CN114755337A - 二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米材料领域，涉及蛋白质组学，特别是指二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和应用。通过光交联的方法将生物活性小分子固定在磁硅纳米基质上。本发明合成的功能化磁硅亲和探针在保留了良好的磁性和配体与靶点的亲和力同时可通过打断二硫键释放与配体特异性结合的蛋白质靶点。该合成方法工艺简单、成本低、适用范围广；合成产物生物相容性好，可通过外加磁场操纵。该方法可作为通用方法广泛用于生物活性小分子的配体固定和靶点识别，且具有良好的特异性。

Description

二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于纳米材料领域，涉及蛋白质组学，特别是指二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和应用。

背景技术

人类使用生物活性小分子作为药物已有数千年的历史，目前对天然产物的研究兴趣主要集中在获取有关其分子靶点和作用机制的知识，以了解它们在体外和体内的功能，以及它们的分离、结构测定和总合成。基于生物活性化合物与特定蛋白质特异性相互作用以发挥其作用的概念，发现与特定疾病和失调相关的特定蛋白质变得重要。然而，仍有许多生物活性化合物的靶分子尚未被发现。因此，大量的生物活性化合物被利用，而没有对其靶蛋白或其精确的生物和药理作用机制的全面了解。为了阐明和理解生物活性化合物在细胞和活体中的作用机理，对生物活性化合物新靶分子的精确识别和安全获取变得更加重要。专利CN 102974314A中公开了一种磁性仅纳米粒子复合材料的制备方法，该材料结合了金纳米粒子和磁性纳米粒子，用于水中苯并芘的快速高效分离。专利CN106693909A公开了一种用于富集果糖的磁性纳米微球；为了实现对生物小分子的鉴别，科研人员做了大量的实验探索，但是不同的底物，所需要识别的靶分子的结构就会截然不同，因此针对生物活性小分子，例如多肽，就需要开发实用的工具和有用的方法来识别感兴趣的生物活性化合物的靶分子。

在目前可用于靶点识别的许多方法中，使用亲和探针进行亲和纯化是一种经典但仍然是最常用的方法，因为它可以直接检测配体-蛋白质相互作用。其中，感兴趣的生物活性化合物被用作配体来探索其靶分子。基于探针合成，亲和纯化可分为两类，即基于基质的亲和纯化和基于非基质标记的亲和纯化。对于基于基质的亲和纯化，其典型方法包括以下步骤：（1）将给定的小分子配体固定在固体基质上；（2） 从蛋白质库（如细胞裂解物）中分离目标蛋白质；（3） 清洗以去除非特异结合的蛋白质；（4） 洗脱；（5）用SDS-PAGE或质谱法鉴定洗脱样品。

然而，与亲和系统相关的两个主要问题往往限制了它的广泛应用。一个是非特异性蛋白质吸附，另一个是配体固定。对于前者，无关蛋白质与亲和基质的非特异性结合可能会抑制来自靶点的信号或导致假阳性识别。对于后者，通常需要进行结构-活性关系（SAR）研究，以使不同的小分子配体能够在亲和基质上适当固定，而不会失去它们的活性。第一个问题涉及亲和系统的识别效率，而第二个问题涉及其应用范围。识别效率和应用范围对于亲和系统同样重要，这导致我们考虑在亲和系统的构建中引入替代基质和替代策略。

在过去几十年中，尽管在开发新的靶点识别实验技术方面取得了很大进展，但尚未建立适用于大多数识别案例的通用方法。这种缺陷可能与一些复杂的影响有关，例如生物活性小分子的不同化学性质及其对靶蛋白的不同亲和力，靶蛋白的不同性质及其在体内的丰度变化等。用于配体固定和靶点识别的通用亲和探针是一个有前景的方向以期望来解决实际应用中制备不同用途的亲和材料在费用、时间和通量等方面的限制。这方面的改进可能会为上述经典亲和策略在靶点识别中的扩展应用开辟一条途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针是以磁性二氧化硅纳米粒子为基质，在磁硅纳米粒子表面引入二硫键连接器（linker）后通过二硫键linker共价固定光交联分子，然后通过光交联固定生物活性小分子配体。以上所涉及合成路线如图1所示。

上述二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备，所述的磁性二氧化硅纳米粒子是按照以下方法制备的：

