸研究》17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger(贝朗格)等人(1991),《遗传学》(Genetics)129:863-872)、α-微管素cab启动子(Sullivan(苏利文)等人(1989)《分子和普通遗传学》215:431-440),PEPCase启动子(Hudspeth(哈得斯佩斯)&Grula(格鲁拉)(1989)、《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)12:579-589),R基因复合体相关启动子(Chandler(钱德勒)等人(1989)《植物细胞》(Plant Cell)1:1175-1183),以及查耳酮合酶启动子(Franken(弗兰肯)等人(1991)《EMBO杂志》10:2605-2612)。对于种子特异性表达特别有用的是豌豆球蛋白启动子(Czako(查克)等人(1992),《分子和普通遗传学》235:33-40;以及美国专利号5,625,136)。用于在成熟的叶子中表达的其他有用的启动子是在衰老的开始时打开的那些启动子,例如来自拟南芥的SAG启动子(Gan(甘)等人,(1995)《科学》(Science)270:1986-1988)。
在一些情况下,可以使用可诱导型启动子。可诱导型启动子的实例包括但不局限于,四环素阻抑物系统启动子、Lac抑制物系统启动子、可诱导的铜系统启动子、可诱导的水杨酸盐系统启动子(例如PR1a系统)、可诱导的糖皮质激素系统启动子(Aoyama(青山)T.等人(1997),《植物杂志》11:605-612)和可诱导的蜕皮激素系统启动子。其他可诱导型的启动子包括可诱导的ABA启动子和可诱导的膨胀启动子、生长素结合蛋白基因的启动子(Schwob(施沃布)等人(1993),《植物杂志》4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因启动子(Ralston(罗尔斯顿)等人(1988),《遗传学》(Genetics)119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero(科尔德罗)等人(1994),《植物杂志》6:141-150)、以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler(科勒)等人(1995),《植物分子生物学》29:1293-1298;Martinez(马丁内斯)等人(1989),《分子生物学杂志》208:551-565;以及Quigley(奎格利)等人(1989),《分子进化学杂志》(J.Mol.Evol.)29:412-421)。还包括苯磺酰胺可诱导的系统(美国专利号5,364,780)以及醇可诱导的系统(国际专利申请公开号WO97/06269和WO97/06268)以及谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地,可以使用描述于以下文献之中的任何可诱导型启动子:Gatz(盖兹)(1996),《生物技术现行观点》(Current Opinion Biotechnol.)7:168-172以及Gatz(盖兹)(1997),《植物生理学与植物分子生物学年度综述》(Annu.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.)48:89-108。
除了以上所描述的启动子,该表达盒还可以包括其他调节序列。如在此使用的,“调节序列”意为位于一种编码序列的上游(5'非编码序列)、内部、或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列,并且这些核苷酸序列影响了相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节顺序包括但不局限于,增强子、内含子、翻译前导序列以及多腺苷酸化信号序列。
该表达盒还可以包括在植物中起作用的一种转录和/或翻译终止区(即,终止区)。对于在表达盒中使用而言,多种转录终止子是可利用的并且负责在超出该转基因时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区可以是与该转录引发区天然在一起的、可以是与感兴趣的可操作地连接的核苷酸序列天然在一起的、可以是与该宿主植物天然在一起的、或者可以是源自另一种来源(即,对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该宿主植物、或它们的任何组合是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不局限于,CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子以及豌豆rbcS E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外,可以使用一种编码序列的天然转录终止子。
如以上讨论,为了防止与植物中木聚糖酶相关的负表型,可以将信号序列可操作地连接到该酶,用来将该酶导入细胞区室。以这种方式,该表达盒将包括一种针对该木聚糖酶的编码序列,该序列可操作地连接至该信号序列的核酸序列上。该信号序列可以是可操作地连接在该酶的N-或C-末端上。
不考虑一种或多种调节序列的类型,可以将它们可操作地连接至该木聚糖酶的编码序列上。如在此使用的,“可操作地连接”是指,对一种核酸构建体(例如一种表达盒)的元件进行配置以执行它们的常规功能。因此,可操作地连接至一种编码序列上的控制序列(即,启动子)能够影响该编码序列的表达。这些控制序列不需要与该编码序列邻接,只要它们起功能指导其表达。因此,例如,介入未翻译的,已转录的,序列可以在一种启动子与一种编码序列之间存在,并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接”至该编码序列。
该表达盒还可以包括一种用于可选择性标记的核苷酸序列,它可以用于选择转化的植物宿主细胞。如在此使用,“可选择性标记”是指赋予表达该标记的宿主细胞独特表型的一个分子,并且因此允许这样转化的宿主细胞与不具有该标记的细胞区别开。这样的核苷酸序列可以编码一种可选择的亦或可筛选的标记,这取决于该标记是否给予一种可以通过化学方法而被选择的性状,例如通过使用一种选择性试剂(例如,一种抗生素、除草剂、或类似物),或者取决于该标记是否仅仅是一种可以通过观察或测试而鉴别的性状,例如通过筛选(例如,R基因性状)。当然,适合的可选择性标记的许多实例在本领域中是已知的并且可以用于在此描述的这些表达盒中。
可选择性标记的实例包括但不局限于,一个neo或nptII基因,它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性(Potrykus(珀特里库斯)等人(1985),《分子和普通遗传学》199:183-188);一个bar基因,它赋予对草丁膦的抗性;一个改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)基因,它赋予对草甘膦的抗性(Hinchee(亨基)等人(1988),《生物技术》(Biotech.)6:915-922);一种腈水解酶基因(例如来自臭鼻克雷白氏杆菌的bxn),它赋予对溴草腈的抗性(Stalker(斯托克)等人(1988),《科学》242:419-423);一种改变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因,它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204);一种甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet(赛利特)等人(1988),《生物化学杂志》263:12500-12508);一种茅草枯脱卤素酶基因,它赋予对茅草枯的抗性;一种甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))基因,它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378与5,994,629);一种改变的邻氨基苯甲酸盐合酶基因,它赋予对5-甲基色氨酸的抗性;或一种hph基因,它赋予对潮霉素的抗性。本领域一个普通技术人员能够选择一种适合用于表达盒的可选择性标记。