步骤1. 在干燥锥形瓶中加入40 mL乙二醇、0.5-1.5 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、1.08 g FeCl₃∙6H₂O、1-5 g无水乙酸钠搅拌至完全溶解。将锥形瓶中的液体转移至高温高压反应釜中，200 ℃反应10 h。反应结束后，自然冷却过夜至室温，釜中所得黑色材料即为Fe₃O₄磁性纳米粒子。

步骤2. 取50 mg Fe₃O₄磁性纳米粒子加入60 mL无水乙醇和6 mL去离子水转移至三颈烧瓶中，超声处理使之分散均匀；加入适量氨水，再次超声处理15 min；将200-400 μL正硅酸乙酯与15 mL无水乙醇混合后缓慢加入三颈烧瓶中，继续超声处理90 min。反应结束后即得到包覆SiO₂层的磁性纳米粒子，洗涤后记作MSP。40-60 °C干燥备用。

本发明利用磁性二氧化硅纳米粒子具有良好的磁性并且在吸附或偶联各种分子时具有良好的表面积的结构特点，以其为基质，在其表面进行结构修饰得到二硫linker和配体功能化的光交联磁硅亲和探针。

上述的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备，所述的光交联分子的固定是按以下方法制备的：

步骤1. 磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的巯基修饰

取干燥的200 mg MSP加入 40 mL 甲醇，超声使之均匀分散。加入4 mL氨水和0.6-1.8 mL 3-巯基丙基三乙氧基硅烷超声均匀后机械搅拌下室温避光反应24小时，以获得巯基官能化的磁硅纳米粒子（MSP-SH）。借助磁铁收集粒子，所得产物用甲醇和去离子水清洗，然后40-60°C干燥以供进一步使用。

步骤2. MSP-SS-Py的制备

取200-400 mg二硫二吡啶溶解于甲醇中，在加入到100 mg MSP-SH中。该混合物在摇床上避光室温振荡6-12 h。反应结束后，通过磁分离获得的产物用甲醇洗涤，即为MSP-SS-Py。

步骤3. MSP-SS-MPA的制备

将1-2 mL MPA添加到含有100 mg MSP-SS-Py的甲醇溶液中。混合液在室温下避光振荡24小时。最后，通过磁分离收集所得产物并用甲醇和去离子水洗涤即得二硫linker和MPA功能化的磁性二氧化硅纳米粒子（MSP-SS-MPA）。

步骤4. 羧基的活化

200-500 mg EDC∙HCl和200-500 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）共溶于DMF中，然后加入100 mg MSP-SS-MPA。在室温下摇动混合物8小时。收集NHS活化的材料，并用DMF洗涤得到MSP-SS-MPA-NHS。

步骤5. 光交联分子的共价固定

100 mg MSP-SS-MPA-NHS通过的体积分数为70%、30%的丙酮水溶液和100 mMHEPES（pH=8.3）逐步洗涤从有机溶剂转移到水相中。在室温下，将30 mg-50 mg 4-[3-（三氟甲基）-3H-二嗪-3-基]苄胺（TDBH）与NHS活化的磁硅粒子在100 mM HEPES（pH=8.3）中偶联12 h，然后分别用水和甲醇洗涤，得到光交联分子共价固定的粒子MSP-SS-MPA-TDBH

上述二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备，所述的通过光交联固定生物活性小分子配体以4-(2-氨乙基)苯磺酰胺（AEBSA）为例并且包括以下步骤：

步骤1. 通过光交联固定生物活性小分子

将3 mg-7 mg AEBSA溶解于1 mL甲醇中，再加入到10 mg MSP-SS-MPA-TDBH中，然后混合1 h。混合物涂布在玻璃板上，挥干溶剂后在上方距离2 cm处通过365 nm紫外线照射交联20-30 min。然后将材料用甲醇和水分别洗涤即得MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA。

本发明的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针在生物活性小分子的靶点识别中应用，包括以下步骤：

a. 将光交联磁性二氧化硅亲和探针与待测蛋白样品进行孵育，然后通过广泛洗涤除去与光交联磁性二氧化硅亲和探针结合不紧密的非特异性结合蛋白；

b. 洗涤后用DTT或TCEP打断二硫键来释放与AEBSA结合的蛋白，经SDS-PAGE并用考染显影得到蛋白条带；

c. 步骤b的蛋白条带经胰蛋白酶消化后通过MS/MS分析鉴定所得肽进而鉴定是否为靶蛋白碳酸酐酶2。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明展示了二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的构建方法，通过光交联的方法可将不同生物活性小分子固定在磁性纳米结构上，利用亲和探针识别不同生物活性小分子的靶点。在此，将碳酸酐酶2（CA2）与抑制剂4-（2-氨基乙基）苯磺酰胺（AEBSA）作为模型系统，验证亲和探针的特异性和有效性。结果证明二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针保持了苯磺酰胺对CA2的富集能力。它不仅在捕获靶点方面表现出良好的性能，而且在通过断裂二硫linker选择性释放靶点方面也表现出同样优异的性能，由图8可知，本申请的亲和探针MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA在生物样品中可以捕获CA并特异性释放CA。本发明合成的功能化磁硅亲和探针在保留了良好的磁性和配体与靶点的亲和力同时可通过打断二硫键释放与配体特异性结合的蛋白质靶点。该合成方法工艺简单、成本低、适用范围广；合成产物生物相容性好，可通过外加磁场操纵。该方法可作为通用方法广泛用于生物活性小分子的配体固定和靶点识别，且具有良好的特异性。

2、本申请的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针继承了Fe₃O₄纳米粒子的磁响应性，使其能够在外部磁场下快速从样品溶液中分离。结合光交联磁性二氧化硅亲和探针的优异性能和质谱技术，结果表明，从复杂的生物样品中可以容易地捕获和释放生物活性小分子的靶点，而且具有高灵敏度和选择性。该亲和探针明显增进了蛋白质组学的通量，提高了靶点鉴定的准确性并且简化了合成过程。这将大大促进蛋白质组学的发展。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所涉及的合成路线示意图。

图2为本发明所涉及的应用流程示意图。

图3为Fe₃O₄（a）、MSP（b）的透射电镜图。

图4为Fe₃O₄、MSP的磁滞回曲线。

图5为Fe₃O₄（a）、MSP（b）、MSP-SH（c）、MSP-SS-MPA（d）的傅里叶变换红外光谱图。

图6为MSP-SS-MPA（a）、MSP-SS-MPA-TDBH（b）的X射线光电子能谱。

图7为DTT断裂MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA的二硫键后所得上清液的质谱色谱图。

图8为SDS-PAGE凝胶电泳对人红细胞裂解液中CA捕获释放的鉴定结果，其中(1)Maker；(2)标准 CA对照； (3) 人红细胞裂解液母液；(4) 洗涤后直接煮珠子的上清；(5)和(6)分别为MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA与母液孵育并洗涤后分别经DTT和PB 缓冲液处理后上清。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备方法，步骤为：

1、磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备：

（1）四氧化三铁（Fe₃O₄）磁性纳米粒子的制备：在100 mL干燥锥形瓶中加入40 mL乙二醇和1 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐，封口，加热条件下磁力搅拌至溶液澄清透明。冷却至室温后，称取1.08 g FeCl₃∙6H₂O加入上述溶液中搅拌20 min。称取预先干燥的无水乙酸钠3 g 加入锥形瓶中，继续搅拌至完全溶解。取出磁子，将锥形瓶中的液体转移至高温高压反应釜中，200 °C反应10 h。反应结束后，自然冷却过夜至室温，釜中所得黑色材料即为Fe₃O₄磁性纳米粒子。用乙醇和水各洗三次后，加入20 mL去离子水定量，4 ℃保存。

（2）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备：取含有50 mg Fe₃O₄磁性纳米粒子的2 mL去离子水至三颈烧瓶中，加入60 mL无水乙醇和4 mL 去离子水，超声处理15 min使之分散均匀；加入3 mL氨水，再次超声处理15 min；量取15 mL无水乙醇倒入小烧杯中， 加入300 μL 正硅酸乙酯，混合均匀后缓慢加入三颈烧瓶中，继续超声处理90 min。反应结束后，将反应液全部转移到烧杯中，磁分离去上清，所得磁性纳米粒子用乙醇和去离子水分别洗3次，即得到包覆SiO₂层的磁性纳米粒子，记作MSP。50 °C干燥备用。