额外的可选择性标记包括但不局限于,编码一种酶的一个β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS),它的不同显色底物是已知的;编码一种产物的一个R-基因座基因,它调节植物组织中的花色苷色素(红色)生产(Dellaporta(德拉普塔)等人,“通过用Ac转座子标记的玉米R-nj的等位基因的分子克隆(Molecular cloning of themaize R-nj allele by transposon-tagging with Ac)”263-282在《染色体结构和功能:新概念的影响(Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts)》中,第18届斯塔德勒遗传学研讨会(18th Stadler Genetics Symposium)(Gustafson(古斯塔夫森)&Appels(阿佩尔斯)编辑,Plenum Press出版社1988));编码一种酶的一个β-内酰胺酶基因,它的不同显色底物是已知的(例如PADAC,一种显色头孢菌素)(Sutcliffe(苏利夫)(1978)《美国科学院院刊》75:3737-3741);编码一种儿茶酚加双氧酶的一个xylE基因(Zukowsky(祖科斯基)等人(1983)《美国科学院院刊》80:1101-1105);编码一种酶(该酶能够将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌)的一个酪氨酸酶基因,多巴醌转而缩合以形成黑色素(Katz(卡茨)等人(1983)《普通微生物学杂志》129:2703-2714);编码一种酶的一个β-半乳糖苷酶基因,对于它存在显色底物;允许生物发光检测的一个荧光素酶(lux)基因(Ow(欧)等人(1986)《科学》234:856-859);可以用于钙敏感生物发光检测的一个水母素基因(Prasher(普鲁切)等人(1985)《生物化学与生物物理研究通讯》126:1259-1268);或一种绿色荧光蛋白基因(Niedz(涅茨)等人(1995)《植物细胞报告》(Plant Cell Reports)14:403-406)。
该表达盒还可以包括针对其他木质纤维素酶的编码序列。此类序列可以与任何的核苷酸序列组合叠加,以创造出具有所希望表型的植物、植物部分或植物宿主细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生,这些方法包括但不局限于,通过任何常规的方法学或通过遗传转化的杂交育种植物。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的,所感兴趣的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如,包括一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转化而引入另外的性状的靶标。这些核苷酸序列可以在一种共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的针对该木聚糖酶的编码序列同时引入。例如,如果将引入两段核苷酸序列,则它们可以包含在分开的盒(反式)中或包含在相同的盒(顺式)中。这些核苷酸序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进一步认识到的是,核苷酸序列可以在一个所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行叠加。参见,例如,国际专利申请公开号WO99/25821;WO99/25854;WO99/25840;WO99/25855以及WO99/25853。
该表达盒还可以包括有关农学性状的一种或多种多肽的编码序列,这些主要地是对种子公司、种植者、或谷粒处理机有益的,例如细菌性病原体抗性、真菌抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、线虫抗性以及病毒抗性。参见,例如,美国专利号5,304,730;5,495,071;5,569,823;6,329,504以及6,337,431。该性状还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的性状、或是允许对展现感兴趣性状的植物鉴定的性状(例如,可选择性标记基因、种皮颜色等)。不同的感兴趣的性状,连同用于引这些性状进入植物的方法描述于例如,美国专利号4,761,373;4,769,061;4,810,648;4,940,835;4,975,374;5,013,659;5,162,602;5,276,268;5,304,730;5,495,071;5,554,798;5,561,236;5,569,823;5,767,366;5,879,903,5,928,937;6,084,155;6,329,504与6,337,431;以及美国专利申请公开号2001/0016956。还参见,万维网(World WideWeb)上的lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/。
众多核苷酸序列已知于增强来自转录单位之内的基因表达,并且这些序列可以与针对该木聚糖酶的编码序列结合使用以增加其在转基因植物中的表达。例如,已经显示玉米Adhl基因的内含子与内含子1增强了基因表达。参见,例如,Callis(卡利斯)等人(1987),《基因与发育》(Genes Develop.)1:1183-1200。
同样地,还已知一些从病毒得到的未翻译的前导序列增强了基因表达。确切地,已经显示来自烟草花叶病毒(TMV,“W-序列”)、玉米枯黄斑点病毒(MCMV)以及苜蓿花叶病病毒(AMV)的前导序列有效增强了表达(Gallie(加利)等人(1987)《核酸研究》15:8693-8711;以及Skuzeski(斯库泽斯基)等人(1990)《植物分子生物学》15:65-79)。本领域已知的其他前导序列类包括但不局限于:小RNA病毒病毒前导序列(leader),例如脑心肌炎(EMCV)5'非编码区前导序列(Elroy(埃尔罗伊)-Stein(斯坦因)等人(1989),《美国科学院院刊》86:6126-6130;马铃薯Y病毒属前导序列,例如烟草蚀纹病毒(TEV)前导序列(Allison(艾利森)等人(1986),《病毒学》(Virology)154:9-20);玉米矮花叶病毒(MDMV)前导序列;(Allison(艾利森)等人(1986),如以上);人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列,(Macejak(麦切扎克)&Samow(萨摩)(1991),《自然》353:90-94);来自苜蓿花叶病毒(AMV)的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4;Jobling(乔布灵)&Gehrke(格尔克)(1987),《自然》325:622-625);烟草花叶病毒(TMV)前导序列,(Gallie(加利)等人(1989),《RNA分子生物学》(Molecular Biology of RNA)237-256);以及MCMV前导序列(Lommel(洛梅尔)等人(1991),《病毒学》81:382-385)。参见Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.《植物生理学》84:965-968。