所得产物通过透射电子显微镜（TEM）进行表征。图3为Fe₃O₄（a）、MSP（b）的透射电镜图。从图3中可以清晰地观察到Fe₃O₄磁性纳米粒子的平均粒径为185 nm，二氧化硅包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子由磁核和一层厚度约30 nm的SiO₂壳组成，外表面变化明显，粒径为245nm。结果表明，磁硅纳米粒子的制备是成功的且具有良好的形貌特征。

通过物理性质测量系统进行表征。图4为Fe₃O₄、MSP的磁滞回曲线。两种微球的磁滞回线都显示出典型的超顺磁性，Fe₃O₄核的最大饱和磁化值为47.8 emu/g，在包覆一层二氧化硅壳形成磁硅纳米粒子后，该值降至38.9 emu/g。即使涂层改性降低了磁矩，MSP的磁性仍然足够强，能够通过外部磁场快速分离。

2、光交联分子固定：

（1）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的巯基修饰：称取200 mg干燥的MSP置于40 mL离心管中，加入适量甲醇。超声使之均匀分散。磁分离去上清，分次加入共40 mL的甲醇，使之MSP全部转移入100 mL三颈烧瓶中并产生均匀悬浮液；随后加入4 mL氨水，超声10 min。再逐滴加入1.2 mL 3-巯基丙基三乙氧基硅烷(MPTES)超声10 min。在机械搅拌下室温避光反应24小时，以获得巯基官能化的MSP (MSP-SH）。借助磁铁收集粒子，所得产物用甲醇和去离子水清洗，然后60°C干燥以供进一步使用。

（2）MSP-SS-Py的制备：称取MSP-SH 100 mg，加入适量甲醇超声使之均匀分散，然后磁分离去除上清。再称取二硫二吡啶300 mg溶解于5 mL甲醇，加入到MSP-SH中，该混合物在摇床上避光室温振荡12 h。反应结束后，通过磁分离获得的产物用甲醇洗6次，即为MSP-SS-Py。

（3）MSP-SS-MPA的制备：将1.5 mL巯基丙酸（MPA）添加到含有100 mg MSP-SS-Py的甲醇溶液（5 mL）中。混合液在室温下避光振荡24小时。通过磁分离收集所得产物并用甲醇洗涤6次。

（4）MSP-SS-MPA的羧基活化： 375 mg EDC∙HCl和375 mg NHS共溶于20 mL DMF中，然后加入100mg MSP-SS-MPA。在室温下摇动混合物8小时。收集NHS活化的MSP，并用DMF洗涤3次。

（5）光交联分子的共价固定：100 mg MSP-SS-MPA-NHS通过三倍体积的70，30%丙酮和100 mM HEPES（pH 8.3）逐步洗涤从有机溶剂转移到水相中。在室温下，将30 mg 4-[3-（三氟甲基）-3H-二嗪-3-基]苄胺（TDBH）与NHS活化的MSP在100 mM HEPES（pH 8.3，10 mL）中偶联12 h，然后分别用水和甲醇洗涤3次，得到光交联分子共价固定的粒子MSP-SS-MPA-TDBH。

本发明通过傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）进行表征。图5为Fe₃O₄（a）、MSP（b）、MSP-SH（c）、MSP-SS-MPA（d）的FTIR图谱。从图中可以看到巯基修饰的磁硅纳米粒子的红外图谱中出现SH基团（2550cm^-1）对应的信号，并且在2929cm^-1处出现的清晰信号属于MPTES亚甲基C-H的伸缩振动，表明3-MPTES已成功修饰到材料表面，成功合成了MSP-SH。两次巯基−二硫交换反应后与MSP-SH相比，MSP-SS-MPA中-SH信号消失且观察到一个新的信号：1713 cm^-1出现的尖锐吸收峰属于羧基的伸缩振动，证明纳米粒子上存在羧基。结果证明了MSP-SS-MPA材料的成功构建。

所得产物通过X射线光电子能谱（XPS）进行表征。图6为MSP-SS-MPA（a）、MSP-SS-MPA-TDBH（b）的XPS图谱。图中可以看出通过酰胺缩合反应将4-[3-（三氟甲基）-3H-二嗪-3-基]苄胺引入纳米材料表面后，对材料的XPS分析中出现F元素和N元素的信号，结果表明TDBH修饰成功。