一旦针对该木聚糖酶的编码序列被克隆进入该表达盒中,它可以被转化进入一种植物、植物部分或植物宿主细胞中。如在此使用,“植物”是指任何植物,具体地指种子植物,并且“植物宿主细胞”是该植物的一个结构单元和生理单元,该单元包括一个细胞壁并且还可以指一个原生质体。植物宿主细胞可以处于一种分离的单细胞形式,或者可以是一种培养细胞,或者可以是作为较高级的组织单位(例如,一种植物组织或一种植物器官)的一部分。如在此使用,“转化”指将一个核酸分子或片段转到一个宿主细胞的基因组中,从而导致基因上稳定遗传。包含该转化的核酸分子或片段的宿主细胞称为“转基因”细胞,并且包含转基因细胞的生物称为“转基因生物”。
转化植物、植物部分、植物宿主细胞的方法的实例包括但不局限于,农杆菌介导的转化(De Blaere(德布莱热)等人(1987)《酶学方法》(Meth.Enzymol.)153:277-293),以及粒子轰击介导的转化(Klein(克莱因)等人(1987)《自然》(Nature)327:70-73;连同美国专利号4,945,050)。
因此能以本领域熟知的任何数目的方式将表达盒引入植物、植物部分或植物宿主细胞。如在此使用,在上下文中,核酸构建体(例如表达盒)的“引入”是指按它获得进入植物细胞内部的这样一种方式,将如在此披露的编码木聚糖酶的核酸序列呈递给植物、植物部分或植物宿主细胞。在有待引入一种以上的核苷酸序列的情况下,它们可以作为一种单一核酸构建体的部分、或者作为分开的核酸构建体而进行组装,并且可以位于相同的或不同的核酸构建体上。
因此,可以在单一的转化事件中、在分开的转化事件中,或例如作为育种方案的一部分在植物中,将这些核苷酸序列引入感兴趣的宿主细胞中。本发明的这些方法并不取决于用于将一种或多种核苷酸引入植物中的具体方法,仅仅取决于它们获得进入该植物至少一个细胞内部的途径。在本领域中已知的用于将核苷酸序列引入植物中的方法包括但不局限于瞬时转化方法、稳定转化方法、以及病毒介导的方法。
如在此使用,“瞬时转化”或“瞬时转化的”是指将核酸构建体(例如表达盒)引入植物中并且并不整合到植物的基因组中。
如在此使用,“稳定转化”或“稳定转化的”是指将核酸构建体(例如表达盒)引入植物,整合到植物的基因组中,并且能够通过它的子代,更具体地,通过多个连续代的子代而遗传。
除了表达盒,众多植物转化载体在对于本领域一个技术人员而言是熟知的,并且在此描述的这些核苷酸序列可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标物种。对于某些目标物种,如在本文中其他地方讨论的,不同的抗生素或除草剂选择标记可以是优选的。
例如,已经使用Ti质粒载体以及直接DNA摄入、脂质体、电穿孔、微注射、以及微弹来递送外源DNA。此外,可以使用来自农杆菌属的细菌转化植物细胞。以下是用于转化单子叶植物(单子叶)和双子叶植物(双子叶)的代表性方法以及代表性质体转化方法的说明。
对于使用根癌农杆菌的转化而言,很多载体是可获得的。这些载体典型地携带至少一个T-DNA边界序列并且包括例如pBIN19(Bevan(贝文)(1984),《核酸研究》12:8711-8721)的载体。美国专利申请公开号2006/0260011描述了用于构建在农杆菌介导的转化中有用的载体的方法。
不使用根癌农杆菌的转化避开了在选择转化载体中对于T-DNA序列的要求,并且因此还可以使用缺少这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括经由微注射、粒子轰击、以及原生质体摄入(例如PEG和电穿孔)的转化。如以上所指出,载体的选择很大程度上取决于对于被转化的物种的优先选择。
转化单子叶植物的方法在本领域是熟知的,并且使用PEG-或电穿孔介导的方法、连同粒子轰击直接将基因转移进入愈伤组织。可以用单一DNA种类或多种DNA种类(即,共转化)进行转化,并且这两种方法都适合在此使用。共转化可能具有避免完全型载体构建以及生成对于感兴趣的基因与选择标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点,使得能够在随后的世代中去除该选择标记(如果这被认为是所希望的话)。
欧洲专利申请号EP0292435与0392225连同国际专利申请公开号WO93/07278描述了用于从良种近交系玉米制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从转化的原生质体再生玉米植物的方法。参见,Fromm(弗洛姆)等人(1990),《生物/技术》(Bio/Technology)8:833-844;以及Gordon(戈登)-Kamm(卡姆)等人(1990),《植物细胞》2:603-618,它们描述了用于使用粒子轰击转化源于A188的玉米系的方法。此外,国际专利申请公开号WO93/07278和Koziel(科泽尔)等人(1993)《生物技术》(Biotechnology)11:194-200描述了用于通过粒子轰击转化良种近交系玉米的方法。这些方法使用从授粉之后14-15天的玉米穗切除的1.5mm-2.5mm长的未成熟玉米胚以及一台用于轰击的PDS-1000He Biolistics装置。在每一情况下,可以使用本领域熟知的方法将这些转化的细胞再生为完整的植物。
用于双子叶植物的转化方法在本领域也是熟知的,并且包括农杆菌介导的方法以及不要求农杆菌的方法。非农杆菌介导的方法涉及直接通过原生质体或细胞的外源基因材料的摄入。这种方法可以通过PEG或电穿孔介导的摄入、粒子轰击介导的递送、或微注射来实现。这些方法的实例描述于例如,由Klein(克莱因)等人(1987),《自然》327:70-73;Paszkowski(帕克沃斯基)等人(1984),《EMBO杂志》3:2717-2722;Potrykus(珀特里库斯)等人(1985),《分子和普通遗传学》199:169-177;以及Reich(里奇)等人(1986),《生物技术》(Biotechnology)4:1001-1004。在每一情况下,可以使用本领域熟知的方法将这些转化的细胞再生为完整的植物。
对于转化双子叶植物,农杆菌介导的转化是一种优选的方法,因为它的高转化效率以及它对于许多不同物种的广泛实用性。农杆菌介导的转化典型地涉及将携带感兴趣的外源DNA的二元载体转移至合适的农杆菌菌株,这可以依赖于由宿主农杆菌菌株携带的、或者在共同存在的Ti质体上的或染色体的vir基因的互补(Uknes(乌肯内斯)等人(1993),《植物细胞》5:159-169)。将该重组二元载体转移至农杆菌可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、一种辅助大肠杆菌的菌株(该辅助菌株携带一种质粒,该质粒能够将该重组二元载体移动到目标农杆菌菌株中)通过一种三亲本交配程序实现。可替代地,可以通过DNA转化将该重组二元载体转移到农杆菌中(
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Willmitzer(威廉米泽)(1988),《核酸研究》16:9877)。
通过重组体农杆菌转化目标植物物种通常涉及该农杆菌与来自该植物的外植体的共培养,并且遵循本领域熟知的方法。将转化的组织在存在于二元质粒T-DNA边界之间的携带有抗生素标记或除草剂抗性标记的可选择性培养基上再生。
另一种用于转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性的或生物学活性的粒子。参见,例如,美国专利号4,945,050;5,036,006以及5,100,792。总体上,这种方法涉及在有效穿透该细胞的外表面并提供掺入其内部中的条件下在细胞上推进惰性的或生物学活性的粒子。当利用惰性粒子时,可以通过用含有所希望的编码序列的载体包被这些粒子以将该载体引入细胞中。可替代地,该目标细胞可以被该载体围绕使得该载体通过该粒子的激发而被带入该细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如,干酵母细胞、干细菌或噬菌体,各自包含被试图引入的DNA)注入到植物细胞组织中。