3、通过光交联固定生物活性小分子配体

（1）通过光交联固定生物活性小分子：将5 mg/mL的AEBSA-甲醇溶液（1 mL）加入到10 mg MSP-SS-MPA-TDBH中，然后混合1 h。涂布在玻璃板上，挥干溶剂后在上方距离2 cm处通过365 nm紫外线照射20 min交联。然后将材料洗涤并用甲醇和水分别洗涤三次即得二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA。

所得产物通过超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）进行表征。图7为DTT断裂MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA的二硫键后所得上清液的质谱色谱图。观察到一个与预期衍生物即去质子化MPA-TDBH-AEBSA分子量相对应的色谱峰。除主峰外的其他杂峰的出现可能是由于光交联插入位置的随机性导致断键产物是分子量相同但极性不同的分子的混合物，在色谱中体现为不同的出峰时间。结果表明通过光交联固定小分子配体合成MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA成功。

实施例2

本实施例的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备方法，步骤为：

1、磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备步骤：

（1）四氧化三铁（Fe₃O₄）磁性纳米粒子的制备：在100 mL干燥锥形瓶中加入40 mL乙二醇和0.5 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐，封口，加热条件下磁力搅拌至溶液澄清透明。冷却至室温后，称取1.08 g FeCl₃∙6H₂O加入上述溶液中搅拌20 min。称取预先干燥的无水乙酸钠1 g 加入锥形瓶中，继续搅拌至完全溶解。取出磁子，将锥形瓶中的液体转移至高温高压反应釜中，200 °C反应10 h。反应结束后，自然冷却过夜至室温，釜中所得黑色材料即为Fe₃O₄磁性纳米粒子。用乙醇和水各洗三次后，加入20mL去离子水定量，4 ℃保存。

（2）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备：取含有50 mg Fe₃O₄磁性纳米粒子的去离子水至三颈烧瓶中，加入60 mL无水乙醇和4 mL 去离子水，超声处理15 min使之分散均匀；加入3 mL氨水，再次超声处理15 min；量取15 mL无水乙醇倒入小烧杯中， 加入200 μL 正硅酸乙酯，混合均匀后缓慢加入三颈烧瓶中，继续超声处理90 min。反应结束后，将反应液全部转移到烧杯中，磁分离去上清，所得磁性纳米粒子用乙醇和去离子水分别洗3次，即得到包覆SiO₂层的磁性纳米粒子，记作MSP。50 °C干燥备用。

2、光交联分子固定

（1）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的巯基修饰：称取200 mg干燥的MSP置于40 mL离心管中，加入适量甲醇。超声使之均匀分散。磁分离去上清，分次加入共40 mL的甲醇，使之MSP全部转移入100 mL三颈烧瓶中并产生均匀悬浮液；随后4 mL氨水，超声10 min。再逐滴加入0.6 mL 3-巯基丙基三乙氧基硅烷超声10 min。在机械搅拌下室温避光反应24小时，以获得巯基官能化的MSP (MSP-SH）。借助磁铁收集粒子，所得产物用甲醇和去离子水清洗，然后60°C干燥以供进一步使用。

（2）MSP-SS-Py的制备：称取MSP-SH 100 mg，加入适量甲醇超声使之均匀分散，然后磁分离去除上清。再称取二硫二吡啶200 mg溶解于5 mL甲醇，加入到MSP-SH中，该混合物在摇床上避光室温振荡12 h。反应结束后，通过磁分离获得的产物用甲醇洗6次，即为MSP-SS-Py。

（3）MSP-SS-MPA的制备：将1 mL巯基丙酸（MPA）添加到含有100 mg MSP-SS-Py 的甲醇溶液（5 mL）中。混合液在室温下避光振荡24小时。通过磁分离收集所得产物并用甲醇洗涤6次。

（4）MSP-SS-MPA的羧基活化： 200 mg EDC∙HCl和200 mg NHS共溶于20 mL DMF中，然后加入100mg MSP-SS-MPA。在室温下摇动混合物8小时。收集NHS活化的MSP，并用DMF洗涤3次。