经由用感兴趣的编码序列的转化获得的植物可以是各种各样的植物物种中的任何一种,包括单子叶植物和双子叶植物;然而,本发明的方法中所使用的植物优先选自以上列出的农学上重要的目标作物列表。感兴趣的核苷酸序列的表达组合其他的对于产量和品质重要的特征可以通过育种结合进入植物系中。育种的途径与方法在本领域是已知的。参见,例如,Welsh(威尔士),《植物遗传与育种基础》(Fundamentals of Plant Genetics and Breeding)(约翰威利父子公司(John Wiley&Sons1)1981);《作物育种》(Crop Breeding)(Wood(伍德)编辑,美国农学学会(American Society of Agronomy)1983);Mayo(梅奥),《植物育种理论第二版》(The Theory of Plant Breeding,2nd ed.)(克拉伦登出版社(Clarendon Press)1987);Singh(辛格),《针对疾病与虫害抗性的育种》(Breeding for Resistanceto Diseases and Insect Pests)(斯普林格出版社(Springer-Verlag)1986);以及Wricke(里克)&Weber(韦伯),《数量遗传学与选着性植物育种》(QuantitativeGenetics and Selection Plant Breeding)(Walter de Gruyter and Co.1986)。
通过本领域熟知的方法可以从转基因细胞再生整个植物。参见,例如,Fromm(弗洛姆)等人(1990),如以上;以及Gordon(戈登)-Kamm(卡姆)等人(1990),如以上。
同样地,工程化进入以上描述的转基因种子与植物中的遗传特性可以通过有性生殖或营养生长被传递,并且因此可以在子代植物中被维持和繁殖。总体而言,维持和繁殖利用了已知的农业方法,这些方法被开发为适合特定的目的(如收获、播种或耕作)。
这些木聚糖酶还可以通过育种或通过普通的基因工程技术结合进入或维持在植物系中。参见,同前。相关的方法包括但不局限于:非整倍体技术、回交育种、双单倍体近交、杂交、近交、种间杂交、多系育种、品种共混(variety blend)、等。杂交技术还包括植物的绝育以通过生物化学、化学、遗传(包括转基因)或机械方法产生雄性或雌性不育植物。
本发明的组合物还包括用编码木聚糖酶、其具有木聚糖酶活性的变体或片段的核酸构建体转化的非植物宿主细胞和生物。如在此使用,“宿主细胞”是指一种在其中该表达盒(包括一种包含该表达盒的载体)可以被繁殖与表达的细胞。宿主细胞还包括受试宿主细胞或其衍生物的任何子代。应理解,所有子代可以不与母细胞完全相同,因为在复制过程中可能会发生突变;然而,此种子代是包括在“宿主细胞”内。用于在此使用的宿主细胞的实例包括但不局限于,原核细胞,例如细菌细胞,以及真核细胞,例如真菌(例如,酵母细胞),昆虫(例如,果蝇细胞)以及哺乳动物细胞。
简而言之,在非植物宿主细胞或非植物生物中表达核苷酸序列的方法包括,用例如一种核酸构建体转化该宿主细胞或生物,该核酸构建体具有一种针对该木聚糖酶、或其变体或片段的可操作地连接至一种或多种调节序列上的编码序列。针对木聚糖酶的编码序列可以是SEQ ID号:5、7或9中列出的核苷酸序列,或其片段或变体,或编码SEQ ID号:6、8或10或其片段或变体的多肽序列。转化的宿主细胞在该核苷酸序列得以表达的条件下生长。
用于构建表达盒的方法在以上进行了描述。一旦构建,可以将该表达盒结合进入一种载体以辅助该表达盒引入该宿主细胞中。
将核酸构建体(例如表达盒与载体)引入宿主细胞中的方法在本领域是熟知的并且取决于所选择的宿主细胞而变化。参见,例如,Davis(戴维斯)等人,《分子生物学基本方法》(Basic Methods in Molecular Biology)爱思唯尔出版公司1986(Elsevier Press1986)。用于将核酸构建体(例如表达盒或载体)引入宿主细胞中的方法的实例包括但不局限于,农杆菌介导的转化、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、粒子轰击、聚合物介导的转化、以及病毒介导的转导。参见,例如,Bacchetti(巴切蒂)&Graham(格拉汉姆)(1977),《美国科学院院刊》74:1590-1594;Bertram(伯特伦)(2006),《当前药学生物技术》(Current Pharm.Biotechnol.)7:277-228;Fischer(费舍尔)等人(2002),《生物偶联物化学》(Bioconjugate Chem.)13:1124-1133;Graham(格拉汉姆)&van der Eb(范德伊布)(1973),《病毒学》52:456-467;Menuel(曼纽尔)等人(2008),《生物偶联物化学》19:2357-2362;Soltani(索尔塔尼)等人,《农杆菌属:从生物学到生物技术》649-675中的“非植物生物的农杆菌介导的转化”("Agrobacterium-mediated transformation of non-plant organisms"649-675In:Agrobacterium:From Biology to Biotechnology)(Tzfira(茨菲拉)&Citovsky(契托夫斯基)编辑,斯普林格出版社(Springer)2008);以及Tsukakoshi(冢越)等人(1984),《应用物理学B-光物理学与激光化学》(Appl.Physics B-Photophys.Laser Chem.)35:135-140。
如以上,宿主细胞可以被瞬时转化或稳定转化。
非植物宿主细胞的实例包括但不局限于,以上讨论的产乙醇生物,连同真菌,例如酵母,尤其是短梗霉属、隐球酵母属、克鲁维酵母属、赤酿母属、酵母菌属以及掷孢酵母属。
一旦该木聚糖酶、其活性变体或片段通过该宿主细胞或生物得以表达,它可以从该宿主细胞或生物中纯化以用于在此描述的这些组合物中。
该木聚糖酶可以被分离并且配制为用于木质纤维素生物加工的组合物。以此方式,可以在一个高pH,典型地在pH8.5或更高,包括pH10、pH11、pH12和更高,优选pH12配制这些组合物。其他组分可以包括在该组合物内,这些组分包括但不局限于,其他的生物加工酶类或化学药品连同稳定剂。
方法
本发明的方法包括将木质纤维素材料与一种如在此描述的酶组合物接触,以水解其中的纤维素、半纤维素以及木素聚合物为用于后续在不同饲料、食品/饮料与工业产业中使用的单体。特别是,这些方法在高温、高pH应用中找到了用途。
简而言之,将木质纤维素材料生物转化为有用的、更高价值的产物通常要求多步骤加工,这些步骤包括:(1)预处理(例如生物的、化学的或机械的)木质纤维素材料,以及(2)通过使它们与木聚糖酶、其变体或片段接触,来水解纤维素、半纤维素和/或木素聚合物以产生更简单的、仍易于可代谢的分子(例如己糖或戊糖)。可任选地进行额外的步骤,例如可能在饲料、食品/饮料与工业行业中要求的步骤。这类额外的步骤可以包括:(3)这些分子的生物利用以支持微生物生长或以生产化学产物,以及(4)这些化学产物的分离与纯化。
木质纤维素可以在例如非木本植物的茎、叶、皮、壳以及穗轴,或者木本植物(例如树木)的叶、枝与木中找到。木质纤维素植物材料还可以从木质纤维素废弃物,例如植物残体与废纸来获得。植物残体的实例包括但不局限于,茎、叶、皮、壳、穗轴等等,以及木、木屑、木浆与锯屑。废纸的实例包括但不局限于,丢弃的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机纸等等,以及丢弃的报纸、杂志、纸板以及纸质包装材料。木质纤维素植物材料还可以来自农业废弃物、森林枯落物(forestry residue)、草质材料、城市固体废物、以及浆料与纸厂残余物。