（5）光交联分子的共价固定：100 mg MSP-SS-MPA-NHS通过三倍体积的70，30%丙酮和100 mM HEPES（pH 8.3）逐步洗涤从有机溶剂转移到水相中。在室温下，将40 mg 4-[3-（三氟甲基）-3H-二嗪-3-基]苄胺（TDBH）与NHS活化的MSP在100 mM HEPES（pH 8.3，10 mL）中偶联12 h，然后分别用水和甲醇洗涤3次，得到光交联分子共价固定的粒子MSP-SS-MPA-TDBH。

3、通过光交联固定生物活性小分子配体的制备方法

通过光交联固定生物活性小分子：将3 mg/mL的AEBSA-甲醇溶液（1 mL）加入到10mg MSP-SS-MPA-TDBH中 ，然后混合1 h。涂布在玻璃板上，挥干溶剂后在上方距离2 cm处通过365 nm紫外线照射20 min交联。然后将材料洗涤并用甲醇和水分别洗涤三次即得二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针 MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA。

实施例3

本实施例的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备方法，步骤为：

1、磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备：

（1）四氧化三铁（Fe₃O₄）磁性纳米粒子的制备：在100 mL干燥锥形瓶中加入40 mL乙二醇和1.5 g聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐，封口，加热条件下磁力搅拌至溶液澄清透明。冷却至室温后，称取1.08 g FeCl₃∙6H₂O加入上述溶液中搅拌20 min。称取预先干燥的无水乙酸钠5 g 加入锥形瓶中，继续搅拌至完全溶解。取出磁子，将锥形瓶中的液体转移至高温高压反应釜中，200 ℃反应10 h。反应结束后，自然冷却过夜至室温，釜中所得黑色材料即为Fe₃O₄磁性纳米粒子。用乙醇和水各洗三次后，加入20mL去离子水定量，4 ℃保存。

（2）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的制备：取含有50 mg Fe₃O₄磁性纳米粒子的去离子水至三颈烧瓶中，加入60 mL无水乙醇和4 mL 去离子水，超声处理15 min使之分散均匀；加入3 mL氨水，再次超声处理15 min；量取15 mL无水乙醇倒入小烧杯中， 加入400 μL 正硅酸乙酯，混合均匀后缓慢加入三颈烧瓶中，继续超声处理90 min。反应结束后，将反应液全部转移到烧杯中，磁分离去上清，所得磁性纳米粒子用乙醇和去离子水分别洗3次，即得到包覆SiO₂层的磁性纳米粒子，记作MSP。50 °C干燥备用。

2、光交联分子固定

（1）磁性二氧化硅纳米粒子（MSP）的巯基修饰：称取200 mg干燥的MSP置于40 mL离心管中，加入适量甲醇。超声使之均匀分散。磁分离去上清，分次加入共40 mL的甲醇，使之MSP全部转移入100 mL三颈烧瓶中并产生均匀悬浮液；随后4 mL氨水，超声10 min。再逐滴加入1.8 mL 3-巯基丙基三乙氧基硅烷超声10 min。在机械搅拌下室温避光反应24小时，以获得巯基官能化的MSP (MSP-SH）。借助磁铁收集粒子，所得产物用甲醇和去离子水清洗，然后60°C干燥以供进一步使用。

（2）MSP-SS-Py 的制备：称取MSP-SH 100 mg，加入适量甲醇超声使之均匀分散，然后磁分离去除上清。再称取二硫二吡啶 400 mg溶解于5 mL甲醇，加入到MSP-SH中，该混合物在摇床上避光室温振荡12 h。反应结束后，通过磁分离获得的产物用甲醇洗6次，即为MSP-SS-Py。

（3）MSP-SS-MPA 的制备：将2 mL巯基丙酸（MPA）添加到含有100 mg MSP-SS-Py 的甲醇溶液（5 mL）中。混合液在室温下避光振荡24小时。通过磁分离收集所得产物并用甲醇洗涤6次。

（4）MSP-SS-MPA的羧基活化：500 mg EDC∙HCl和500 mg NHS共溶于20 mL DMF中，然后加入100mg MSP-SS-MPA。在室温下摇动混合物8小时。收集NHS活化的MSP，并用DMF洗涤3次。

（5）光交联分子的共价固定：100 mg MSP-SS-MPA-NHS通过三倍体积的70，30%丙酮水溶液和100 mM HEPES（pH 8.3）逐步洗涤从有机溶剂转移到水相中。在室温下，将50 mg4-[3-（三氟甲基）-3H-二嗪-3-基]苄胺（TDBH）与NHS活化的MSP在100 mM HEPES（pH 8.3，10mL）中偶联12 h，然后分别用水和甲醇洗涤3次，得到光交联分子共价固定的粒子MSP-SS-MPA-TDBH。

3、通过光交联固定生物活性小分子配体的制备方法，步骤为：

通过光交联固定生物活性小分子：将7 mg/mL的AEBSA-甲醇溶液（1 mL）加入到10mg MSP-SS-MPA-TDBH中 ，然后混合1 h。涂布在玻璃板上，挥干溶剂后在上方距离2 cm处通过365 nm紫外线照射30 min交联。然后将材料洗涤并用甲醇和水分别洗涤三次即得二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针 MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA。

应用例

用实施例制备的MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA进行AEBSA对CA2的靶点识别，如图2所示：

采集正常志愿者血液于内部涂有枸橼酸钠的采血管中，3500 rpm离心20 min后除去血浆和血沉棕黄层，所得红细胞用7倍体积的RIPA裂解液溶血。所得裂解物在10000 rpm和4°C下离心30分钟，取上层红细胞裂解液用于内源性CA2的亲和纯化过程。将红细胞裂解液用结合缓冲液稀释至8×，加入60 mg MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA在温和振摇下孵育2 h。之后，通过磁铁分离收集粒子，并依次用结合缓冲液、洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II和去离子水各洗涤5次；其中（1）结合缓冲液为含有150 mM NaCl的20 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）；（2）洗涤缓冲液I为含有500 mM NaCl的20 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）；（3）洗涤缓冲液II为含有0.1%吐温-20和500 mM NaCl的20 mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）。

对于随后的蛋白质洗脱，将材料分为三等份，其中第一份加入20 mM DTT-水溶液（400 μL）、第二份加入20 mM PB缓冲液（pH=7.4，400 μL），同步孵育3 h。然后使用10 kDa超滤离心管（Amicon-Ultra-15）将磁分离获得的上清液浓缩至∼40 μL，在浓缩上清中加入10μL SDS上样缓冲液，混合均匀并在100 ℃下煮沸5分钟。孵育洗涤后的第三份材料加入50μL1:4去离子水稀释的SDS上样缓冲液并在100 ℃下煮沸5分钟，然后磁分离取得上清液。所有变性的上清液样品进行SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色液可视化；

实验结果见图8，一个明显∼29 kDa（与标准CA分子量一致）的条带存在于DTT处理的上清液泳道（Lane 5），但在对照组（Lane 6）中不存在，表明从RBC裂解液中特异性捕获并释放CA2。与珠子上残留的非特异性结合蛋白（Lane 4）相比，需要通过质谱鉴定的条带大大减少，这明显降低了的样品的复杂性，并且提高了鉴定结果的准确性。结果证实MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA在生物样品中可以捕获CA并特异性释放CA。

为了确定可视化条带确实对应于靶蛋白，从考马斯亮蓝染色凝胶中切下目标的条带，并根据说明书中描述的程序使用Thermo-Scientific Easype Mini MS样品制备试剂盒进行凝胶内消化。LC-Nano spray ESI-MS分析通过超高效液相系统EASY-nLC 1200与超高分辨三合一质谱仪Orbitrap Fusion Lumos联合进行。通过Thermo Proteome Discoverer2.4.1.15对LC-MS/MS分析得到的片段谱进行处理，并对添加了胰蛋白酶序列的Uniprot人蛋白质组UP000005640 （74788 个序列条目）进行检索。

表1凝胶内胰蛋白酶消化和LC-MS/MS分析后鉴定的CA2肽

*代表非唯一肽

如表1所示，从图8指示条带中检测到CA2且序列覆盖率为41 %，识别到10个肽段，包括8个唯一肽。基于MS结果，我们得出结论，AEBSA修饰的二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针对CA2的亲和捕获可以与MS分析结合起来用于实际应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.二硫键介导的光交联磁性二氧化硅亲和探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：以磁性二氧化硅纳米粒子为基质，在磁硅纳米粒子表面引入二硫键连接器后通过二硫键连接器共价固定光交联分子，然后通过光交联固定生物活性小分子配体。