这些方法可以包括预处理木质纤维素材料的一个步骤。尽管木质纤维素材料可以“按原样”使用,但是还可以用本领域熟知的方法预处理,这些方法包括生物预处理、化学预处理或物理预处理。生物预处理的实例包括但不局限于,使用木素增溶微生物(例如梭菌属或链霉菌属)。化学预处理的实例包括但不局限于碱处理、氨处理、稀酸处理、有机溶剂处理、臭氧处理、二氧化硫处理、二氧化碳处理和pH控制的水热处理。物理预处理的实例包括但不局限于不同类型的水热处理、辐射、研磨、气烘/蒸汽喷发和声处理(超声处理)。大体参见,Hsu(许),《生物乙醇手册:生产与利用》179-212中的生物质预处理("Pretreatment of biomass"179-212In:Handbook on Bioethanol:Production and Utilization)(Wyman(怀曼)编辑,泰勒弗朗西斯出版社(Taylor&Francis)1996);Ghosh(高希)&Singh(辛格)(1993),《应用微生物学进展》(Adv.Appl.Microbiol.)39:295-333;McMillan(麦克米伦),《用于燃料生产的酶转化》第15章中的木质纤维素生物质预处理:综述("Pretreatinglignocellulosic biomass:a review"Chapter15In:Enzymatic Conversion of Biomass forFuels Production)(Himmel(西摩尔)等人编辑,美国化学学会(American ChemicalSociety)1994);Gong(龚)等人(1999),《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.)65:207-241;Olsson(奥尔森)&Hahn(哈恩)-Hagerdal(哈格代尔)(1996),《酶微生物学技术》(Enz.Microb.Tech.)18:312-331;以及Vallander(瓦伦德尔)&Eriksson(埃里克森)(1990),《生物化学工程/生物技术进展》42:63-95;以及美国专利号5,733,741与6,333,181。
这些方法包括使具有纤维素、半纤维素和/或木素的木质纤维素材料与木聚糖酶组合物接触,来将该材料水解成更简单的、更易于可利用的分子。如在此使用,“接触”是指使酶、其变体或片段与木质纤维素材料在一起,由此促进酶、其变体或片段水解木质纤维素材料或对该材料起作用所必需的分子间相互作用。取决于该酶、和/或其变体或片段的来源,接触可以发生在体外(in vitro)、活体外(ex vivo)或活体内(in vivo)。
总体上,合适的酶剂量是约0.01单位至1000单位每克的干木质纤维素材料,并且更优选0.1单位至500单位每克。该酶组合物的活性可以如以下来确定:向0.5ml木聚糖溶液(1%;西格玛,圣路易斯,密苏里州(Sigma,St.Louis,MO);在50mM磷酸盐缓冲液中制备,pH7)添加0.5ml适当稀释的处于相同缓冲液中的酶。将该溶液在70℃孵育约10分钟。然后将该反应通过添加1ml DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸盐10g/L;Na/K酒石酸盐300g/L;NaOH16g/L)来终止,并且可以通过煮沸该样品5分钟显出颜色。参见,例如,Ghose(高斯)(1987),如以上;以及Miller(米勒)(1959),如以上。然后可以在540nm的波长处测量吸收性。一酶单位在测定条件下释放一μmol作为每分钟木糖计算的还原糖。该活性可以从在测定条件下释放4μmol的还原糖的酶稀释液来计算。
如果该酶组合物的活性是不足的,则可以将它在使用前浓缩。浓缩多肽与蛋白例如酶类的方法在本领域是熟知的。参见,例如,Ahmed(艾哈迈德),《蛋白提取、纯化与鉴定的原理与方法》(Principles and Reactions of Protein Extraction,Purification,and Characterization)(CRC出版社2004);Dennison(丹尼森),《蛋白分离指南》(A Guide to Protein Isolation)第二版,(克鲁乌学士出版社2003(KluwerAcademic Publishers2003));Degerli(德葛利)&Akpinar(阿克帕纳尔)(2001),《分析生物化学》297:192-194;以及《蛋白方法》(Protein Methods)第二版,(Bollag(伯莱格)等人编辑,威利出版社(Wiley Publishers)1996)。例如,简单超滤法可以用于浓缩该酶的上清液5-25倍。
接触时间可以并且将取决于以下因素而变化,例如所希望的结果、所使用的木质纤维素材料的类型、所使用的木质纤维素材料的量、所使用的酶的量、该酶组合物的特异活性、温度、pH、等等。然而,该步骤可以进行一段时间,这段时间足以减少木质纤维素材料的纤维素、半纤维素和/或木素含量。如此,木质纤维素材料和酶、其变体或片段可以接触持续以下时间:约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约32小时、约34小时、约36小时、约38小时、约40小时、约42小时、约44小时、约46小时、约48小时、或更长。
如以上所指出,优选该接触是在以下温度以及pH下进行,该温度与pH在体外增强了该酶的活性。温度的范围可以从约10℃至约100℃,其中约65℃至95℃是优选的。对该步骤而言优选的pH可以是从约pH6至约pH12。在此描述的酶组合物的的一个特征是,它可以在宽广的pH范围上具有活性,连同在pH6-pH12具有高活性,这是对于饲料、食品/饮料以及工业产业(例如,在制浆厂所用的存储塔中)中的许多加工所要求的pH。因为该酶在宽广的pH范围上具有活性,该pH在这些方法中可以变化。如以上所指出,该酶在约pH6下具有木聚糖酶活性,并且在甚至高至约pH12时保留活性。因此,该pH可以在约pH6开始,其中存在木聚糖酶活性,并且然后稳定地变化至更碱性的pH,例如pH12,其中活性将继续。可替代地,pH可以在约pH12,并且然后稳定地变化至一个更酸性的pH,例如pH6。
这些酶组合物或改性的生物可以用于不同方法中。这些木聚糖酶具有以下优点,它们可以在高温以及高pH下使用。在一个实施例中,这些方法可以用在饲料产业中以制造动物饲料。这些方法提供用于在动物消费之前或之中水解饲料中的木聚糖,这些方法包括以下步骤:(a)获得包括木质纤维素材料(例如纤维素、半纤维素以及木素)的饲料材料;(b)将足够量的具有一种木聚糖酶(例如,SEQ ID号:6、8或10)或其一种具有木聚糖酶活性的变体或片段的酶组合物与该饲料材料接触并且持续足够时段,以引起木聚糖的水解,由此在动物消费之前或之中水解饲料中的这些木聚糖。这些方法还可以包括(c)将该饲料材料给予该动物,其中在消费之后,在该动物的消化道中该木聚糖酶活性引起该饲料中的木聚糖的水解。该饲料可以是例如一种谷物、玉米、籽粒、以及类似物。
在另一个实施例中,这些方法可以用在食品/饮料产业中以加工果实或蔬菜材料。这些方法提供了在人类消费之前水解食品或饮料中的木聚糖,这些方法包括以下步骤:(a)提供包含木质纤维素材料(例如纤维素、半纤维素以及木素)的水果或蔬菜材料,例如水果或蔬菜材料;并且(b)将一种足够量的具有一种木聚糖酶(例如,SEQ ID号:6、8或10)或其一种具有木聚糖酶活性的变体或片段的酶组合物与该水果或蔬菜材料接触并且持续足够时段,以引起木聚糖的水解,由此加工该水果或蔬菜材料。该食品可以是例如一种果实或蔬菜汁、啤酒、葡萄酒、糖浆、酱或提取物以及类似物。
在另一个实施例中,这些方法可以用于工业产业中以处理浆料。这些方法提供了水解非木本或木本植物材料中的木聚糖,这些方法包括以下步骤:(a)提供包括纤维素、半纤维素以及木素的非木本或木本植物材料,例如作物、植物或树木生物质;并且(b)将一种足够量的具有一种木聚糖酶(例如,SEQ ID号:6、8或10)或其一种具有木聚糖酶活性的变体或片段的酶组合物与该非木本或木本植物材料接触并且持续足够时段,以引起木聚糖的水解,由此加工该非木本或木本植物材料。这些方法还可以在步骤(b)之前包括,当漂白浆状材料时,将化学浆料暴露于一种二氧化氯漂白阶段以产生一种部分漂白的浆料;(b)将该部分漂白的浆料与包括该酶、其具有木聚糖酶活性的变体或片段的该酶组合物相接触;并且(c)将该经处理的浆料暴露于一种第二二氧化氯漂白中,而没有碱性提取阶段。
在另一个实施例中,这些方法可以用在工业产业中以生产乙醇。这些方法提供了水解非木本或木本植物材料中的木聚糖,这些方法包括以下步骤:(a)提供包括纤维素、半纤维素以及木素的非木本或木本植物材料,例如作物、植物或树木生物质;(b)将一种足够量的具有一种木聚糖酶(例如,SEQ ID号:6、8或10)或其一种具有木聚糖酶活性的变体或片段的酶组合物与该非木本或木本植物材料接触并且持续足够时段,以引起木聚糖的水解,由此加工该非木本或木本植物材料用于随后的乙醇生产。
在另一个实施例中,这些方法可以用以制造生物燃料。这些方法提供了水解非木本或木本植物材料中的木聚糖,这些方法包括以下步骤:(a)提供包括纤维素、半纤维素以及木素的非木本或木本植物材料,例如作物、植物或树木生物质;(b)将一种足够量的具有一种木聚糖酶(例如,SEQ ID号:6、8或10)或其一种具有木聚糖酶活性的变体或片段的酶组合物与该非木本或木本植物材料接触并且持续足够时段,以引起木聚糖的水解,由此加工该非木本或木本植物材料用于随后的生物燃料生产。
实验
以下实例是出于出于说明,而非限制的目的而提供的。
实例1:具有热稳定性的并且嗜碱的木聚糖酶活性的木聚糖酶。
该实例示出木聚糖酶可以具有热稳定性的并且碱的木聚糖酶活性。
可以使用大肠杆菌作为宿主生产木聚糖酶多肽。使用放置在一个诱导型T7lac启动子下游的框内核苷酸序列的限制性酶位点,将编码木聚糖酶的选择的核苷酸序列克隆到pET24a大肠杆菌表达载体中。这类核苷酸序列包括嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶(BsXynA;SEQ ID号:9)和海栖热孢菌木聚糖酶(TmXynB;SEQ ID号:7)。通过使用对于大肠杆菌优选的密码子回译该酶的多肽序列生成编码特定酶的核苷酸序列。将表达载体引入一种大肠杆菌表达株BL21Star(DE3;Invitrogen公司)中。
在含有50ug/mL卡那霉素的标准LB琼脂上对含有修饰的pET24a表达载体的重组大肠杆菌分离株进行选择。在37℃下在摇动下在20mL含有50ug/mL卡那霉素的LB培养基中培养分离株8小时至过夜。
将20ml大肠杆菌培养物转移到含有25ug/ml卡那霉素的1L自诱导培养基中(9.57g胰蛋白胨、4.8g酵母提取物、2ml1M MgSO4、1ml1000X痕量金属、20ml50X5052、以及20ml50X M)(1000X痕量金属:36ml无菌水、50ml在0.12M HCl中的0.1M FeCl3、2ml1M CaCl2、1ml1M MnCl24H2O、1ml1M ZnSO47H2O、1ml0.2M CoCl26H2O、2ml0.1M CuCl22H2O、1ml0.2M NiCl26H2O、2ml0.1M Na2MoO42H2O、以及2ml0.1M H3BO3)(50X5052:25g甘油、73mlH2O、2.5g葡萄糖、以及10gα-乳糖一水合物)(50X M:80ml H2O、17.75gNa2HPO4、17.0g KH2PO4、13.4g NH4Cl、和3.55g Na2SO4),并且在28℃摇荡生长过夜。
通过在10,000X g下离心15分钟从该自诱导培养基收获这些大肠杆菌细胞,并且将这些收集的细胞在-80℃冷冻。通过将该细胞聚合体重新悬浮于一种含有DNase(1U/ml缓冲液)的缓冲液(50mM Tris、pH7.5、50mM NaCl、0.1mM EDTA)中以及使用弗氏压碎器来溶化细胞。通过在4℃12,000X g离心20分钟来除去不可溶的碎片。
对于TmXynB(SEQ ID号:7和8),将含有总可溶蛋白以及重组酶的上清液转移至新的40ml离心管并且在75℃孵育30分钟。这些木聚糖酶仍然可溶并且通过12,000X g离心30分钟与沉淀的蛋白分开,这些收集的蛋白可用于另外的表征。
对于BsXynA(SEQ ID号:9和10),在弗氏压碎器溶化后,将上清液倾倒至一个阴离子亲和柱上,使用
Figure BDA00002900703500391
快速蛋白液相色谱法(FPLC;通用电器生命科学公司(GE Healthcare Life Sciences),乌普萨拉(Uppsala),瑞典)并且使用50mM Tris,pH8.0,具有从0至2M的NaCl梯度,洗脱为多个部分。
使用SDS-PAGE与光密度测定法确定所有木聚糖酶纯度。
通过结合如以上所述的木聚糖酶制剂与桦树底物基生物质,来评估氨水预处理过程中的木聚糖酶活性。该预处理混合物(cocktail)包括0.75%桦树木聚糖以及不同浓度的氨水。每一处理的pH在pH11.3和pH12.4之间。
通过一种剂量响应曲线来确定所使用的木聚糖酶制剂的量,在其中将不同的酶量添加至一种利用0.75%桦树木聚糖以及50mM Tris(pH8.0)来进行的测定中,并且孵育1小时。木聚糖酶的最佳量被确定为是一个不使该桦树木聚糖底物饱和的最大量。对于BsXynA(SEQ ID号:10),这些量是0.6μg每mg的木聚糖,并且对于TmXynB(SEQ ID号:8)是0.25μg每mg的木聚糖。
该预处理鸡尾酒包含0.75%桦树木聚糖、木聚糖酶制剂以及氨水。通过如在以下标题“木聚糖酶测定”标题下所述的DNS显色测定,在对BsXynA(SEQ ID号:10)和TmXynB(SEQ ID号:8)测量木聚糖酶活性以前,在不同温度下孵育预处理混合物1小时。
木聚糖酶测定:将细胞在8000x g下离心5分钟。弃去该上清液,并且将细胞在0.1M甘氨酸缓冲液(pH12,含有7%NH4OH)中重新悬浮至OD600nm=200。将100μl的重新悬浮的细胞在60℃孵育1小时。1小时孵育之后,将在该甘氨酸缓冲液(pH12)中制备的200μl的5%w/v燕麦木聚糖(西格玛)溶液作为底物添加,并且允许该反应在60℃继续1小时。1小时的孵育之后,针对还原糖用DNS比色测定对酶活性进行检测,如描述于Miller(米勒)(1959),如以上。
DNS测定被用于测量由木聚糖酶产生的木糖多糖的还原端的产生;因此,该方法测量了木聚糖酶活性。如以上所指出,该测定基于还原端与DNS的反应;可以比色法使用光谱测定法测量产生的产物。参见例如Miller(米勒)(1959),如以上。经由标准曲线将比色值翻译为还原糖浓度,其中在A540的吸光度被确定用于0-10mM木糖的范围。
还在将酶制剂暴露于氨水中的预处理以确定预处理条件不可逆地改变酶到什么程度以后,评估木聚糖酶活性。为了确定大肠杆菌生产的木聚糖酶的稳定性,将上述木聚糖酶制剂在60℃下在不同浓度的氨水中孵育,随后中和并且随后进行木聚糖酶活性测定。作为额外对照,分析还可以用来自绿色木霉的M1木聚糖酶(Megazyme Int'l Ireland Ltd.公司)来进行。如在上述那些内容中一样,在这些测定中使用相同量的木聚糖酶制剂;按1μg每mg的木聚糖使用M1。
通过将这些木聚糖酶在桦树木聚糖底物的存在下、在60℃、在不同浓度的氨水中孵育进行预处理。将对照样品即刻(AAPT0小时)中和,同时将测试样品在该氨水中孵育1小时。将这些样品通过与DowexTMWeak Acid Resin(道化学公司;米德兰,密歇根州)加上另外的桦树木聚糖孵育0小时(ACT0小时对照)或1小时(ACT1小时测试样品)来中和。通过如在以上描述的DNS测定来确定木聚糖酶活性。
表1和表2示出了在氨水预处理过程中,每一酶的相对木聚糖酶活性。这些值被计算为在60℃和0.01%氨水条件下观察到的酶活性(此酶活性被设定为100%)的百分比。
表1:在氨水预处理期间的BsXynA(SEQ ID号:10)木聚糖酶活性。
Figure BDA00002900703500411
表2:在氨水预处理期间的TmXynB(SEQ ID号:8)木聚糖酶活性。
Figure BDA00002900703500412
因此这些木聚糖酶在氨水预处理过程中是活性的。在于氨水中孵育过程中,这些木聚糖酶能够水解该桦树木聚糖底物,从而表明了这些酶可以在纤维素生物质的预处理过程中使用,以转化该生物质为可发酵糖。在对增加浓度的氨水的耐受性和对更高温度的耐受性中,分析的不同酶示出一些差异。
当选择一种适当的木聚糖酶用于纤维素生物质的预处理时,在提高氨水浓度的同时,这些酶对温度的灵敏度是重要考虑的。
表3至表5示出在生物质底物存在下,在氨基预处理条件下孵育后,不同木聚糖保持木聚糖酶活性。
表3:用氨水预处理(AAPT)、随后是中和以及一小时活性孵育(AI)的M1木聚糖酶活性(mM木糖当量)。
Figure BDA00002900703500421
表示为百分比,其中100%=在0.01%AA的活性,AAPT:0hr,作用:1hr.