2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性二氧化硅纳米粒子的制备方法为：将乙二醇、聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐、FeCl₃∙6H₂O、无水乙酸钠搅拌至完全溶解，经高温高压反应得Fe₃O₄磁性纳米粒子；然后在超声条件下依次加入无水乙醇、去离子水、氨水和正硅酸乙酯，反应结束后即得包覆SiO₂层的磁性纳米粒子，即Fe₃O₄@SiO₂ 磁硅纳米粒子，记为MSP。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：每40 mL乙二醇中聚（4-苯乙烯磺酸-共聚-马来酸）钠盐的添加量为0.5-1.5g、FeCl₃∙6H₂O的添加量为1.08 g、无水乙酸钠的添加量为1-5 g；以50 mg Fe₃O₄磁性纳米粒子为基准，正硅酸乙酯的添加量为200-400 μL。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述共价固定光交联分子的制备方法为：

（1）配置MSP的甲醇溶液，超声条件下加入氨水和3-巯基丙基三乙氧基硅烷，避光搅拌反应至完全，经磁分离收集产物，清洗后即得巯基官能化的MSP-SH；

（2）向步骤（1）收集的MSP-SH中加入二硫二吡啶的甲醇溶液，经避光振荡反应至完全，经磁分离、洗涤得MSP-SS-Py；

（3）将MPA添加到MSP-SS-Py的甲醇溶液中，室温避光振荡反应后，经磁分离收集粗产物，经洗涤得二硫键连接器和MPA功能化的磁性二氧化硅纳米粒子MSP-SS-MPA；

（4）将EDC∙HCl和NHS共溶于DMF中，然后加入步骤（3）的MSP-SS-MPA，室温条件下摇动混合至反应完全，然后收集NHS活化的MSP-SS-MPA，并用DMF洗涤得到MSP-SS-MPA-NHS；

（5）步骤（4）的MSP-SS-MPA-NHS依次经过体积比为70%的丙酮-水溶液、体积比为30%的丙酮-水溶液、pH=8.3 100 mM HEPES洗涤，从有机溶剂转移到水相中，室温下将TDBH与步骤（4）的MSP-SS-MPA-NHS在pH=8.3 100 mM HEPES中进行偶联，经洗涤后得MSP-SS-MPA-TDBH。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中每200 mg MSP中添加0.6-1.8 mL 3-巯基丙基三乙氧基硅烷，步骤（2）中MSP-SH和二硫二吡啶的质量比为1:（2-4）。

6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中每100 mg MSP-SS-Py添加1-2 mL MPA；步骤（4）中每100 mg MSP-SS-MPA添加200-500 mg 的EDC∙HCl和200-500mg 的NHS；步骤（5）中MSP-SS-MPA-NHS和TDBH的质量比为1：（0.3-0.5）。

7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述光交联固定生物活性小分子配体的步骤为：将AEBSA溶解于甲醇中，再加入到MSP-SS-MPA-TDBH中，混合后涂布在玻璃板上，溶剂挥发后在玻璃板上方利用365 nm紫外线照射进行交联，再经甲醇和水分别洗涤即得亲和探针MSP-SS-MPA-TDBH-AEBSA；其中MSP-SS-MPA-TDBH与AEBSA的质量比为1：（0.3-0.7），交联时间为20-30 min。

8.利用权利要求1-3、5-7任一项所述的方法制备的光交联磁性二氧化硅亲和探针。

9.权利要求8所述的光交联磁性二氧化硅亲和探针在生物活性小分子的靶点识别中应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，识别碳酸酐酶2的步骤为：

a. 将光交联磁性二氧化硅亲和探针与待测蛋白样品进行孵育，然后通过广泛洗涤除去与光交联磁性二氧化硅亲和探针结合不紧密的非特异性结合蛋白；

b. 洗涤后用DTT或TCEP打断二硫键来释放与AEBSA结合的蛋白，经SDS-PAGE并用考染显影得到蛋白条带；

c. 步骤b的蛋白条带经胰蛋白酶消化后通过MS/MS分析鉴定所得肽进而鉴定是否为靶蛋白碳酸酐酶2。

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