表4:用氨水预处理(AAPT)、随后是中和以及一小时活性孵育(AI)的BsXynA(SEQ ID号:10)木聚糖酶活性(mM木糖当量)。
表示为百分比,其中100%=在0.01%AA的活性,AAPT:0hr,作用:1hr
表5:用氨水预处理(AAPT)、随后是中和以及一小时活性孵育(AI)的TmXynB(SEQ ID号:8)木聚糖酶活性(mM木糖当量)。
Figure BDA00002900703500431
表示为百分比,其中100%=在0.01%AA的活性,AAPT:0hr,作用:1hr
因此这些木聚糖酶可以在基于氨的预处理过程中使用并且在生物质的纤维素转变为可发酵糖加工过程中的生物质预处理之后继续起作用。对暴露于氨基预处理,M1酶(对照)示出很少至没有耐受性,同时对暴露于氨基预处理,BsXynA(SEQ ID号:10)和TmXynB(SEQ ID号:8)这二者都示出不同水平的耐受性。当考虑开发一种包括了使用能够分解生物质的酶的纤维素生物质转化过程时,这些酶可以是一种选用酶。
实例2:木聚糖酶10蛋白和对植物叶组织的作用
用表达来自木聚糖酶家族11类酶的木聚糖酶的转基因植物的以上经验导致其中表达家族11木聚糖酶的负农学表型的关联。表达家族11木聚糖酶的转基因植物(其中酶在植物的种子中表达)经常展示负种子表型,例如枯萎的种子。此外,具有半纯化木聚糖酶家族11酶的渗透的植物叶导致坏死叶损伤。本领域存在对木聚糖酶的需求,这些木聚糖酶可以表达在转基因植物中,而没有关联的负表型,例如坏死损伤或枯萎的种子。以下实例描述了与植物叶中的家族10内切1,4β木聚糖酶存在关联的植物表型。
通过用半纯化的酶制剂渗透植物叶(烟草和玉米),测试了木聚糖酶家族10酶制剂引起植物坏死表型的能力。这些植物观察到坏死损伤的发展。已经指出,当该酶被渗透到叶中时,测试的家族10木聚糖酶中没有一个与植物叶中的坏死损伤关联。
将编码家族10内切1,4β木聚糖酶多肽的四个多核苷酸序列克隆到表达载体pET24(Novagen公司)中。这四个核苷酸序列是TmXynA(基因库ID号:AAD35155;SEQ ID号:5),TmXynB(基因库ID号:AAD35164;SEQ ID号:7),CtXynZ全酶(基因库ID号:ABN53181;SEQ ID号:1),以及含有阿魏酸酯酶(ferrulic acid esterase)活性的CtXynZ的一个片段(SEQ ID号:3)。在每一个重组pET24表达载体中,在His标签(它是pET24表达载体的一个组分)之前引入一个终止密码子。该终止密码子确保重组pET24表达载体产生的多肽不包含一个His标签。
使用标准分子生物学技术,将重组pET24表达载体(包含编码木聚糖酶10蛋白的多核苷酸序列)转化到大肠杆菌宿主BL21[DE3]中。为了从重组大肠杆菌宿主纯化蛋白,在50mL的自诱导培养基(9.57g胰蛋白胨、4.8g酵母提取物、2ml1M MgSO4、1mL1000X痕量金属、20ml50X5052、20mL50X M)(1000X痕量金属:36mL无菌水、50mL0.1M FeCl3在0.12M HCl中、2mL1M CaCl2、1mL1M MnCl24H2O、1mL1M ZnSO47H2O、1mL0.2M CoCl26H2O、2mL0.1M CuCl22H2)、1mL0.2M NiCl26H2O、2mL0.1M Na2MoO42H2O、2mL0.1M H3BO3)(50X5052:25g甘油、73mL H2O、2.5g葡萄糖、10gα-乳糖一水合物)(50X M:80mL H2O、17.75g Na2HPO4、17.0g KH2PO4、13.4g NH4Cl、3.55g Na2SO4)中生长,该培养基中还含有25ug/mL卡那霉素作为用于重组pET24质粒的选择剂。通过离心从这50mL的培养物中回收细菌细胞,并且然后重新悬浮在无蛋白酶抑制剂的缓冲液(50mM Tris pH7.5、50mM NaCl、0.1mM EDTA)中。通过使该溶液穿过弗氏压碎器来溶化重悬浮的细胞,并且通过离心回收细胞碎片(弃去团块,保留上清液)。通过在70℃孵育30分钟进一步热处理上清液,并且通过离心除去生成的变性蛋白(弃去团块,保留上清液)。进一步浓缩上清液并且通过穿过一个交联葡萄糖G-25中型基质柱(GE Healthcare公司,catalog#17-0851-01)脱盐,并且洗脱结合的蛋白到缓冲液10mM磷酸钾缓冲液pH5.8中。
使用牛γ球蛋白(Pierce公司)以产生标准曲线的Bradford测定,来量化上述制剂中的蛋白。通过进行其中考马斯亮蓝染色蛋白的SDS-PAGE,随后是使用具有Quantity One软件包,版本4.6.3(Quantity One1-D分析软件,Catalog#:170-9600,版本4.6.5,Build094)的BioRad图像仪的光密度测定法,来确定上述木聚糖酶制剂的纯度CtXynZ蛋白(基因库ID号:ABN53181;SEQ ID号:2)为41.2%纯,TmXynA(基因库ID号:AAD35155;SEQ ID号:6)为78%纯并且TmXynB(基因库ID号:AAD35164;SEQ ID号:8)为96%纯。此外,通过基本如以下所述的蜡质活性测定证明木聚糖酶活性;然而用于该测定的标准为0、20mM、40mM、60mM、80mM和100mM木糖,并且该测定允许进行4小时。基于蜡质活性测定(除了仅有负对照的CtXynA FAE组分(SEQ ID号:4)),所有酶制剂包含木聚糖酶活性。
将木聚糖酶制剂渗透到来自烟草或玉米的叶中,以确定木聚糖酶10酶是否会引起植物组织中的坏死表型。将来自含有一个来自TEV的突变的P1/HC-Pro基因(该基因抑制转录后基因沉默(Mallory(马洛里)等人,《自然生物技术》20:622(2002)))的转基因TEV-B烟草植物(在烟草栽培品种Xanthi中制造)的烟草叶用于瞬时表达选择的酶。使用一个5mL注射器通过将该注射器的尖端(无针头)压到叶子的背轴面表面上,在玉米(约3周龄)和TEV-B烟草植物(约4周龄)上进行单独的叶的渗透。用两种不同剂量的木聚糖酶制剂(150ug/mL亦或25ug/mL)渗透植物;在1mg/ml或0.1mg/ml渗透小麦阿拉伯木聚糖对照,同时在10mM或1mM渗透消化的小麦阿拉伯木聚糖。将已渗透的植物保持在22℃-25℃下其中光周期为16小时光照和8小时黑暗。浸润后7天后收获植物组织用于随后的分析。
分析用木聚糖酶10渗透的来自烟草植物和玉米植物这二者的叶的视觉症状,例如通过叶组织的枯萎和褐变所证明的坏死损伤。木聚糖酶10蛋白渗透的组织中没有发展坏死或损伤;制剂包括CtXynA全酶(SEQ ID号:2),CtXynA FAE组分(SEQ ID号:4),TmXynA(SEQ ID号:6),以及TmXynB(SEQ ID号:8)。作为阴性对照,底物小麦阿拉伯木聚糖被渗透到烟草和玉米叶中,基本上如以上对渗透木聚糖10蛋白的描述。还将消化的小麦阿拉伯木聚糖进行渗透以确定木聚糖酶分解产物是否诱导植物表型。小麦阿拉伯木聚糖并不诱导植物表型;然而,消化的小麦阿拉伯木聚糖制剂在烟草和玉米叶这二者中都不诱导坏死损伤。作为纯制剂,有可能被用于消化小麦阿拉伯木聚糖的M1木聚糖酶并未从分解产物适当地滤掉,并且负责引起渗透烟草和玉米叶中的坏死。当渗透到烟草或玉米叶中时,M1木聚糖酶已经诱导了损伤。
此外,使用蜡质活性测定对来自用木聚糖酶10酶制剂渗透的植物叶的提取物进行测定,以确定渗透的木聚糖酶制剂是否保持了木聚糖酶活性。所有渗透到植物叶中的木聚糖酶制剂包含木聚糖酶活性,除了只有阴性对照CtXynA FAE组分(SEQ ID号:4),它并不具有木聚糖酶活性。
蜡质活性测定:
与50uL的小麦阿拉伯木聚糖(如Megazyme所述制备)一起孵育10uL的酶制剂。通过结合50uL的阿拉伯木聚糖与10uL的木糖标准产生标准。不搅拌,将这些制剂在40℃孵育3小时。通过添加50uL的DNS量化这些反应(溶解5.0g的3,5-二硝基水杨酸和150g酒石酸钠钾四水化合物于900mL的0.4M氢氧化钠中。转移至1L体积的烧瓶中并且用0.4M氢氧化钠调整体积至1L)并且在95℃孵育10分钟。确定生成的制剂的在540nM的吸光度。木糖标准被用于建立标准曲线,并且基于标准曲线计算来自木聚糖酶制剂的吸光度读数。
本说明书中提到的所有公开文献以及专利申请都指示了本发明涉及的本领域内的那些技术人员的水平。所有公开物和专利申请均通过引用结合在此,其程度如同每个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。
尽管已经为了清楚理解的目的通过解释和实例详细地描述了以上发明,显而易见的是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和变更。
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Claims (37)

1.一种加工木质纤维素材料的方法,该方法包括使木质纤维素材料与具有木聚糖酶活性的至少一种酶接触的步骤,用来水解该木质纤维素材料,其中该酶具有选自下组一个氨基酸序列,该组由SEQ ID号:6、8或10或其一个活性变体或片段组成,并且其中该接触是在约pH6至约pH12的pH条件下。
2.如权利要求1所述的方法,其中这些条件包括约95°C的一个反应温度。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中该木聚糖酶以从约0.01单位至约1000单位存在。
4.如权利要求1或2所述的方法,其中该木聚糖酶以约500单位存在。
5.如权利要求1或2所述的方法,其中该pH随时间降低至约pH6的pH。
6.如权利要求1或2所述的方法,其中该接触持续约12小时至约24小时。
7.如权利要求1或2所述的方法,其中该接触持续约6小时。
8.如权利要求1或2所述的方法,其中该接触是在选自下组的至少一种额外的酶存在下进行的,该组由以下各项组成:一种纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶和蛋白酶。
9.如权利要求8所述的方法,其中该纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、1,3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-β-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。
10.如权利要求8所述的方法,其中该半纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、内切-半乳聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶、外切-β-1,4-甘露糖苷酶、外切-β-1,4-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、对位-熏草酸酯酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶和木葡聚糖内糖基转移酶。
11.如权利要求8所述的方法,其中该木质酶选自下组,该组由以下各项组成:一种二芳基丙烷过氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、木素过氧化酶、锰过氧化酶、甲醇氧化酶、甲醇氧化还原酶、苯酚氧化酶、苯酚过氧化酶和藜芦基醇氧化酶。
12.如权利要求8所述的方法,其中该果胶酶是选自下组,该组由以下各项组成:一种果胶降解酶、pectozyme酶和多聚半乳糖醛酸酶。
13.如权利要求8所述的方法,其中该蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:一种萝蘼蛋白酶、菠萝酶、caricain酶、木瓜凝乳蛋白酶、胶原酶、甘氨酰肽链内切酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
14.如权利要求1、2、或8所述的方法,其中该方法包括用至少一种选下组的酶进行加工,该组由以下各项组成:一种淀粉酶、过氧化氢酶、角质酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶、支链淀粉酶和木糖异构酶。
15.如权利要求1、2、8、或14所述的方法,其中该方法进一步包括用至少一种选自下组的试剂进行加工,该组由以下各项组成:一种氯、洗涤剂、次氯酸盐、过氧化氢、草酸、过酸、pH-调节试剂、磷酸三钠、亚氯酸钠、硝酸钠、表面活性剂、脲和水。
16.如权利要求1、2、8、14、或15所述的方法,其中该方法进一步包括用一种产乙醇微生物进行加工,该产乙醇微生物例如是一种细菌或酵母。
17.如权利要求1直至16中任一项所述的方法,其中在步骤(a)之前,通过生物预处理、化学预处理或物理预处理对该木质纤维素材料进行预处理。
18.如权利要求17所述的方法,其中该生物预处理包括使用木素增溶微生物。
19.如权利要求18所述的方法,其中该化学预处理选自下组,该组由使用以下处理组成:碱处理、氨处理、稀酸处理、有机溶剂处理、臭氧处理、二氧化硫处理、二氧化碳处理和pH控制的水热处理。
20.如权利要求18所述的方法,其中该物理预处理选自下组,该组由使用以下项组成:水热处理、辐射、研磨、气烘/蒸汽喷发和声处理(超声处理)。
21.一种加工木质纤维素材料的方法,该方法包括使木质纤维素材料与具有木聚糖酶活性的至少一种酶接触的步骤,用来水解该木质纤维素材料,其中在10或更大的pH下,该酶保持至少60%的最佳木聚糖酶活性。
22.一种包括具有木聚糖酶活性的酶的组合物,其中该酶具有选自下组的氨基酸序列,该组由SEQ ID号:6、8或10或其一个活性变体或片段组成,并且其中该组合物具有至少约pH10的一个pH。
23.如权利要求22所述的组合物,其中所述木聚糖酶具有选自下组的氨基酸序列,该组由以下各项组成:
a)与SEQ ID号:6、8、或10中列出的氨基酸序列具有至少约90%序列一致性的一个氨基酸序列;
b)与SEQ ID号:6、8、或10中列出的氨基酸序列具有至少约95%序列一致性的一个氨基酸序列;以及
c)与SEQ ID号:6、8、或10中列出的氨基酸序列具有至少约99%序列一致性的一个氨基酸序列。
24.如权利要求22所述的组合物,其中该组合物具有约pH12的pH。
25.如权利要求24所述的组合物,其中该酶在高达约95°C的温度下是稳定的。
26.如权利要求22或23所述的组合物,进一步包括选自下组的至少一种酶,该组由以下各项组成:一种纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、果胶酶和蛋白酶。
27.如权利要求26所述的组合物,其中该纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶、1,3-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-β-葡聚糖葡聚糖水解酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶和1,6-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶。
28.如权利要求26所述的组合物,其中该半纤维素酶选自下组,该组由以下各项组成:一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、内切-半乳聚糖酶、内切-β-1,4-甘露聚糖酶、内切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶、外切-β-1,4-甘露糖苷酶、外切-β-1,4-木糖苷酶、阿魏酸酯酶(feruloyl esterase)、阿魏酸酯酶(ferulic acidesterase)、对位-熏草酸酯酶、葡糖醛酸木聚糖木聚糖水解酶和木葡聚糖内糖基转移酶。
29.如权利要求26所述的组合物,其中该木质酶选自下组,该组由以下各项组成:一种二芳基丙烷过氧化酶、葡萄糖氧化酶、乙二醛氧化酶、木素过氧化酶、锰过氧化酶、甲醇氧化酶、甲醇氧化还原酶、苯酚氧化酶、苯酚过氧化酶和藜芦基醇氧化酶。
30.如权利要求26所述的组合物,其中该果胶酶是选自下组,该组由以下各项组成:一种果胶降解酶、pectozyme酶和多聚半乳糖醛酸酶。
31.如权利要求26所述的组合物,其中该蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:一种萝蘼蛋白酶、菠萝酶、caricain酶、木瓜凝乳蛋白酶、胶原酶、甘氨酰肽链内切酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。
32.如权利要求22、23、或26所述的组合物,进一步包括至少一种选下下组的酶,该组由以下各项组成:一种淀粉酶、过氧化氢酶、角质酶、葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、脂肪酶、植酸酶、支链淀粉酶和木糖异构酶。
33.如权利要求22、23、26、或32所述的组合物,进一步包括至少一种选自下组的试剂,该组由以下各项组成:一种氯、洗涤剂、次氯酸盐、过氧化氢、草酸、过酸、pH-调节试剂、磷酸三钠、亚氯酸钠、硝酸钠、表面活性剂、脲和水。
34.如权利要求22、23、26、32、或33所述的组合物,进一步包括一种产乙醇微生物,例如一种细菌或酵母。
35.用一种核酸构建体稳定转化的一种宿主细胞,该构建体包括可操作地连接到一个核酸序列的一个启动子,该核酸序列编码一个多肽,该多肽具有选自下组的一个氨基酸序列,该组由SEQ ID号:6、8或10或其一个变体或片段组成,其中该细胞是一种细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞,并且其中该启动子关于该核苷酸序列是异源的。
36.如权利要求35所述的宿主细胞,其中该木聚糖酶具有选自下组的一个氨基酸序列,该组由以下各项组成:SEQ ID号:6、8或10,或其一个活性变体或片段。
37.如权利要求36所述的宿主细胞。其中该核苷酸序列选自下组,该组由以下各项组成:SEQ ID号:5、7和9。
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